食品与蛋白质工程.ppt

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1、食品与蛋白质工程现在学习的是第1页，共28页概述概述 蛋白质是对生命至关重要的一类生物蛋白质是对生命至关重要的一类生物大分子物质，各种生命功能、生命现象、大分子物质，各种生命功能、生命现象、生命活动都和蛋白质有关。在生命有机生命活动都和蛋白质有关。在生命有机体催化、运动、结构、识别和调节等许体催化、运动、结构、识别和调节等许多方面，起着关键的作用。多方面，起着关键的作用。现在学习的是第2页，共28页酶.几乎全都是蛋白几乎全都是蛋白质。肌肉收肌肉收缩、精子移、精子移动、细胞分裂胞分裂过程中的染色体移程中的染色体移动.高等生物的有序生高等生物的有序生长和分化和分化过程。程。抗体蛋白能抗体蛋白能识别

2、和和结合特异性的外源物合特异性的外源物质，使人体具，使人体具备抵抵抗各种抗各种细菌、真菌和病毒的能力。菌、真菌和病毒的能力。由神由神经细胞膜蛋白构成的离子通道，胞膜蛋白构成的离子通道，负责神神经冲冲动的形成的形成和和传导。血血红蛋白具有蛋白具有结合和合和释放氧的能力，是血液中氧、二氧化碳和放氧的能力，是血液中氧、二氧化碳和氢离子的携离子的携带者。者。另外，人体的毛另外，人体的毛发和指甲属于角蛋白，而血栓是由血和指甲属于角蛋白，而血栓是由血纤蛋白蛋白单体聚合而成的。体聚合而成的。现在学习的是第3页，共28页蛋白质的生物学功能蛋白质的生物学功能1.1.催化功能：催化功能：酶2.2.调节功能：功能：

3、激素激素3.3.结构功能：构功能：皮、毛、骨、牙、皮、毛、骨、牙、细胞骨架胞骨架4.4.运运输功能：功能：血血红蛋白蛋白5.5.免疫功能：免疫功能：免疫球蛋白免疫球蛋白6.6.运运动功能：功能：鞭毛、肌肉蛋白鞭毛、肌肉蛋白7.7.储藏功能：藏功能：酪蛋白酪蛋白8.8.生物膜功能：生物膜功能：及神及神经传导等等现在学习的是第4页，共28页蛋白蛋白质是是生命生命的体的体现者，离开了蛋白者，离开了蛋白质，生命将不复，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽，有的往往不尽人意，需要人意，需要进行改造。行改造。由于蛋白由于蛋白质是由是由许多多氨基酸氨

4、基酸按一定按一定顺序序连接而成的，每一种蛋白接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸有自己独特的氨基酸顺序，序，所以改所以改变其中关其中关键的氨基酸就能改的氨基酸就能改变蛋白蛋白质的性的性质。而氨而氨基酸是由三基酸是由三联体密体密码决定的，只要决定的，只要改改变构成构成遗传密密码的一的一个或两个碱基就能达到改造蛋白个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。的目的。蛋白蛋白质工程工程的一个重要途径就是根据人的一个重要途径就是根据人们的需要，的需要，对负责编码某种蛋某种蛋白白质的基因重新的基因重新进行行设计，使合成的蛋白，使合成的蛋白质变得更符合人得更符合人类的需要。的需要。现在学习的是第5页，共28

5、页第一节第一节概述概述一、蛋白质工程的涵义一、蛋白质工程的涵义1.狭狭义义：指指通通过过改改造造与与蛋蛋白白质质相相应应的的基基因因中中的的碱碱基基顺顺序序，或或设设计计合合成成新新的的基基因因，将将它它克克隆隆至至受受体体细细胞胞中中，通通过过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质（酶）技术。基因表达而获得具有新的特性的蛋白质（酶）技术。2.广义：广义：P56n这这是是一一门门从从改改变变基基因因入入手手，定定做做新新的的蛋蛋白白质质的的技技术术。故故有人将其称为有人将其称为“第二代基因工程第二代基因工程”n1983年年，美美国国生生物物学学家家额额尔尔默默（Ulmer）首首先先提提出出了了“蛋

6、白质工程蛋白质工程”的概念。的概念。现在学习的是第6页，共28页u根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；的蛋白质；u确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；的关系；u从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质。设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质。二、蛋白质工程研究的主要内容二、蛋白质工程研究的主要内容现在学习的是第7页，共28页三、理性分子设计和非理性分子设计三、理性分子设计和非理性分子设计n1.理性分子设计

