分子克隆工具酶 (2)精选PPT.ppt

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1、关于分子克隆工具酶(2)第1页，讲稿共78张，创作于星期日 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖依赖一些酶一些酶(如限制如限制性核酸内切酶，连接酶，性核酸内切酶，连接酶，DNADNA聚合酶等聚合酶等)作为作为工具工具对基因进行人工切对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。生的生物工程产品。分子克隆工具酶分子克隆工具酶第2页，讲稿共78张，创作

2、于星期日工具酶核酸内切酶核酸内切酶核酸外切酶核酸外切酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA及及RNARNA修饰酶修饰酶单链核酸内切酶单链核酸内切酶第3页，讲稿共78张，创作于星期日酶酶主要用途主要用途限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别识别DNA特定序列，切割特定序列，切割DNA分子分子DNA连接酶连接酶连接两个连接两个DNA分子或片段分子或片段大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合聚合酶酶或或Klenow酶酶1制作制作DNA探针；探针；2合成合成cDNA第二链；第二链；3填补双链填补双链DNA3凹端；凹端；4DNA测序。测序。TaqDNA聚合酶聚合酶聚合酶链式反应（聚合酶链式反应

3、（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸激酶多核苷酸多核苷酸5-OH磷酸化，制末端标记探针磷酸化，制末端标记探针末端转移酶末端转移酶使使3-末端加同聚物尾末端加同聚物尾S1核酸酶核酸酶降解单链降解单链DNA或或RNADNA酶酶在双链在双链DNA上产生随机切口上产生随机切口RNA酶酶A降解降解RNA逆转录酶逆转录酶补平反应，合成补平反应，合成cDNA或制探针或制探针磷酸酶磷酸酶切除核酸末端磷酸基切除核酸末端磷酸基SUMMARY第4页，讲稿共78张，创作于星期日1 1 限制性内切酶限制性内切酶1.1 引言引言-核酸酶和限制性核酸内切酶的定义核酸酶和限制性核酸内切酶的定义1.2 限制性核酸内切酶的命名限制性核

4、酸内切酶的命名1.3 限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的分类1.4 限制性核酸内切酶活性及其影响因素限制性核酸内切酶活性及其影响因素第5页，讲稿共78张，创作于星期日核酸酶核酸酶（NucleaseNuclease）：通过切割相邻两个核苷酸残基之间磷酸二酯键，导致核酸分通过切割相邻两个核苷酸残基之间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。1 1）按作用对象可分为）按作用对象可分为:Deoxyribonuclease(DNAase)&Ribonuclease(RNAase)Deoxyribonuclease(DNAase)&Ribonuclease(

5、RNAase)2 2）按水解断裂核酸分子不同方式可分为：）按水解断裂核酸分子不同方式可分为：Endonuclease&ExonucleaseEndonuclease&Exonuclease1.1 引言引言-核酸酶和限制性核酸内切酶的定义核酸酶和限制性核酸内切酶的定义第6页，讲稿共78张，创作于星期日限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease):指一类能识别双链指一类能识别双链DNADNA分子中特定核苷酸序列，分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链并在识别序列内或附近特异切割双链DNADNA的核酸的核酸内切酶。内切酶。限制酶天然存在于细菌体内

6、，与相伴存在的限制酶天然存在于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的甲基化酶共同构成细菌的限制限制-修饰系统修饰系统（Restriction-ModificationSystem)。第7页，讲稿共78张，创作于星期日EcoRIEscherichia属名属名Coli种名种名Ry13株系株系编号编号 若若种种名名头头2 2个个字字母母相相同同则则其其中中一一个个可可用用种种名名的的第第一一和和第第三三个个字母。字母。1.2限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名第8页，讲稿共78张，创作于星期日1.3 限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的分类1.3.1 型限制性内切酶型限制性内切酶1

7、.3.2 型限制性内切酶型限制性内切酶1.3.3 型限制性内切酶型限制性内切酶第9页，讲稿共78张，创作于星期日1.3.1 1.3.1 型限制性内切酶型限制性内切酶功能：功能：限制、修饰限制、修饰特点：特点：需需MgMg2+2+、ATPATP和和S-S-腺苷蛋氨酸为腺苷蛋氨酸为辅助辅助因子；因子；识别位点和切割位点不一致，没识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点（随机性）；有固定切割位点（随机性）；应用：应用：不常用。不常用。第10页，讲稿共78张，创作于星期日1.3.2 型限制性内切型限制性内切酶酶功能：功能：限制、修饰限制、修饰特点：特点：需需MgMg2+2+、ATPATP和和S-S-

