血红蛋白的提取与分离ppt讲稿.ppt

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1、关于血红蛋白的提取与分离PPT第一页，讲稿共七十一页哦一、课题目标一、课题目标 本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。第二页，讲稿共七十一页哦二、课题重点与难点二、课题重点与难点课题重点：凝胶色谱法,电泳法的原理。课题难点(自学)：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。第三页，讲稿共七十一页哦思考思考1为什么要分离蛋白？为什么要分离蛋白？科研科研生产生产思考思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性

2、的差异，如根据蛋白质各种特性的差异，如分子分子的形状和大小的形状和大小、所带、所带电荷的性质电荷的性质和多少、和多少、溶解度溶解度、吸附性质吸附性质和对其他分子的和对其他分子的亲和力亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。等等，可以用来分离不同蛋白质。第四页，讲稿共七十一页哦什么是色谱法，什么是色谱法，它的用途是什么？它的用途是什么？利用混合物中各组分的理化生性质的不同利用混合物中各组分的理化生性质的不同（有哪些？），使各组分以不同程度分布（有哪些？），使各组分以不同程度分布到两相中的分离技术。到两相中的分离技术。叶绿素的分离。叶绿素的分离。第五页，讲稿共七十一页哦一、基础知识：一、基础知识：凝胶

3、色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）1、凝胶、凝胶一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由通道，由多糖类化合物多糖类化合物构成构成,如葡聚糖、琼脂如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）。糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）。2、凝胶色谱法的概念、凝胶色谱法的概念根据被分离的蛋白质根据被分离的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行蛋白质分离。来进行蛋白质分离。第六页，讲稿共七十一页哦第七页，讲稿共七十一页哦第八页，讲稿共七十一页哦第九页，讲稿共七十一页哦第十页，讲稿共七十一

4、页哦第十一页，讲稿共七十一页哦第十二页，讲稿共七十一页哦第十三页，讲稿共七十一页哦讨论:为什么小分子必须走空隙第十四页，讲稿共七十一页哦3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（胶内部的通道，路程（），移动速度（），移动速度（）；而）；而(）的蛋白质无法进）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（入凝胶内部的通道，只能在（）移）移动，路程（动，路程（），移动速度（），移动速度（），），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。分子质量较小分子质量较小较长较长较慢较

5、慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快第十五页，讲稿共七十一页哦第十六页，讲稿共七十一页哦课后思考课后思考:怎样选择交联度？怎样选择交联度？第十七页，讲稿共七十一页哦层析系统层析系统:每一部件的作用每一部件的作用第十八页，讲稿共七十一页哦思考思考:凝胶层析应该用那种柱子凝胶层析应该用那种柱子?第十九页，讲稿共七十一页哦电泳电泳1、概念：指带电粒子在电场的作用下发生、概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。迁移的过程。第二十页，讲稿共七十一页哦2、原理：许多重要的生物大分子，如（、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有）等都具有()在在()下，这些基团会带上

6、（下，这些基团会带上（）。在电场。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（的作用下，这些带电分子会向着与其（）电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分）电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（子（）以及分子本身的（）以及分子本身的（）、（）、（）的不同使带电分子产生不同）的不同使带电分子产生不同的（的（），从而实现样品中各种分子），从而实现样品中各种分子的分离。的分离。多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反的所带电荷相反的带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH第二十一页，讲稿共七十一页哦思考思考:电泳与凝胶层析驱动力的

7、电泳与凝胶层析驱动力的不同不同第二十二页，讲稿共七十一页哦聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-甲叉双甲叉双丙烯酰胺在引发剂丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵）和催化剂（四过硫酸铵）和催化剂（四甲基已二胺）的作用下甲基已二胺）的作用下聚合交联成的具有三聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。维网状结构的凝胶。3、分类、分类琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定（测定（）时，）时，通常用十二烷基硫酸钠通常用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳。胶电泳。蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量第二十

