实验八微生物的接种技术及分离纯化精.ppt

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1、实验八微生物的接种技术及分离纯化第1页，本讲稿共21页1 1掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本操作技术。的基本操作技术。2 2学习平板菌落计数的基本原理和方法学习平板菌落计数的基本原理和方法 一一、目的要求、目的要求第2页，本讲稿共21页实验原理实验原理1.1.从从混混杂杂的的微微生生物物群群体体中中获获得得只只含含有有某某一一种种或或某某一一株株微微生生物的过程称为微生物的分离与纯化。物的过程称为微生物的分离与纯化。本实验采用平板分离法：本实验采用平板分离法：1)1)选择合适的选择培养基。选择合适的选择培养基。2)2)通过稀释倒平板和平板划线等技术

2、得到单通过稀释倒平板和平板划线等技术得到单 个菌落。个菌落。2.2.平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，取一定平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，取一定量的稀释液接种在平板上，经过培养，平板上出现单个量的稀释液接种在平板上，经过培养，平板上出现单个菌落，即为一个菌落形成单位（菌落，即为一个菌落形成单位（colony-forming colony-forming units,cfuunits,cfu）。第3页，本讲稿共21页第4页，本讲稿共21页吸取稀释液吸取稀释液取一吸管，以无菌操作法分别吸取取一吸管，以无菌操作法分别吸取10105 5、10106 6、10107 7土壤稀释液土壤

3、稀释液0.1mL0.1mL，加在已制，加在已制好的平板培养基上好的平板培养基上。涂板涂板用玻璃刮刀将稀释液在培养基上充分混匀用玻璃刮刀将稀释液在培养基上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。铺平，倒置于恒温箱培养。计算出每克土壤中细菌的数量。计算出每克土壤中细菌的数量。即用某一培养皿内的菌落数乘以该培养皿即用某一培养皿内的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即得。接种液的稀释倍数即得。挑取单个菌落，进行划线分离挑取单个菌落，进行划线分离。微生物的分离微生物的分离平板涂布平板涂布法法第5页，本讲稿共21页第6页，本讲稿共21页微生物的分离微生物的分离平板倾注法平板倾注法吸取稀释液吸取稀释液取一吸管，以无

4、菌操作法分别吸取104、105、106土壤稀释液0.5-1mL0.5-1mL，加在空培养皿中。混和摇匀混和摇匀水平轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后倒置于恒温培养箱培养。计算出每克土壤中放线菌的数量。计算出每克土壤中放线菌的数量。挑取单个菌落，进行划线分离。挑取单个菌落，进行划线分离。第7页，本讲稿共21页微生物的分离微生物的分离平板划线法平板划线法制成平板。制成平板。凝固后，用接种环取相应的菌液一环（凝固后，用接种环取相应的菌液一环（101）在平板上划线。）在平板上划线。1.连续划线法：连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划将挑取有样品的接

5、种环在平板培养基表面作连续划线。完毕后，倒置于线。完毕后，倒置于28300C温室培养。温室培养。2.分区划线法：分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在环，先在培养基的一边作第一次平行划线培养基的一边作第一次平行划线34条，再转动培养皿约条，再转动培养皿约60度角，度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。盖上皿盖，倒置于温室培养。挑取单个菌落接种于

6、斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。到纯培养。第8页，本讲稿共21页第9页，本讲稿共21页第10页，本讲稿共21页实验材料实验材料样品样品：新鲜土壤。新鲜土壤。培养基：培养基：灭菌的淀粉琼脂培养基、灭菌的淀粉琼脂培养基、牛肉膏牛肉膏蛋白胨培养基蛋白胨培养基。无菌水：无菌水：带有玻璃珠装有带有玻璃珠装有99mL99mL无菌水三角无菌水三角瓶、装有瓶、装有4.5mL4.5mL无菌水的试管。无菌水的试管。其它：其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、电子天平、记号笔、接种环、酒精玻棒、电子天平

7、、记号笔、接种环、酒精灯、火柴。灯、火柴。第11页，本讲稿共21页实验步骤实验步骤1 1制制备备土土壤壤稀稀释释液液 称称取取土土样样1g1g，放放入入盛盛有有99ml99ml无无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇混匀。菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇混匀。2 21010倍倍梯梯度度稀稀释释 用用无无菌菌吸吸管管吸吸取取上上述述土土壤壤稀稀释释液液0.5ml0.5ml加加入入盛盛有有4.5ml4.5ml无无菌菌水水的的试试管管中中充充分分混混匀匀，然然后后再再用用无无菌菌吸吸管管从从此此试试管管中中吸吸取取0.5ml0.5ml加加入入盛盛有有4.5ml4.5ml无无菌菌水水的的另另一一支支试