7、：理性分子设计：在已知蛋白质结构与功能的基础上，利用改变基因在已知蛋白质结构与功能的基础上，利用改变基因中某个或某些特定核苷酸的序列，对最可能影响蛋中某个或某些特定核苷酸的序列，对最可能影响蛋白质功能与性质的基因序列进行定位突变，有目的白质功能与性质的基因序列进行定位突变，有目的地改变蛋白质的某一两个氨基酸残基或模块，从而地改变蛋白质的某一两个氨基酸残基或模块，从而构建全新的蛋白质分子的技术。（构建全新的蛋白质分子的技术。（P57）现在学习的是第8页，共28页n2.非理性分子设计：非理性分子设计：n在不清楚蛋白质三维结构和作用机制的情况下，在实验室在不清楚蛋白质三维结构和作用机制的情况下，在实

8、验室条件下模拟自然进化的过程，在一定条件下使基因发生大条件下模拟自然进化的过程，在一定条件下使基因发生大量变异，然后通过多轮高通量的筛选方法定向选择出所需量变异，然后通过多轮高通量的筛选方法定向选择出所需要的特性突变我，得到具有预期新蛋白质的技术。要的特性突变我，得到具有预期新蛋白质的技术。（P57）现在学习的是第9页，共28页四、蛋白质工程的应用四、蛋白质工程的应用n1.提高酶的稳定性n2.提高酶的活力n3.改变酶的选择性现在学习的是第10页，共28页改变酶的催化活性改变酶的催化活性酪氨酰酪氨酰tRNA合成酶合成酶Thr5151Pro改造改造活力活力25倍倍改变酶的专一性改变酶的专一性枯草杆

9、菌枯草杆菌蛋白酶蛋白酶活性中心活性中心枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶蛋白酶活性中心活性中心SerCys改造改造（水解蛋白质）（水解蛋白质）水解硝基苯酯水解硝基苯酯专一性改变专一性改变现在学习的是第11页，共28页n通过引入“工程二硫键”稳定溶菌酶构成活性中心的两个结构域的相对位置，增强酶的稳定性；定位突变提高其半衰期。n采用盒式突变使葡萄糖异构酶分子中酸性氨基酸集中区域用碱性氨基酸替代，从而改变酶作用的最适pH环境。现在学习的是第12页，共28页n干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。n将人的干扰素的将人的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素在大肠杆菌中进行

10、表达，产生的干扰素的抗病毒活性为的抗病毒活性为106U/mg，只相当于天然产品的十分之一，只相当于天然产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的虽然在大肠杆菌中合成的-干扰素量很多，但多数是以无活性的干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。二聚体形式存在。n为什么会这样？如何改变这种状况？为什么会这样？如何改变这种状况？n研究发现，研究发现，-干扰素蛋白质中有干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第个半胱氨酸（第17位、位、31位位和和141位），推测可能是有一个或几个半胱氨酸形成了不正确位），推测可能是有一个或几个半胱氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第的二硫键。研究人员将第17位的半胱氨酸，

11、通过基因定点突位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的-干扰素的抗病干扰素的抗病性活性提高到性活性提高到108U/mg，并且比天然，并且比天然-干扰素的贮存稳定性高干扰素的贮存稳定性高很多。很多。现在学习的是第13页，共28页第二节第二节理性分子设计和定位突变技术理性分子设计和定位突变技术现在学习的是第14页，共28页一、理性分子设计的主要步骤：一、理性分子设计的主要步骤：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；）测定其氨基酸序列；（3）借借助助核核磁磁共共振振和和X射射线线晶晶体体

12、衍衍射射等等手手段段，尽尽可可能能地地了了解解蛋蛋白白质质的的二维重组和三维晶体结构二维重组和三维晶体结构;（4）设设计计各各种种处处理理条条件件，了了解解蛋蛋白白质质的的结结构构变变化化，包包括括折折叠叠与与去去折折叠叠等等对对其其活性与功能的影响；活性与功能的影响；（5）设设计计编编码码该该蛋蛋白白的的基基因因改改造造方方案，如点突变；案，如点突变；（6）分分离离、纯纯化化新新蛋蛋白白，功功能能检检测测后投入实际使用。后投入实际使用。现在学习的是第15页，共28页二、定位突变二、定位突变n定位突变：定位突变：n在已知蛋白质结构与功能的基础上，在已知在已知蛋白质结构与功能的基础上，在已知DN

13、A序列中取代、插入或删除特定的核苷序列中取代、插入或删除特定的核苷酸，从而产生具有新性状的蛋白质分子的一酸，从而产生具有新性状的蛋白质分子的一种蛋白质工程技术。种蛋白质工程技术。现在学习的是第16页，共28页三、定位突变在酶结构改造中的应用三、定位突变在酶结构改造中的应用n（一）淀粉酶（一）淀粉酶nB.licheniformmis-淀粉酶的双突变突变体 A209V/H133T，酶在 90的半衰期延长了 9 倍。nMitchinson 等人用定点突变突变和高通量筛选的方法得到了一个突突变变体，其最适 pH 值提高了 0.51.0。nGloria 等人用 Phe 或 Tyr 来替B.stearot