8、三页，讲稿共七十一页哦 为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入()()。SDSSDS能使蛋白质发生能使蛋白质发生完全变性完全变性。由几条。由几条肽链组成的蛋白质复合体在肽链组成的蛋白质复合体在SDSSDS的作用下会解聚成单条的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是肽链，因此测定的结果只是()。SDSSDS能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS-SDS复合物，复合物，SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率因而

9、掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于完全取决于()()。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带它所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。SDS单条肽链的分子量单条肽链的分子量分子的大小分子的大小第二十四页，讲稿共七十一页哦SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）polyacrylamidegelelectrophoresis 使使用用含含有有十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠（SDS）和和还还原原剂剂（通通常常为为巯巯基基乙乙醇醇）的的样样品品处处理理液液对对蛋蛋白白质质样样品品进

10、进行行处处理理（一一般般煮煮沸沸35分分钟钟），通通过过加加热热和和SDS可可以以使使蛋蛋白白质质变变性性，多多亚亚基基的的蛋蛋白白质质也也将将解解离离为为单单亚亚基基。同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还原）。同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还原）。经经过过这这样样处处理理的的样样品品中中的的肽肽链链都都是是处处于于无无二二硫硫键键连连接接的的，分分离离的的状状态态。由由于于SDS是是带带有有负负电电荷荷的的分分子子，同同时时它它有有一一个个长长的的疏疏水水尾尾巴巴，SDS通通过过疏疏水水尾尾巴巴与与肽肽链链中中的的氨氨基基酸酸的的疏疏水水侧侧链链结结合合，结结合合SD

11、S的的比比率率大大约约是是一一个个蛋蛋白白质质分分子子中中每每两两个个氨氨基基酸酸残残基基结结合合一一分子的分子的SDS。第二十五页，讲稿共七十一页哦第二十六页，讲稿共七十一页哦垂直板垂直板电泳装置电泳装置加样加样样品迁样品迁移方向移方向第二十七页，讲稿共七十一页哦电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶按分子大按分子大小分离小分离电泳方向电泳方向电泳电泳小分子小分子大分子大分子第二十八页，讲稿共七十一页哦夹在两块玻璃板

12、之夹在两块玻璃板之间的凝胶间的凝胶电泳缓电泳缓冲液冲液电泳缓电泳缓冲液冲液加在槽中的经加在槽中的经SDS处理的样品处理的样品分子量小分子量小分子量大分子量大电源电源第二十九页，讲稿共七十一页哦标准蛋白分子量标准蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝胶浓度下，多肽在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量多肽链分子量。相对迁移率相对迁移率第三十页，讲稿共七十一页哦电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片第三十一

13、页，讲稿共七十一页哦第三十二页，讲稿共七十一页哦聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子大得多大得多，只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳。只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，核酸分子本身含有大量的磷酸根，核酸核酸带负电荷带负电荷，在电场中向正极移动。溴化乙，在电场中向正极移动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下，啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下，发出橙红色荧光。根据荧光条带的粗细和发出橙红色荧光。根据荧光条带的粗细和分布的位置，可以用在对分布的位置，可以用在对PCR

14、扩增效果扩增效果的鉴定上。的鉴定上。说说明明第三十三页，讲稿共七十一页哦思考凝胶层析和凝胶层析和SDS-PAGESDS-PAGE的原理有的原理有那些相似性那些相似性第三十四页，讲稿共七十一页哦第三十五页，讲稿共七十一页哦二、实验操作二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理样品处理水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血血液液血浆血浆血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（）两个两个-肽链肽链两个两个-肽链肽链样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定90第三

15、十六页，讲稿共七十一页哦目的目的：去除（：去除（），以利于后续），以利于后续步骤的分离纯化。步骤的分离纯化。方法方法：（）离心（速度越高和离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（透明的（），将下），将下 每条肽链环绕（每条肽链环绕（），此基团），此基团可携带（可携带（）。血红蛋白因含）。血红蛋白因含有（有（）而呈红色。）而呈红色。一个亚铁血红素基团一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子一分子氧或一分子COCO2 2血红素血红素(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤

16、杂蛋白杂蛋白低速短时间低速短时间黄色血浆黄色血浆1.样品处理样品处理第三十七页，讲稿共七十一页哦层（层（）的红细胞液体倒入烧杯，）的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的（再加入五倍体积的（）（质量）（质量分数为分数为0.90.9的氯化钠溶液的氯化钠溶液），缓慢搅拌），缓慢搅拌10min10min，低速短时间离心，如此，低速短时间离心，如此重复洗涤重复洗涤（）次，直至上清液中没有（）次，直至上清液中没有（），表明红细胞已洗涤干净。），表明红细胞已洗涤干净。生理盐水生理盐水三三黄色黄色暗红色暗红色第三十八页，讲稿共七十一页哦(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放加（加（）到（）到（）体积，）体积，再加

17、再加40体积的（体积的（）（）（溶解细胞膜溶解细胞膜），置于（，置于（）上充分搅拌）上充分搅拌10分钟分钟（加速细胞破裂）（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以转移到离心管内，以2000r/min的速度的速度离心离心10min，试管中的溶液分为，试管中的溶液分为4层层:原血液原血液甲苯甲苯磁力搅拌器磁力搅拌器蒸馏水蒸馏水第三十九页，讲稿共七十一页哦第第1层（最上层）：层（最上层）：（）甲苯层）甲苯层第第2层（中上层）：层（中上层）：（）的沉淀层，的沉淀层，（）色薄层固体）色薄层固

18、体第第3层（中下层）：层（中下层）：（）的水溶液层的水溶液层（）的液体）的液体第第4层（最下层）：层（最下层）：其它杂质（其它杂质（）的沉淀层）的沉淀层无色透明无色透明脂溶性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色第四十页，讲稿共七十一页哦用滤纸用滤纸过滤过滤，除去脂溶性沉淀除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗层，于分液漏斗中静置片刻后，中静置片刻后，分出下层的红色分出下层的红色透明液体。透明液体。有机溶剂有机溶剂脂类物质脂类物质血红蛋白溶液血红蛋白溶液红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀第四十一页，讲稿共七十一页哦取取1mL的血红蛋白溶液装入（的血红蛋白溶液装入（）中，将透析袋放入

19、盛有）中，将透析袋放入盛有300mL的物质的物质的量浓度为的量浓度为20mmol/L的（的（）中，中，pH为（为（），透析），透析12小时。目的小时。目的是（是（）或）或用于更换样品中的（用于更换样品中的（）。）。透析袋一般用透析袋一般用硝酸纤维素硝酸纤维素（玻璃纸）（玻璃纸）制成。制成。除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质透析袋透析袋磷酸缓冲液磷酸缓冲液7.0缓冲液缓冲液(4)透析透析第四十二页，讲稿共七十一页哦2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作1）凝胶色谱柱的制作）凝胶色谱柱的制作取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，两端厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。需

20、用砂纸磨平。柱底部的制作：柱底部的制作：打孔打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头部 覆盖尼龙网覆盖尼龙网，再用，再用100100目目尼龙纱包好。尼龙纱包好。a a、选择合适的的橡皮塞，中间、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；打孔；b b、在橡皮塞上部切出锅底状的（、在橡皮塞上部切出锅底状的（），），在在0.5mL0.5mL的（的（）头部切下（）头部切下（）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。橡皮塞的凹穴底面。凹穴凹穴移液管移液管5cm5cm第四十三页，讲稿共七十一页哦 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹底塞中插入的玻璃