8、腺苷蛋氨酸为腺苷蛋氨酸为辅助因子；辅助因子；特异切割，切割位点在识别位点外，距特异切割，切割位点在识别位点外，距识别位点识别位点33端端24-26bp24-26bp处。处。应用：应用：数量很少，分子克隆中无实际作用。数量很少，分子克隆中无实际作用。第11页，讲稿共78张，创作于星期日1.3.3 型限制性内切酶型限制性内切酶功能：功能：识别并特异切割识别并特异切割DNADNA分子。分子。即通常所指的即通常所指的DNADNA限制性核酸内切酶；限制性核酸内切酶；反应特点：反应特点：仅需仅需MgMg2+2+作为催化反应的辅助因子，作为催化反应的辅助因子，能识别双链能识别双链DNADNA的特殊序列，并可

9、特异切割的特殊序列，并可特异切割DNADNA，产生特异性的片段；，产生特异性的片段；应用：应用：种类繁多，分子克隆中最常用的内切酶。种类繁多，分子克隆中最常用的内切酶。第12页，讲稿共78张，创作于星期日限制性内切酶限制性内切酶限制限制酶酶第13页，讲稿共78张，创作于星期日限制性内切酶限制性内切酶分布：分布：主要在微生物中。主要在微生物中。作用特点：作用特点：特异性，即识别特异性，即识别特定核苷酸序列特定核苷酸序列，切割，切割特定特定切点。切点。结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。举例：大肠杆菌的一种限制酶举例：大肠杆菌的一种限制酶EcoRI能识别能识别G

10、AATTC序列，并在序列，并在G和和A之间切开之间切开 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条单链的切口，两条单链的切口，带有几个伸出的核苷带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互酸，它们之间正好互补配对，这样的切口补配对，这样的切口叫做黏性末端。叫做黏性末端。第14页，讲稿共78张，创作于星期日(1)基本特性基本特性识别长度识别长度为为4-84-8个核苷酸的特异序列；最常见的个核苷酸的特异序列；最常见的为为6 6个碱基个碱基.许多许多识别序列识别序列具具回文结构回文结构，如，如HinHind d 的识别序列：的识别序列：5 AAGCTT 35 AAGCTT 3 3 TTCGAA 5 3 TTCG

11、AA 5切割产生的末端切割产生的末端有有粘端粘端 (cohesive/sticky end)(cohesive/sticky end)如如BamBamH I(GGATCC)H I(GGATCC)和和平端平端 (blunt end)(blunt end)如如SmaSma I(CCC GGG)I(CCC GGG)第15页，讲稿共78张，创作于星期日Pst切割后产生切割后产生3粘性末端：粘性末端：有一些酶沿对称轴切断有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平，产生平端或钝端（端或钝端（Bluntend）,如如Sma：第16页，讲稿共78张，创作于星期日Enzyme Recognition sequenceE

12、nzymeRecognition seuqenceBamH IGGATCCPst ICTGCA GBgl II A GATCTSal IG TCGACEcoR IG AATTCSau3A IGATCHind IIGTPy PuACSfi IGGCCNNNN NGGCCHind IIIA AGCTTSma ICCC GGGKpn IGGTAC CXba IT CTAGANot IGC GGCCGCXho IC TCGAGRecognition Sequences and Cutting sites of selected Restriction Endonucleases 第17页，讲稿共78张

13、，创作于星期日(2)同裂酶（同裂酶（isoschizomer）识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同不同 。同序同切酶同序同切酶 这些酶识别序列和切割位置都相同这些酶识别序列和切割位置都相同 Hind Hind 与与 Hinc Hinc 识别切割位点为识别切割位点为 GTYRACGTYRAC ，Hpa Hpa 与与 Hap Hap 识别切割位点为识别切割位点为 CCGG CCGG Mob Mob 与与 Sau3A Sau3A 识别切割位点为识别切割位点为 GATCGATC 。第18页，讲稿共78张，创作于星期日 同序异切酶同序异