14、hermophilus-淀粉酶 289 位的 Ala，其具有了催化醇化反应的能力。nSierks 等人报道了通过改变葡萄糖淀粉酶活性位点的三个氨基酸残基，其作用于 1,4-糖苷键相对于 1,6-糖苷键的 Kcat/Km比值提高了300 倍。现在学习的是第17页，共28页n（二）蛋白酶（二）蛋白酶n枯草杆菌蛋白酶活性位点内有一个枯草杆菌蛋白酶活性位点内有一个Met残基，残基，利用定位突变技术用利用定位突变技术用Cys代替代替Met可增加该可增加该蛋白酶的活力。蛋白酶的活力。n用不可氧化氨基酸（用不可氧化氨基酸（Ser、Ala、Len）构造）构造的枯草杆菌蛋白酶能抗氧化，不易失活。的枯草杆菌蛋白酶

15、能抗氧化，不易失活。现在学习的是第18页，共28页（三）纤维素酶（三）纤维素酶nHakamada等人用定点突变的方法将细菌碱性纤维素酶的等人用定点突变的方法将细菌碱性纤维素酶的Glu137、Asn179和和Asp194突变为突变为Lys，其热稳定性得到了提高。，其热稳定性得到了提高。nZhang等人专门研究了等人专门研究了T.fusca纤维素酶纤维素酶Ce16A表面残基对表面残基对底物专一性的影响，发觉突变体底物专一性的影响，发觉突变体R237A对羧甲基纤维素的对羧甲基纤维素的活力提高了。后来他又研究了靠近活性位点残基对催化活性、活力提高了。后来他又研究了靠近活性位点残基对催化活性、底物专一性

16、、配基连接亲和性的影响，底物专一性、配基连接亲和性的影响，4个残基（个残基（His159、Arg237、Lys259、Glu263）的）的7个突变体对羧甲基纤维素的个突变体对羧甲基纤维素的活性都有所提高，其中活性都有所提高，其中K259H突变体的活性提高的最为显著。突变体的活性提高的最为显著。现在学习的是第19页，共28页在高温下在高温下AsnAsn和和GlnGln容易脱氨形成容易脱氨形成AspAsp和和GluGlu，而，而导致蛋致蛋白白质分子构象的改分子构象的改变，使蛋白，使蛋白质失去活性。失去活性。对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行行诱变改造。改造。这种种酶有有两个相同的两

17、个相同的亚基，每个基，每个亚基含有基含有2 2个个AsnAsn，由于它，由于它们都位都位于于亚基之基之间的界面上，可能的界面上，可能对酶的的热稳定性起决定性作定性起决定性作用。用。通通过寡核苷酸介寡核苷酸介导的定向的定向诱变技技术，将第，将第1414位和第位和第7878位位上的上的2 2个个AsnAsn分分别转变成成Thr(Thr(苏氨酸氨酸)和和Ile(Ile(异亮氨酸异亮氨酸)残残基，大幅度提高突基，大幅度提高突变酶的的热稳定性。定性。转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性 现在学习的是第20页，共28页改变酶的最适改变酶的最适pH值条件值条件 葡萄糖异构葡萄

18、糖异构酶最适最适pHpH为碱性，在碱性，在8080稳定，而在碱性条件定，而在碱性条件下，下，8080时使高果糖使高果糖浆焦化焦化产生有害物生有害物质，反，反应只能在只能在6060进行。行。采用盒式突采用盒式突变技技术将葡萄糖异构将葡萄糖异构酶分子中酸性氨基酸分子中酸性氨基酸(Glu(Glu或或Asp)Asp)集中的区域置集中的区域置换为碱性氨基酸碱性氨基酸(Arg(Arg或或Lys)Lys)，可使，可使葡萄糖异构葡萄糖异构酶的最适的最适pHpH值变为酸性，即可在高温下酸性，即可在高温下进行行反反应现在学习的是第21页，共28页提高酶的催化活性提高酶的催化活性 酶的催化活性由的催化活性由酶分子上

19、的必需基分子上的必需基团决定决定如如对酪氨酸酪氨酸-tRNA-tRNA合成合成酶进行定点突行定点突变在天然状在天然状态下，酪氨酸下，酪氨酸-tRNA-tRNA合成合成酶分子内第分子内第5151位位苏氨酸残氨酸残基的基的羟基能与底物酪氨基能与底物酪氨酰腺腺嘌呤核苷酸戊糖呤核苷酸戊糖环上的氧原子上的氧原子形成形成氢键，这个个氢键的存在影响的存在影响酶分子与另一底物分子与另一底物ATPATP的的亲和力。因此，利用定向和力。因此，利用定向诱变技技术将将酶分子第分子第5151位位苏氨酸残氨酸残基改基改变为脯氨酸残基，脯氨酸残基，酶(Pro-51)(Pro-51)与与ATPATP的的亲和力被增加了和力被增