21、管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。蛋白质分离不彻底。第四十四页，讲稿共七十一页哦c.c.剪尼龙网小圆片覆盖在剪尼龙网小圆片覆盖在橡皮塞的凹橡皮塞的凹面面上，用上，用100目目的尼龙纱将橡皮塞的尼龙纱将橡皮塞上部上部包好，插到玻璃管一端。包好，插到玻璃管一端。d d、色谱柱下端用移液头部做、色谱柱下端用移液头部做出口部出口部位位，连接一细的，连接一细的尼龙管尼龙管，并用螺旋夹，并用螺旋夹控制尼龙管的控制尼龙管的打开与关闭打开与关闭，另一端放，另一端放入收集入收集色谱流出液色谱流出液的收集器内。的

22、收集器内。第四十五页，讲稿共七十一页哦安装其他附属结构。安装其他附属结构。顶塞的制作：顶塞的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞插入安装了玻璃管的橡皮塞组装：将上述三者按相应位置组装成一个组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体整体。第四十六页，讲稿共七十一页哦2）凝胶色谱柱填料的处理）凝胶色谱柱填料的处理（1 1）凝胶的选择：）凝胶的选择：（）（）（G-75G-75）“G”G”表示凝胶的表示凝胶的交联程度交联程度，膨胀程度，膨胀程度 及分离范围。及分离范围。7575表示凝胶的表示凝胶的得水值得水值，即每克凝胶，即每克凝胶 膨胀时吸水膨胀时吸水7.57.5克。克。（2 2）方法：）方法：配置凝胶悬浮

23、液：计算并称取一定量的凝配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（胶浸泡于（）中充分溶胀后，配成（）中充分溶胀后，配成（）。）。蒸馏水蒸馏水凝胶悬浮液凝胶悬浮液交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶第四十七页，讲稿共七十一页哦固定：将色谱柱垂直固定在支架上。固定：将色谱柱垂直固定在支架上。装填：装填：将将（）一次性的缓慢倒一次性的缓慢倒入（入（）内，装填时轻轻敲动色谱）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。柱，使凝胶填装均匀。（3）凝胶色谱柱的装填方法）凝胶色谱柱的装填方法凝胶悬浮液凝胶悬浮液色谱柱色谱柱注意：注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装

24、填凝胶柱时不能有气泡存粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。序，降低分离效果。第四十八页，讲稿共七十一页哦 你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？装填要紧密、均匀吗？凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；部，只能

25、分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成谱柱

26、内形成无效的空隙无效的空隙无效的空隙无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序搅乱洗脱液的流动次序搅乱洗脱液的流动次序搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。，影响分离的效果。第四十九页，讲稿共七十一页哦洗涤平衡洗涤平衡 装填完毕后，立即连接缓冲装填完毕后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约液洗脱瓶，在约()()高的高的操作压操作压下，用下，用300mL300mL的的20mmol/L的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡）充分洗涤平衡1212小时，小时，使凝胶装填紧密使凝胶装填紧密。50cm50

27、cm第五十页，讲稿共七十一页哦3 3）样品的加入与洗脱）样品的加入与洗脱加样前加样前打开下端流出口，打开下端流出口，使柱内凝胶面上的缓使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。胶面平齐，关闭出口。第五十一页，讲稿共七十一页哦加透析样品加透析样品3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱第五十二页，讲稿共七十一页哦调整缓冲液面调整缓冲液面：与凝胶面平齐。：与凝胶面平齐。滴加透析样品滴加透析样品：用吸管将：用吸管将1mL透析后透析后的样品加到色谱柱的顶端。的样品加到色谱柱的顶端。样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床：样品完全进入凝胶：样品完全进入凝胶层。层。洗脱洗脱：打开下端，

28、用磷酸缓冲液洗脱。：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱。收集收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每端时，用试管收集流出液，每5mL收收集一试管，连续收集。集一试管，连续收集。第五十三页，讲稿共七十一页哦3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做选做）判断纯化的蛋白质是否达到要求，需判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。要进行蛋白质的鉴定。血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观