14、切酶 Kpn Kpn 和和 Acc65 Acc65 识别的序列识别的序列是相同的，是相同的，但它们的切割位点不同，分别为但它们的切割位点不同，分别为 GGTACC GGTACC 和和 GGTACC GGTACC。“同功多位同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。种限制酶的功能。如如 EcoR EcoR 识别和切割位点为识别和切割位点为 GAATTC GAATTC，ApoApo 识别和切割位点为识别和切割位点为 RAATTY RAATTY，后者可识别前，后者可识别前者的序列。者的序列。其它有些限制酶识别的序列有交叉其它有些限制酶识别的序列有交

15、叉，如在，如在 pUC pUC 系系列质粒的多克隆位点中有一个列质粒的多克隆位点中有一个 Sal Sal 位点（识别切割位位点（识别切割位点为点为 GTCGACGTCGAC），该位点也可被），该位点也可被 AccAcc（识别切割位点（识别切割位点为为 GTMKACGTMKAC）和）和 HincHinc（识别切割位点为（识别切割位点为GTYRACGTYRAC）切割。切割。第19页，讲稿共78张，创作于星期日(3)(3)同尾酶同尾酶有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些酶称为这些酶称为同尾酶（同尾酶（isocaudamer)isocau

16、damer)如：如：BamBamH I :GH I :GGATCCGATCC Bgl Bgl II:AII:AGATCGATC Bcl:5-T G ATCA-3第20页，讲稿共78张，创作于星期日1.4 1.4 限制性核酸内切酶活性限制性核酸内切酶活性及其影响因素及其影响因素(1)(1)活性大小：酶对活性大小：酶对DNADNA水解程度不同。水解程度不同。(2)(2)酶的活性单位：酶的活性单位：在指明在指明pHpH与与3737，在，在0.05mL0.05mL反应混合物中，反应混合物中，1 1小时消化小时消化1g1g的的DNADNA的酶量为的酶量为1 1单位。单位。第21页，讲稿共78张，创作于星

17、期日(3)(3)限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件1)1)底物底物 DNADNA DNA DNA纯度纯度:RNA RNA 与与 E E 结合影响有效酶浓度；结合影响有效酶浓度；DNADNA浓度浓度:DNA DNA过大，抑制酶活，影响酶分子扩散过大，抑制酶活，影响酶分子扩散 如：如：4g DNA/1U HPa 50l 37 15h4g DNA/1U HPa 50l 37 15h 1g DNA/1U HPa 50l 37 1h 1g DNA/1U HPa 50l 37 1h 第22页，讲稿共78张，创作于星期日 2)2)反应系统因素反应系统因素缓冲液（无菌、无污染）缓冲液（无菌、

18、无污染）buffer（pH=8.0）：50mmol/LTris-HCl10mmol/LMgCl21mmol/LDTT或巯基乙醇或巯基乙醇100gBSA/ml（DDT：二硫苏糖醇：二硫苏糖醇BSA：牛血清蛋白：牛血清蛋白)NaCL（0,500,1000mM）金属离子金属离子如：如：型酶需型酶需Mg2+Mg2+，若以，若以Mn2+Mn2+代替代替Mg2+Mg2+（如（如HindHind，ECORIECORI）则特异性改变。）则特异性改变。离子浓度不合适会抑制酶活。离子浓度不合适会抑制酶活。牛血清蛋白牛血清蛋白(BSA)(BSA)BSA BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学是酶稳定剂，可避免

19、热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量品导致的酶变性。过量BSABSA会引起电泳拖尾会引起电泳拖尾限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件第23页，讲稿共78张，创作于星期日限制性核酸内切酶的反应体系限制性核酸内切酶的反应体系Buffer（10 x）3LDNA（质粒、载体、总DNA.0.1-1g酶 2uddH2OBSA（1%）3 L30 L酶量不超过总体积的1/10第24页，讲稿共78张，创作于星期日思考题用限制酶Bgl消化2g DNA，该DNA浓度为 125g/mL，Bgl为 4 units/L.并提供了限制酶Bgl的10倍的缓冲盐体系。请设计一最佳方案来完成该实验第25页，讲稿