20、加了近近100100倍，而且最大反倍，而且最大反应速度亦大幅度提高。速度亦大幅度提高。现在学习的是第22页，共28页修饰酶的催化特异性修饰酶的催化特异性 利用定点突利用定点突变技技术葡萄糖淀粉葡萄糖淀粉酶的催化特性。如将活性中的催化特性。如将活性中心的心的GLuGLu、AspAsp被被GlnGln、AsnAsn取代取代时，突，突变体体酶分解分解-1-1，4 4糖苷糖苷键和和-1-1，4 4糖苷糖苷键的活性比例的活性比例发生明生明显改改变修饰修饰Nisin的生物防腐效应的生物防腐效应 NisinNisin是乳酸球菌分泌的有是乳酸球菌分泌的有较强抗菌作用的小分子抗菌作用的小分子肽，可用于罐可用于罐

21、头食品、乳制品、肉制品的保藏食品、乳制品、肉制品的保藏NisinNisin由由3434个氨基酸残基构成个氨基酸残基构成现在学习的是第23页，共28页改改变NisinNisin氨基酸的序列，可增氨基酸的序列，可增强其其稳定性、溶解度定性、溶解度和和扩大抑菌大抑菌谱等，等，扩大大NisinNisin的的应用范用范围。NisinNisin分子分子结构中包含构中包含5 5种稀有氨基酸，即种稀有氨基酸，即ABAABA、DHADHA、DHBDHB、ALA-S-ALAALA-S-ALA和和ALA-S-ABAALA-S-ABA，它，它们通通过硫硫醚键形成五个内形成五个内环。现在学习的是第24页，共28页蛋白质

22、在风味修饰蛋白方蛋白质在风味修饰蛋白方面的应用面的应用n1、物理改性、物理改性n2、化学改性、化学改性n（1）碱处理）碱处理（2）酸处理）酸处理n（3）琥珀酰化作用）琥珀酰化作用（4）乙酰化作用）乙酰化作用n（5）磷酸化作用）磷酸化作用（6）酰胺化作用）酰胺化作用n（7）硫醇化作用）硫醇化作用（8）酯化作用）酯化作用n（9）糖酰化作用）糖酰化作用（10）去酰胺基作用）去酰胺基作用现在学习的是第25页，共28页n融合蛋白技术：通过DNA重组技术将两个基因重组从而构建和表达多功能新型蛋白质的技术。n融合蛋白：通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。融合蛋白技术及其应用现在学习的是第26页

23、，共28页融合蛋白技术的应用融合蛋白技术的应用n双功能酶：双功能酶：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-半乳糖脱氢酶融合蛋白在一定条件下，其偶联反应产生半乳糖脱氢酶融合蛋白在一定条件下，其偶联反应产生NADH的速度是同时加入这两种酶的反应速度的两倍以上。同时过渡态的速度是同时加入这两种酶的反应速度的两倍以上。同时过渡态时间缩短近四倍。时间缩短近四倍。n靶向药物：靶向药物：定向药物一般由两部分组成：一部分是药物；另一部分是可以与病灶特异性结合的配基。定向药物一般由两部分组成：一部分是药物；另一部分是可以与病灶特异性结合的配基。通过融合蛋白技术将这两部分融合在一起，通过融合蛋白技术将这两部分融合在一起，即可构

24、成一个具有独特构象与功能的蛋白即可构成一个具有独特构象与功能的蛋白质。质。例：例：胸腺素胸腺素/干扰素融合蛋白用于乙型肝炎等的治疗。干扰素融合蛋白用于乙型肝炎等的治疗。n抗菌肽：抗菌肽：例：抗菌肽例：抗菌肽B和人溶菌酶的融合蛋白，可抑制和人溶菌酶的融合蛋白，可抑制HIV病毒。病毒。现在学习的是第27页，共28页食物蛋白改性技术食物蛋白改性技术n化学改性：针对蛋白质的氨基、羟基及羧基进行化学修饰改变蛋白化学改性：针对蛋白质的氨基、羟基及羧基进行化学修饰改变蛋白质的结构、静电荷、疏水基团，而起到改变蛋白质功能性质的目的。质的结构、静电荷、疏水基团，而起到改变蛋白质功能性质的目的。n酰化酰化n磷酸化磷酸化n羟甲基化羟甲基化n磺酸化磺酸化n化学接枝化学接枝n共价交联共价交联n水解及氧化等水解及氧化等现在学习的是第28页，共28页