29、观察颜色察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。过程非常直观，大大简化了实验操作。过程非常直观，大大简化了实验操作。过程非常直观，大大简化了实验操作。思考：思考：与其他真核细胞相比，红细胞有什么与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？什么意义？第五十四页，讲稿共七十一页哦3.SDS3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 鉴定

30、血红蛋白纯度鉴定血红蛋白纯度（1 1）试剂的配制）试剂的配制丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 用去离子水用去离子水配制配制29%29%（29 g/100 mL29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和，下同）的丙烯酰胺和1%1%的的N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液甲叉双丙烯酰胺的贮存液十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）用去离子水配成用去离子水配成10%10%的的贮存液，于室温保存。贮存液，于室温保存。用于制备分离胶和浓缩胶的用于制备分离胶和浓缩胶的TrisTris缓冲液缓冲液 TEMED TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由基：作用通过催化

31、过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。第五十五页，讲稿共七十一页哦用去离子水配制用去离子水配制10%10%过硫酸铵：作用提供驱动过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。溶液须配制新鲜液。TrisTris甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液 25 mmol/L Tris25 mmol/L Tris，250 250 mmol/L mmol/L 甘氨酸甘氨酸 (pH 8.3)(pH 8.3)，0.1%0.1%的的SDSSDS。样品处理液样品处理液 50 mmol/L Tri

32、sHCl(pH 6.8)50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇巯基苏糖醇)或用或用5%5%的巯基乙的巯基乙醇，醇，2%2%的的SDSSDS，0.1%0.1%的溴酚蓝，的溴酚蓝，10%10%的甘油。的甘油。染色液染色液 0.1%0.1%的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝R250R250，40%40%的甲醇，的甲醇，10%10%的冰醋酸的冰醋酸脱色液脱色液 10%10%的甲醇和的甲醇和10%10%的冰醋酸。的冰醋酸。第五十六页，讲稿共七十一页哦 由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经

33、毒性，并且容易被皮胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。风处进行。TEMEDTEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。性手套。第五十七页，讲稿共七十一页哦聚丙烯酰胺凝胶电泳装置聚丙烯酰胺凝胶电泳装置及其原理示意图及其原理示意图第五十八页，讲稿共七十一页哦 SDS-SDS-聚

34、丙烯酰胺聚丙烯酰胺分离胶制备分离胶制备1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板2 2）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶制备制备 用去离子水用去离子水4.6 mL4.6 mL，30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺2.7 mL2.7 mL，1.5mol1.5mol、pH 8.8pH 8.8的的TrisTris缓冲液缓冲液2.5 mL2.5 mL，10%10%的的SDS SDS 0.1 mL0.1 mL，10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.1 mL0.1 mL，TEMED 0.006mLTEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留混合均匀，

35、迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加梳子的齿长再加0.5 cm)0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高再在胶液面上小心注入一层水（约高23 mm23 mm），以），以阻止氧气进入凝胶溶液。阻止氧气进入凝胶溶液。（2 2）电泳方法步骤）电泳方法步骤第五十九页，讲稿共七十一页哦配制配制SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水去离子水2.7 mL2.7 mL，30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺0.67 mL0.67 mL，1.0 1.0 molmol、pH 6.8pH 6.8的的TrisTris

36、缓冲液缓冲液0.5 mL0.5 mL，10%10%的的SDS0.041 SDS0.041 mLmL，10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.04 mL0.04 mL，TEMED 0.004 mLTEMED 0.004 mL，混，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。分离胶聚合完全后（

37、约分离胶聚合完全后（约30 min30 min），倾出覆盖水层，），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。再用滤纸吸净残留水。3 3）样品处理）样品处理第六十页，讲稿共七十一页哦5)5)加样加样在电泳样品中按在电泳样品中按1111体积比加入样品处理液，在体积比加入样品处理液，在100 100 温度下加热温度下加热3 min3 min，以使蛋白质变性。，以使蛋白质变性。按顺序加样，加样量通常为按顺序加样，加样量通常为1025 L1025 L。样品。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进即进行凝胶色谱分离之前行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之