8、试管管中中充充分分混混匀匀，以以次次类类推制成推制成1010-3-3、1010-4-4、1010-5-5、1010-6-6不同稀释度的溶液。不同稀释度的溶液。一、土壤中细菌的分离、纯化及菌落计数一、土壤中细菌的分离、纯化及菌落计数（6皿皿/组）组）第12页，本讲稿共21页第13页，本讲稿共21页3 3涂涂布布 选选择择3 3个个连连续续梯梯度度（1010-4 4、1010-5 5、1010-6 6），每每个个稀稀释释度度涂涂布布2 2个个平平板板，涂涂布布时时用用无无菌菌吸吸管管每每个个平平板滴加板滴加0.10.1mLmL，用无菌玻棒涂布均匀。用无菌玻棒涂布均匀。4 4培养培养 37 37倒置

9、培养过夜。倒置培养过夜。5 5计数并检验产胞外淀粉酶的菌株计数并检验产胞外淀粉酶的菌株 总总菌菌落落计计数数完完后后，将将平平板板内内滴滴加加1-2ml1-2ml卢卢戈戈氏氏碘碘液液，菌菌落落周周围围产产生生透透明明圈圈的的菌菌落落就就是是产产胞胞外外淀淀粉粉酶酶的的菌菌株株，观观察察并并计计数数第14页，本讲稿共21页二、划线分离 平板的制作平板的制作（牛肉膏蛋白胨培养基）（牛肉膏蛋白胨培养基）将将15ml15ml培养基无菌条件下倒平板，待其凝固后备用（培养基无菌条件下倒平板，待其凝固后备用（4 4皿皿/组）组）划线分离：划线分离：取枯草杆菌和金黄色葡萄球菌混合菌悬液一环，采用连取枯草杆菌和

10、金黄色葡萄球菌混合菌悬液一环，采用连续划线或分区划线的方法分离单菌落续划线或分区划线的方法分离单菌落第15页，本讲稿共21页（1 1）计算相同稀释度的平均菌落数）计算相同稀释度的平均菌落数有较大片菌苔生长时，弃用；以无片菌苔生长的平皿计数。有较大片菌苔生长时，弃用；以无片菌苔生长的平皿计数。若片菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，将此一半计若片菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，将此一半计数数22（2 2）选择平均菌落数在）选择平均菌落数在3030300300之间的平板之间的平板只有一个符合此范围时，以该平均菌落数乘稀释倍数。只有一个符合此范围时，以该平均菌落数乘稀释倍数。有两

11、个在有两个在3030300300间时，按两者菌落总数比值决定：比值小于间时，按两者菌落总数比值决定：比值小于2 2，取平均；比值大于取平均；比值大于2 2，取较小的菌落总数。，取较小的菌落总数。（3 3）所有菌落数均大于）所有菌落数均大于300300，取稀释度最高的平均菌落数乘稀释，取稀释度最高的平均菌落数乘稀释倍数。倍数。（4 4）所有菌落数均小于所有菌落数均小于3030，取稀释度最低的平均菌落数乘稀，取稀释度最低的平均菌落数乘稀释倍数。释倍数。（5 5）所有菌落数均不在所有菌落数均不在3030300300之间，以最接近之间，以最接近3030或或300300的平均的平均菌落数乘稀释倍数。菌落

12、数乘稀释倍数。菌落计数方法菌落计数方法 p207第16页，本讲稿共21页第17页，本讲稿共21页实验报告实验报告 1.1.计算土壤样品的细菌总数和产胞外淀粉酶计算土壤样品的细菌总数和产胞外淀粉酶的菌落数的菌落数 2.2.观察混合菌悬液的划线分离情况，并描述观察混合菌悬液的划线分离情况，并描述两种菌的菌落形态特征两种菌的菌落形态特征第18页，本讲稿共21页思思 考考 题题1、如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养物？请写出实验的主要步骤。P74(1)2、如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产高温蛋白酶的菌株，你将如何完成？请写出简明实验方案。P74(4)第19页，本讲稿共21页上次实验习题解答

13、上次实验习题解答1、为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行效正？P48(1)进行显微测量时，主要是利用效正后的目镜测微尺对物象进行测量。而物镜或目镜的实际放大倍数与标注的可能有误差，因此，更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行效正。第20页，本讲稿共21页2 2、某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌、某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计存活率，请设计1-21-2中可行的检测方法。中可行的检测方法。首先将干酵母粉稀释成一定的浓度，用血球计数板直接计数，统计总菌量，然后采用平板稀释法计数活菌量，两者的比值为活菌存活率。也可将干酵母粉稀释成一定的浓度，用分光光度计测出光密度值，再换算出总菌量，然后采用平板稀释法计数活菌量，两者的比值为活菌存活率 第21页，本讲稿共21页