20、共78张，创作于星期日限制性内切酶的选择原则：选常见的、活性高的酶，如果双酶切最好选有公用Buffer的酶推荐酶：Promega公司，Takara公司，Tyoyobo公司第26页，讲稿共78张，创作于星期日双酶切A有公用Buffer的。（直接用公用Buffer切）B两种酶反应温度不同的。（先切其中一个然后高温失活，再用另外一个酶切）C无公用Buffer的：先用低盐Buffer切几个小时，再补加盐分到高盐加入另外一个酶继续切第27页，讲稿共78张，创作于星期日3.星活性星活性在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的

21、特殊性称星星活性改变的特殊性称星星活性,如如EcoR星活性用EcoR*表示。影响因素：甘油浓度高（5%），酶过量（100U/ml），离子强度低（8.0），45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基亚枫，二价阳离子，12%乙醇。限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件第28页，讲稿共78张，创作于星期日DNA末段的长度对限制酶切割末段的长度对限制酶切割的影响的影响需要在识别序列两端存在一定长需要在识别序列两端存在一定长度的非识别序列增加切割效率度的非识别序列增加切割效率 第29页，讲稿共78张，创作于星期日位点偏爱（位点偏爱（Site preferenceSite prefere

22、nce）某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。第30页，讲稿共78张，创作于星期日1.51.5 限制酶的用途限制酶的用途 1.1.在特异位点上切割在特异位点上切割DNADNA，产，产生特异的限制片断生特异的限制片断 2.2.建立限制酶（物理）图谱绘建立限制酶（物理）图谱绘制制 3.3.构建基因文库构建基因文库 4.4.用限制酶切出相同的粘性末端，用限制酶切出相同的粘性末端，以便重组以便重组第31页，讲稿共78张，创作于星期日2 DNA2 DNA连接酶连接酶2.1 2.1 定义及功能定义及功能2.2 2.2 种类及作

23、用机理种类及作用机理2.3 2.3 使用时的注意事项使用时的注意事项第32页，讲稿共78张，创作于星期日2.1 2.1 定义及功能定义及功能 DNA DNA连接酶（连接酶（DNA ligaseDNA ligase）：可使一段）：可使一段DNADNA的的3 3 羟基末端和羟基末端和55磷酸末端形成磷酸末端形成33，5-5-磷酸二酯键，磷酸二酯键，把两个把两个DNADNA片段连在一起，封闭片段连在一起，封闭DNADNA双链上形成的双链上形成的切口的酶。切口的酶。DNADNA连接酶是连接酶是19671967年在三个实验室同时发现的。年在三个实验室同时发现的。J:J:生物视频生物视频 细胞生物学视频细

24、胞生物学视频 连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶.J:生物视频细胞生物学视频连接酶连接酶.swf第33页，讲稿共78张，创作于星期日OH P53355335DNA ligaseDNA ligase DNA ligase 连接缺刻连接缺刻(nick)(nick)第34页，讲稿共78张，创作于星期日DNA连接酶连接酶连接的部位：连接的部位：磷酸二酯键（梯子的扶手），磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。不是氢键（梯子的踏板）。第35页，讲稿共78张，创作于星期日 T4 DNA T4 DNA连接酶连接酶(ATP(ATP提供能量）和大提供能量）和大肠杆菌肠杆菌DNADNA连接酶（连接酶（

25、NADNAD+提供能量）两提供能量）两种。种。2.2 种类及作用机理种类及作用机理第36页，讲稿共78张，创作于星期日大肠杆菌的大肠杆菌的DNADNA连接酶连接酶 大肠杆菌的大肠杆菌的DNADNA连接酶是一条分子量为连接酶是一条分子量为75KD75KD的多肽链。的多肽链。对对胰蛋白酶胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与具有部份活性，可以催化酶与NADNAD(而不是而不是ATP)ATP)反应形成反应形成酶酶-AMP-AMP中间物，但不能继续将中间物，但不能继续将AMPAMP转移到转移到DNADNA上促进磷酸上促进磷酸二酯键

