实验二蛋白质的颜色反应精.ppt

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1、实验二蛋白质的颜色反应第1页，本讲稿共17页 一一 实验目的实验目的 1.1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式。接方式。2.2.了解蛋白质的颜色反应原理。了解蛋白质的颜色反应原理。3.3.学习几种常用的鉴定蛋白质的方法。学习几种常用的鉴定蛋白质的方法。第2页，本讲稿共17页实验原理(一一)双缩脲反应双缩脲反应 1 1 原理原理 尿素加热至尿素加热至180180左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与碱性环境中能与cucu2+2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反结合生成紫红色化合物，此反应称为

2、双缩脲反应。应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。于蛋白质的定性或定量测定。一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。应的物质不一定都是蛋白质或多肽。第3页，本讲稿共17页 第4页，本讲稿共17页 (二二)茚三酮反应茚三酮反应 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有氨氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。基酸及一切

3、蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应十分灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法。该反应十分灵敏，是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成COCO2 2、NHNH3 3和醛，和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原性茚水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原性茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。第5页，本讲稿共17页加热加热第6页，本讲稿共17页第7页，本讲稿共17页（三）黄色反应（三）黄色反应 在在蛋蛋白白质质分分子子

4、中中，具具有有芳芳香香环环的的氨氨基基酸酸(如如酪酪氨氨酸酸，色色氨氨酸酸等等)残残基基上上的的苯苯环环经经硝硝酸酸作作用用可可生生成成黄黄色色的的硝硝基基化化合合物物，在在碱碱性性条条件件下生成物可转变为深橙色的的硝醌衍生物，反应为：下生成物可转变为深橙色的的硝醌衍生物，反应为：第8页，本讲稿共17页 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以都多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以都会发生黄色反应。苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓会发生黄色反应。苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓硫酸后才能够发生黄色反应。硫酸后才能够发生黄色反应。第9页，本讲稿共17页 (四四)考马斯亮蓝反应考马斯亮蓝反应 考马斯亮蓝考

5、马斯亮蓝G G250250具有红色和蓝色两种色调。在酸具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色：当它与蛋白性溶液中，其以游离态存在呈棕红色：当它与蛋白质通过疏水作用结合后变成蓝色。质通过疏水作用结合后变成蓝色。它染色灵敏度高。反应速度快，约在它染色灵敏度高。反应速度快，约在2 2分钟左右分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。时间达到平衡，在室温一小时内稳定。在在0.01-1.0 mg0.01-1.0 mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与蛋白质范围内，蛋白质浓度与A A595595nmnm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。第10页，本讲稿共

6、17页实验试剂实验试剂v1 1 蛋白蛋白质溶液溶液 500500毫升；毫升；v2 0.12 0.1茚三三酮水溶液水溶液250250毫升；毫升；v3 3 浓硝酸；硝酸；v4 10%NaOH4 10%NaOH溶液溶液 250250毫升；毫升；v5 5 尿素；尿素；v6 16 1硫酸硫酸铜溶液溶液 250250毫升；毫升；v7 0.017 0.01考考马斯亮斯亮蓝染液染液 100100毫升毫升第11页，本讲稿共17页实验操作实验操作（1 1）取取少少量量尿尿素素结结晶晶，放放在在干干燥燥试试管管中中。用用微微火火加加热热使使尿尿素素熔熔化化。熔熔化化的的尿尿素素开开始始硬硬化化时时，停停止止加加热热

7、，尿尿素素放放出出氨氨，形形成成双双缩缩脲脲。冷冷后后，加加1010氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液约约1 1毫毫升升，振振荡荡混混匀匀，再再加加1 1硫硫酸酸铜铜溶溶液液1 1滴滴，再再振荡。观察出现的粉红颜色。振荡。观察出现的粉红颜色。（2 2）向向另另一一试试管管加加卵卵清清蛋蛋白白溶溶液液约约1010滴滴和和1010氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液约约1010滴滴，摇摇匀匀，再再加加1 1硫硫酸酸铜铜溶溶液液2 2滴滴，随随加加随随摇摇，观观察察紫紫玫玫瑰瑰色色的出现。的出现。第12页，本讲稿共17页 (3)(3)取取试试管管1 1支支，加加入入蛋蛋白白质质溶溶液液1ml1ml，然然后后各各加加入入0

8、.10.1茚茚三三酮酮水水溶溶液液5 5滴滴，混混匀匀后后于于沸沸水水浴浴中中加加热热1-21-2分分钟钟，观观察察颜色由有粉色变紫红色再变蓝。颜色由有粉色变紫红色再变蓝。(4)(4)于于一一试试管管内内，置置蛋蛋白白质质溶溶液液1010滴滴，浓浓硝硝酸酸3-43-4滴滴，微微火火加加热热，冷冷却却后后于于室室温温下下逐逐滴滴加加入入10%NaOH10%NaOH溶溶液液5 5滴滴，观观察察颜颜色色变化。变化。第13页，本讲稿共17页 (5)(5)操作方法操作方法管号管号蛋白蛋白质质溶液溶液（mlml）蒸蒸馏馏水水（mlml）考考马马斯亮斯亮蓝蓝染液染液（滴）（滴）1 10 02 22 22 21 11 12 2第14页，本讲稿共17页注意事项注意事项v1 1试管加热时，试管一般与桌面成试管加热时，试管一般与桌面成4545角，加热时切不角，加热时切不可对着任何人可对着任何人.要用试管夹夹住试管。要用试管夹夹住试管。v2双缩脲反应实验中，硫酸铜溶液不能滴加过量。双缩脲反应实验中，硫酸铜溶液不能滴加过量。第15页，本讲稿共17页思考题思考题v1 1 请列列举几种几种鉴别蛋白蛋白质的方法？的方法？v2 2 通通过实验谈一一谈你你对蛋白蛋白质的的颜色反色反应有有何何认识？第16页，本讲稿共17页 第17页，本讲稿共17页