实验一培养基配制精.ppt

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1、实验一培养基配制第1页，本讲稿共10页v实验一 培养基的配制及其灭菌v实验二 外植体灭菌及其初代培养物的建立第2页，本讲稿共10页实验一 培养基配制及其灭菌一、实验目的了解培养基制备方法及灭菌技术。二、实验原理培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似生物体内生存的营养环境。一般常用MS培养基，无机盐浓度较高，能满足组织快速生长的需求。为减少称量的工作量和误差，一般先配制培养基的各种母液，然后按需要量加入。三、实验材料1、实验药品2、实验用具四、实验步骤1、MS培养基母液的配制（1）大量元素母液（母液1）N、P、K、Ca、S、Mg（2）微量元素母液（母液2）Mn

2、、B、Zn、Cu、Mo、Cl、Ni（3）鉄盐母液（母液3）Fe（4）有机物质母液（母液4）NAA NAA、6-BA 6-BA、GA3GA3第3页，本讲稿共10页MS培养基配制表培养基配制表母液母液化合物化合物含量（终浓度）含量（终浓度）mg/L母液母液称量（称量（mg）体积（体积（ml）吸取量吸取量（ml/L）1号号NH4NO3KNO3KH2PO4MgSO4.7H2OCaCl2.2H2O1650190017037044082509500850185022005001002号号ZnSO4.7H2OMnSO4.4H2OH3BO3NaMoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2OKI8.

3、622.36.20.250.0250.0250.838602230620252.52.5831000103号号Na2EDTAFeSO4.7H2O37.2527.85372.5278.5100104号号盐酸硫胺素盐酸硫胺素VB1盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 VB6 甘氨酸甘氨酸烟酸（烟酸（VB3）肌醇肌醇0.40.520.51004520510001005第4页，本讲稿共10页2、植物生长调节物质的配制母液母液含量（终浓度）含量（终浓度）mg/L母液母液称量（称量（mg）体积（体积（ml）吸取量吸取量（ml/L）NAA2210001006-BA20210010GA310550075配制方法：配制方法：N

4、AA：称：称2 NAA，加少量，加少量95%酒精溶解，再加水定容至酒精溶解，再加水定容至1000 ml。6-BA：称：称2的的6-BA，加少量，加少量1mol/L的的NaOH溶解，再加水定容至溶解，再加水定容至100 ml。GA3：称：称5，加水定容至加水定容至500ml500ml。第5页，本讲稿共10页3、MS固体培养基的配制、分装和灭菌固体培养基的配制、分装和灭菌（1）取一只）取一只1L烧杯，放入约烧杯，放入约500mL蒸馏水，依次加入母液蒸馏水，依次加入母液1（100mL）、母液）、母液2（10mL）、母液）、母液3（10mL）和母液）和母液4（5mL），并不断搅拌），并不断搅拌。（本实

5、验。（本实验2L，先配先配1L，再配，再配1L）（2）加入植物生长调节物质（）加入植物生长调节物质（NAA:100ml,6-BA:10ml,GA3:75ml）和）和30g蔗糖，待蔗糖，待蔗糖溶解后加蒸馏水定容至蔗糖溶解后加蒸馏水定容至1L。（3）加入琼脂（）加入琼脂（0.6g/L），加热溶解。），加热溶解。（5）调整）调整pH6.5。（6）将培养基分装到锥形瓶中，每瓶约）将培养基分装到锥形瓶中，每瓶约300mL.（7）灭菌。放入高压蒸汽灭菌锅中，）灭菌。放入高压蒸汽灭菌锅中，121、0.105Pa灭菌灭菌15min。（8）倒平板。所倒培养基约占培养皿的）倒平板。所倒培养基约占培养皿的1/3。第

6、6页，本讲稿共10页五、思考题1、培养基的各种成分在植物体内的生理作用有哪些？2、使用高压灭菌锅在培养基灭菌时应注意哪些问题？第7页，本讲稿共10页实验二 外植体灭菌及其初代培养物的建立一、实验目的通过外植体灭菌及接种等无菌操作训练，掌握植物组织培养材料灭菌的基本方法和无菌操作技术，建立初代无菌培养体系。二、实验原理选取的外植体都不同程度地带有各种微生物，根据实验材料的特点要进行相应的灭菌处理。然后接种到培养基上放入培养室中培养，是之生长，就可以建立起初代培养物的无菌体系。三、实验材料和用具材料：5种草的绿色叶片。第8页，本讲稿共10页四、实验步骤四、实验步骤1、用、用75%的酒精擦拭干净，将

7、剪刀和镊子浸入的酒精擦拭干净，将剪刀和镊子浸入75%的酒精中。的酒精中。2、将外植体（绿色草叶）置烧杯中，用水冲洗干净。放入、将外植体（绿色草叶）置烧杯中，用水冲洗干净。放入75%的的酒精中灭菌酒精中灭菌30S（不断搅拌），倒掉酒精，用无菌水冲洗（不断搅拌），倒掉酒精，用无菌水冲洗3次后，次后，再放入再放入2%的次氯酸钠溶液中灭菌的次氯酸钠溶液中灭菌15min。3、将次氯酸钠溶液倒掉，用无菌水冲洗材料、将次氯酸钠溶液倒掉，用无菌水冲洗材料3-5次。用镊子取出次。用镊子取出无菌滤纸，取出叶片放入无菌滤纸上，用镊子和剪刀对叶片进行无菌滤纸，取出叶片放入无菌滤纸上，用镊子和剪刀对叶片进行分割，切成分

8、割，切成0.5x 0.5左右。左右。4、打开培养皿盖子，开口靠近酒精灯、打开培养皿盖子，开口靠近酒精灯2 左右，将切碎的叶片接左右，将切碎的叶片接种到培养基中（每个培养基接种种到培养基中（每个培养基接种10片），盖上盖子。标记植物片），盖上盖子。标记植物材料名称、接种日期和接种人。材料名称、接种日期和接种人。5、接种后的植物材料放入具有控制温度、光照和湿度等条件的培养箱、接种后的植物材料放入具有控制温度、光照和湿度等条件的培养箱中培养，建立初代无菌培养体系。中培养，建立初代无菌培养体系。第9页，本讲稿共10页五、实验报告及思考1、培养三天后观察实验结果，统计污染率。2、简述无菌操作的一般过程。第10页，本讲稿共10页