26、的形成。二酯键的形成。第37页，讲稿共78张，创作于星期日大肠杆菌的大肠杆菌的DNADNA连接酶连接酶 DNA DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有连接酶在大肠杆菌细胞中约有300300个分子，和个分子，和DNADNA聚合酶聚合酶的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNADNA连接酶的主要功能就是在连接酶的主要功能就是在DNADNA聚合酶聚合酶催化聚合催化聚合,填填满双链满双链DNADNA上的单链间隙后上的单链间隙后,封闭封闭DNADNA双链上的缺口。这在双链上的缺口。这在DNADNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有复制、修复和重组中起着重要的

27、作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行缺陷的突变株不能进行DNADNA复制、修复和重组。复制、修复和重组。第38页，讲稿共78张，创作于星期日噬菌体噬菌体T4DNAT4DNA连接酶连接酶 噬菌体噬菌体T4DNAT4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量连接酶分子也是一条多肽链，分子量为为60KD60KD，其活性很容易被，其活性很容易被0.2mol/L0.2mol/L的的KClKCl和精胺所抑制。和精胺所抑制。此酶的催化过程需要此酶的催化过程需要ATPATP辅助。辅助。T4DNAT4DNA连接酶可连接连接酶可连接DNA-DNA-DNADNA，DNA-RNADNA-RNA，RNA-RNARNA-RNA

28、和双链和双链DNADNA粘性末端或平头末端。粘性末端或平头末端。另外，另外，NH4C1NH4C1可以提高在大肠杆菌可以提高在大肠杆菌DNADNA连接酶的的催化连接酶的的催化速率，而对速率，而对T4DNAT4DNA连接酶则无效。无论是连接酶则无效。无论是T4DNAT4DNA连接酶，连接酶，还是大肠杆菌还是大肠杆菌DNADNA连接酶都不能催化两条游离的连接酶都不能催化两条游离的DNADNA链链相连接。相连接。第39页，讲稿共78张，创作于星期日AATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAA5555(1)(2)AATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAA55AATTCGGCTTAA55(a)分

29、子间连接(b)分子内连接(1)(2)ATGCTATAGCTAT4连接酶T4连接酶第40页，讲稿共78张，创作于星期日T4 DNA ligase 的作用机理的作用机理第41页，讲稿共78张，创作于星期日第42页，讲稿共78张，创作于星期日1)DNA1)DNA连接酶不能催化两单链连接酶不能催化两单链DNADNA分子连接；分子连接；2)2)只能连接双链只能连接双链DNADNA分子的单链缺刻分子的单链缺刻(nick)(nick)；3)3)不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的缺口（缺口（gapgap）。）。2.3 使用时的注意事项使用时的注意事项第43页，讲稿

30、共78张，创作于星期日思考思考要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。要切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来用同一种限制酶来切割，会怎样呢？切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就可以合成重组的端黏合起来，就可以合成重组的DNA分子了。分子了。第44页，讲稿共78张，创作于星期日3 3DNADNA聚合酶聚合酶（DNA polymeras

31、eDNA polymerase）J:J:生物视频生物视频 细胞生物学视频细胞生物学视频DNADNA聚合酶聚合酶Nucleotide_Polymerization.movNucleotide_Polymerization.movJ JJ J:生物视频生物视频 细胞生物学视频细胞生物学视频DNADNA聚合酶聚合酶Nucleotide_Polymerization.movNucleotide_Polymerization.mov3.1 DNA聚合酶聚合酶 I3.2 Klenow聚合酶聚合酶3.3 Taq DNA聚合酶聚合酶3.4 逆转录酶逆转录酶3.5 T4 DNA聚合酶聚合酶3.6 T7 DNA聚

32、合酶聚合酶第45页，讲稿共78张，创作于星期日3.1 DNA聚合酶聚合酶 I活性：活性：5353聚合活性，聚合活性，5353外切和外切和35 35 外切活性。外切活性。发挥生物学活性的条件：发挥生物学活性的条件：（1 1）DNADNA模板（可以是单链或双链）模板（可以是单链或双链）（2 2）带有）带有3-3-端游离羟基的引物链端游离羟基的引物链（3 3）底物和激活剂）底物和激活剂注：注：对双链对双链DNADNA，当有，当有dNTPdNTP存在时，存在时，3535降解活降解活性会被性会被5353方向的聚合活性所抑制。方向的聚合活性所抑制。应用：应用：缺口平移法制备缺口平移法制备DNADNA分子杂