38、后的的样品和凝胶色谱分离之后的样品。样品。4 4）浓缩胶聚合完全后（）浓缩胶聚合完全后（30 min30 min），小心移出梳子。），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入TrisTris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。之间的气泡。第六十一页，讲稿共七十一页哦7 7）剥胶）剥胶 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。去一角，以标注凝胶

39、的方位。8 8）染色）染色 将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2 h1-2 h。6)6)电泳电泳 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm1 cm处，关闭电源。处，关闭电源。第六十二页，讲稿共七十一页哦10)10)观察结果：观察结果：SDS SDS电泳的成功关键之一是电泳过程电泳的成功关键之一是电泳过程中

40、，待别是样品制备过程中蛋白质与中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDSSDS的结合程度。的结合程度。9)9)脱色：脱色：染色完毕，倾出染色液染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色换脱色液脱色3-10 h3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。，其间需多次更换脱色液至背景清楚。第六十三页，讲稿共七十一页哦 观察你处理的血液样品离心后是否分层观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图（见教科书图5-185-18），如果分层不明显，可），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细此外，离心速度过高和时间

41、过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三三、实验结果分析与评价、实验结果分析与评价1.你是否完成了对血液样品的处理？你你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？第六十四页，讲稿共七十一页哦 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否检查凝胶是否装填得均匀装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物。此

42、外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖质，例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，观察或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。要重新装柱。2.你填装的凝胶色谱柱中是否有气泡产你填装的凝胶色谱柱中是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？断的？第六十五页，讲稿共七十一页哦 如果凝胶色谱柱装

43、填得很成功、分离操如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液，随着洗脱液缓慢流出缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。柱的装填有关。3.你能观察到蛋白质的分离过程中，红你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离结果。况，并据此判断分离结果。第六十六页，讲稿共七十一页哦 凝胶色谱法

44、也称为分配色谱法，它是凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质根据分子量的大小分离蛋白质根据分子量的大小分离蛋白质根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白

45、质分子即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白样品中相对分子质量较大的蛋白样品中相对分子质量较大的蛋白样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的质先流出，相对分子质量中等的分子后流

46、出，相对分子质量最小的质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出分子最后流出分子最后流出分子最后流出，这种现象又叫，这种现象又叫分子筛现象分子筛现象分子筛现象分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。离。第六十七页，讲稿共

47、七十一页哦 在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液稀释不引起溶液pHpH发生明显变化的作用叫做发生明显变化的作用叫做缓冲作用缓冲作用，具，具有缓冲作用的溶液叫做有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同得不同pHpH范围的缓冲液。范围的缓冲液。缓冲溶液的作用是缓冲溶液的作用是维持反应体系的维持反应体系的维持反应体系的维持反应体系的pHpH不变不变不变不变。在生物体。在生物体

48、内进行的各种生物化学过程都是在精确的内进行的各种生物化学过程都是在精确的pHpH下进行的，受下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的与体内过程完全相同的pHpH。第六十八页，讲稿共七十一页哦 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可

49、解离基团，它们在某个特定的苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pHpH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。的目的。第六十九页，

50、讲稿共七十一页哦 血红蛋白提取和分离的程序可分为血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步四大步，包括：包括：样品处理样品处理、粗分离粗分离、纯化纯化和和纯度鉴定纯度鉴定。首先通过首先通过洗涤洗涤红细胞、血红蛋白的红细胞、血红蛋白的释放释放、离心离心等操作收集到血红蛋白溶液，即等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理样品的处理；再经过再经过透析透析去除分子量较小的杂质，即样品去除分子量较小的杂质，即样品的的粗分离粗分离；然后通过；然后通过凝胶色谱法凝胶色谱法将相对分子质将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化纯化；最后经；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行进