33、交探针分子杂交探针第46页，讲稿共78张，创作于星期日1、53聚合酶活性：聚合酶活性：CCGGGCTATCGGE.coli DNApolIMg2+，4dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG2、53外切酶活性外切酶活性3、35外切酶活性外切酶活性GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coli DNApolIMg2+pC，pT5TCGATAGCCAGCTATE.coli DNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC5DNA聚合酶聚合酶I的三种活性的三种活性第47页，讲稿共78张，创作于星期日DNA杂交杂交探针探针的制备的制备5335533

34、5533553355335*(a)(b)(c)(d)(e)(a)双链的DNA分子(b)带有3-OH末端的单链缺口(c)pol从5-P移去一个核苷酸(d)pol将32P标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸(e)重复(c)(d)的步骤，缺口沿5-3方向移动，形成32P标记的核苷酸合成的DNA链第48页，讲稿共78张，创作于星期日制备高比活性的探针制备高比活性的探针 当双链当双链DNADNA分子的一条链上产生切口时分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA,E.coli DNA聚聚合酶合酶就可将核苷酸连接到切口的就可将核苷酸连接到切口的3 3羟基末端。同时该羟基末端。同时该酶具有从酶具有从5 53

35、3的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性,能从切口的能从切口的5 5端除去核端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3 3端补上核苷端补上核苷酸酸,从而使切口沿着从而使切口沿着DNADNA链移动链移动,用放射性核苷酸代替原先用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为最合适的切口平移片段一般为50-50050-500个核苷酸。个核苷酸。DNA聚合酶聚合酶 I 在基因工程的应用在基因工程的应用第49页，讲稿共78张，创作于星期日用于分子克隆（填充缺口利于重

36、组）用于分子克隆（填充缺口利于重组）DNA DNA polpol能能填填充充DNADNA的的小小缺缺口口区区（Gapped Gapped regionregion）以以便便有有效效在在体体外外用用于于DNADNA分子重组分子重组第50页，讲稿共78张，创作于星期日 DNADNA序列分析序列分析K:K:生物视频生物视频 细胞生物学视频细胞生物学视频 核酸特性、合成及转运核酸特性、合成及转运DNADNA测序测序生物视频生物视频 细胞生物学视频细胞生物学视频 核酸特性、核酸特性、合成及转运合成及转运DNADNA测序测序 SaugerSauger双脱氧法双脱氧法 DNA DNA polpol参参入入了

37、了2 23 3双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸到到相相应应的的融融合合了了的的引引物物中中，从从而而终终止止了了链链的的进进一一步步延延伸伸，这这样样每每个个大大小小不不同同片片段段都都带带有有ddNTPddNTP。经过。经过PAGEPAGE测出测出DNADNA顺序。顺序。第51页，讲稿共78张，创作于星期日化学降解法化学降解法 当当MgMg2 2被被MnMn2 2取取代代时时，DNA DNA polpol有有参参与与相相应应NTPNTP取取代代dNTPdNTP的的能能力力，参参与与的的这这个个NTPNTP可可以以作作为为1 1个个特特殊殊切切割割位位点点而而被被降降解解，得得到到带带有有NTPNTP

38、末末端端的的DNADNA片片段段，这这是是化化学学法法测测序序的的主主要要原理。原理。加减法加减法 主主要要原原理理是是在在限限制制使使用用dNTPdNTP条条件件下下加加入入DNA DNA polpol和和T4T4诱诱导导的的DNA DNA polpol同同时时反反应应。在在减减法法反反应应中中从从4 4个个反反应应混混合合物物中中每每4 4个个dNTPdNTP中中减减去去1 1个个。生生长长链链沿沿着着引引物物延延伸伸至至缺缺少少的的那那个个dNTPdNTP为为止止。在在加加法法反反应应中中所所用用的的dNTPdNTP只只有有1 1种种，如如dATPdATP，通通过过DNA DNA pol

39、pol 3535外外切切酶酶活活性性使使链链终终止止在在带带有有A A的的3 3末末端端用用其其它它3 3种种dNTPdNTP进进行行类类似似反反应应，这这样样通通过过加加或或减减法法8 8个个混混合合物物的的电电泳结果即可推出泳结果即可推出DNADNA链的顺序链的顺序。第52页，讲稿共78张，创作于星期日来源：E.coli E.coli DNA DNA PolymerasePolymerase经经蛋蛋白白酶酶水水解解的的大大片段片段(Klenow(Klenow和和Henningseon.1970Henningseon.19703.2Klenow聚合酶聚合酶DNApol枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋

40、白酶或胰蛋白酶或胰蛋白酶C端端(76kd)+N端（端（36kd）5 3外切外切第53页，讲稿共78张，创作于星期日用途用途填补限制酶的填补限制酶的5-5-粘性末端为平齐末端粘性末端为平齐末端5 5CCCC3 3GGAATTGGAATT5 5CCTTAA3CCTTAA33 3GGAATT5GGAATT5KlenowKlenow3-3-末端标记末端标记 Klenow Klenow 在无底物时只进行在无底物时只进行3 53 5外切；有底物存在时则聚合。外切；有底物存在时则聚合。这种标记也称作交换标记，但这种标记也称作交换标记，但KlenowKlenow作用不如作用不如T T4 4DNADNA聚合酶。

41、聚合酶。第54页，讲稿共78张，创作于星期日显著特点：显著特点：热稳定性热稳定性 70 70 反应反应 2 h2 h残留活性为原来的残留活性为原来的90%90%；93 93 反应反应 2 h2 h残留活性为原来的残留活性为原来的60%60%；94 94 反应反应 2 h2 h残留活性为原来的残留活性为原来的40%40%。应用：应用：（1 1）DNADNA序列测定序列测定（2 2）PCR(polymerase chain reaction)PCR(polymerase chain reaction)对对DNADNA的的特定片段进行体外扩增。特定片段进行体外扩增。K:K:生物视频生物视频 细胞生细

42、胞生物学视频物学视频 分子分子PCRPCR3.3 Taq DNA聚合酶聚合酶第55页，讲稿共78张，创作于星期日逆转录酶逆转录酶 (reverse transcriptase)(reverse transcriptase)：又称为又称为RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶。聚合酶。活性：活性：5353聚合酶活性和聚合酶活性和RNaseHRNaseH活性。聚合作用所需模板可活性。聚合作用所需模板可以是以是RNARNA或或DNADNA，引物是带，引物是带3-OH3-OH的的RNARNA或或DNADNA。K:K:生物视频生物视频 细胞生物学视频细胞生物学视频 逆转录酶逆转录酶 逆转录酶的作用原

43、理逆转录酶的作用原理.swf.swf生物视频生物视频 细胞生物学视频细胞生物学视频 逆转录酶逆转录酶 逆转录酶的作逆转录酶的作用原理用原理.swf.swfK:K:生物视频生物视频 细胞生物学视频细胞生物学视频 逆转录酶逆转录酶DNADNA端部处理端部处理生物视频生物视频 细胞生物学视频细胞生物学视频 逆转录酶逆转录酶DNADNA端部处理端部处理K:K:生物视频生物视频 细胞生物学视频细胞生物学视频 反转录病毒反转录病毒Life_Cycle_of_a_Retrovirus.movLife_Cycle_of_a_Retrovirus.mov生物视频生物视频 细胞生物学视频细胞生物学视频 反转录病毒

44、反转录病毒Life_Cycle_of_a_Retrovirus.movLife_Cycle_of_a_Retrovirus.mov3.4 3.4 逆转录酶逆转录酶第56页，讲稿共78张，创作于星期日逆转录酶的活性逆转录酶的活性第57页，讲稿共78张，创作于星期日 用途：用途：（1 1）在体外以）在体外以mRNAmRNA为模板合成为模板合成cDNAcDNA；（2 2）对有）对有55突出末端的突出末端的DNADNA片段作末端标记片段作末端标记（补平）；（补平）；（3 3）双脱氧法测序；）双脱氧法测序；（4 4）以）以DNADNA或或RNARNA为模板合成核酸探针。为模板合成核酸探针。第58页，讲稿

45、共78张，创作于星期日活性：活性：5353聚合酶活性和聚合酶活性和3535外切酶活外切酶活性，且性，且3535外切酶活性对单链外切酶活性对单链DNADNA的作用的作用比对双链比对双链DNADNA强。强。高浓度高浓度dNTP dNTP 环竟下前者活性更强。环竟下前者活性更强。应用：应用：标记标记DNADNA平末端或隐蔽平末端或隐蔽33末端末端注意：注意：33外切酶活性无序列特异性外切酶活性无序列特异性3.5 T4 DNA3.5 T4 DNA聚合酶聚合酶第59页，讲稿共78张，创作于星期日活性：活性：5353聚合酶活性；有单链及双链的聚合酶活性；有单链及双链的3535外切酶活性，但无外切酶活性，但

46、无5353外切酶活性；外切酶活性；特点：特点：极佳的连续合成能力极佳的连续合成能力应用：应用：（1 1）用于长模板）用于长模板DNADNA的引物延伸反应；的引物延伸反应；（2 2）通过单纯的延伸或取代合成途径标记通过单纯的延伸或取代合成途径标记DNA 3DNA 3末端；末端；（3 3）使双链）使双链DNADNA的的55或或33突出末端变成平末端。突出末端变成平末端。3.6T7DNA聚合酶聚合酶第60页，讲稿共78张，创作于星期日T7DNA聚合酶（测序酶）聚合酶（测序酶）来源：来源：T7PhageT7Phage感染的感染的E.coliE.coli结构：由结构：由2 2个蛋白亚基组成：个蛋白亚基组

47、成：T T7 7phage gene5phage gene5蛋白蛋白 +宿主硫氧蛋白宿主硫氧蛋白活性：活性：5353聚合，持续反应时间最长，所聚合，持续反应时间最长，所以合成的以合成的DNADNA链长。故在链长。故在DNADNA测序中很优测序中很优越。越。3535外切，是外切，是DNA DNA 聚合酶聚合酶的的 10001000倍。倍。第61页，讲稿共78张，创作于星期日4 4 修饰酶修饰酶4.1 4.1 碱性磷酸酶碱性磷酸酶4.2 4.2 末端转移酶末端转移酶4.3 T44.3 T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶4.4 S14.4 S1核酸酶核酸酶 第62页，讲稿共78张，创作于星期日4.1 4.

48、1 碱性磷酸酶碱性磷酸酶功能：功能：催化核酸脱催化核酸脱5-5-磷酸基团，使磷酸基团，使DNADNA或或RNARNA片段片段5-P5-P末端转换成末端转换成5-OH5-OH末端。末端。来源：来源：有两种，分别来自于大肠杆菌和小牛肠道，前有两种，分别来自于大肠杆菌和小牛肠道，前者叫者叫bacterial alkaline phosphatase bacterial alkaline phosphatase(BAPBAP););后者叫后者叫calf intestinal alkaline calf intestinal alkaline phosphatase(phosphatase(CIPCIP

49、)。第63页，讲稿共78张，创作于星期日碱性磷酸酶的活性碱性磷酸酶的活性第64页，讲稿共78张，创作于星期日第65页，讲稿共78张，创作于星期日末端转移酶末端转移酶(terminal transferase):(terminal transferase):是末端脱氧核苷酸转移酶简称。来源于前淋巴细是末端脱氧核苷酸转移酶简称。来源于前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。胞和分化早期的类淋巴细胞。功能：功能：催化催化55脱氧核苷三磷酸进行脱氧核苷三磷酸进行5353方向的聚合作方向的聚合作用用,逐个将逐个将dNTPdNTP分子加到线性分子加到线性DNADNA分子分子3-OH3-OH端端。4.2 4.2

50、末端转移酶末端转移酶第66页，讲稿共78张，创作于星期日末端转移酶的催化作用末端转移酶的催化作用第67页，讲稿共78张，创作于星期日 用途：用途：(1)(1)主要用于给外源主要用于给外源DNADNA片段和及载体分片段和及载体分子加上互补同聚物尾巴；子加上互补同聚物尾巴；(2)(2)标记标记DNADNA片段的片段的33末端。末端。第68页，讲稿共78张，创作于星期日第69页，讲稿共78张，创作于星期日4.3 T44.3 T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶来源：来源：T4 polynucleotide kinaseT4 polynucleotide kinase来源于来源于T4T4噬噬菌体感染的大肠杆菌