连接酶及其他二讲稿.ppt

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1、关于连接酶及其他二第一页，讲稿共四十七页哦2.2.修复与修复与RNARNA链结合的链结合的DNADNA链上切口处的磷酸链上切口处的磷酸 二酯键二酯键一、一、DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质44444444第二页，讲稿共四十七页哦一、一、DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质3.3.连接多个平头双链连接多个平头双链DNADNA分子：分子：第三页，讲稿共四十七页哦注意注意：（1 1）DNADNA连接酶连接酶只能只能连接相邻核苷酸之间的连接相邻核苷酸之间的切口切口 （nicknick）；（2 2）如果是缺少一个或几个核苷酸的）如果是缺少一个或几个核苷酸的裂口裂口 （gapgap），

2、DNADNA连接酶是连接酶是无法无法连接的；连接的；46464646第四页，讲稿共四十七页哦（3 3）DNADNA连接酶不能连接两条单链连接酶不能连接两条单链DNADNA分子或分子或 环化的单链环化的单链DNADNA分子，被连接的分子，被连接的DNADNA链必须链必须 是双螺旋是双螺旋DNADNA分子的一部分；分子的一部分；（4 4）DNADNA连接酶催化的连接反应是需要能量连接酶催化的连接反应是需要能量 的：在大肠杆菌或其他细菌中，利用的：在大肠杆菌或其他细菌中，利用NAD+NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），在动物细胞（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），在动物细胞 中及噬菌体中，利用中及噬菌体中，利用

3、ATPATP（腺苷三磷酸（腺苷三磷酸）。）。注意：注意：47474747第五页，讲稿共四十七页哦 T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶 大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶 T4噬菌体噬菌体RNA连接酶连接酶二、二、DNADNA连接酶的种类连接酶的种类第六页，讲稿共四十七页哦 T4T4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶 该酶最早是从该酶最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，是是T4噬菌体基因噬菌体基因30编码的产物，分子量为编码的产物，分子量为68ku，需要需要ATP作为辅助因子。作为辅助因子。两个带有互补粘性末端的双链两个带有互补粘性末端的双链DNA分子分子一

4、条带有切口的双链一条带有切口的双链DNA分子分子两个带有平头末端的双链两个带有平头末端的双链DNA分子分子DNA-RNA杂合体分子中切口杂合体分子中切口该该酶酶可可连连接接49494949第七页，讲稿共四十七页哦第八页，讲稿共四十七页哦 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶 该酶是从正常的大肠杆菌中提取的，由大肠杆菌该酶是从正常的大肠杆菌中提取的，由大肠杆菌基因组中基因组中lig基因编码，分子量为基因编码，分子量为75ku，需要，需要NAD+作为辅助因子。作为辅助因子。具有同源互补粘性末端的不同具有同源互补粘性末端的不同DNA分子分子 一条带有切口的双链一条带有切口的双链DNA分子分子该酶

5、可连接该酶可连接但但,该酶几乎不能催化两个平头末端该酶几乎不能催化两个平头末端DNADNA分子的连接分子的连接第九页，讲稿共四十七页哦T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶 该酶在该酶在DNA体外重组中体外重组中比比大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶应用应用广泛广泛(既能连接粘性末端既能连接粘性末端,也能连接平头末端也能连接平头末端).两两种种酶酶各各自自的的优优点点大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶:该酶的连接产物转化细菌后该酶的连接产物转化细菌后,假阳性背假阳性背景低景低(由于它对由于它对DNADNA末端的要求比较严格末端的要求比较严格-互补粘性末端互补粘性末端).).52第十页，讲稿共

6、四十七页哦 T4T4噬菌体噬菌体RNARNA连接酶连接酶 T4噬菌体噬菌体RNA连接酶由连接酶由T4噬菌体基因噬菌体基因63编码编码,需要需要ATP作为辅助因子作为辅助因子.连接反应连接反应:主要用途主要用途:对对RNARNA进行进行3 3末端标记末端标记,即将即将3232P P标记的标记的3 3,5,5-二二磷酸单核苷加到磷酸单核苷加到RNARNA的的3 3端端.该酶可催化单链该酶可催化单链DNADNA或或RNARNA的的5 5磷酸与相邻的磷酸与相邻的3 3 羟基、单核苷酸共价连接羟基、单核苷酸共价连接.53第十一页，讲稿共四十七页哦第三节第三节 DNADNA聚合酶聚合酶一、一、DNADNA

7、聚合酶的分类聚合酶的分类根据根据DNA聚合酶所使用模板的不同聚合酶所使用模板的不同,可分为可分为:依赖于依赖于DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶依赖于依赖于RNARNA的的DNADNA聚合酶聚合酶大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶KlenowKlenow大片段酶大片段酶T4T4噬菌体噬菌体 DNADNA聚合酶聚合酶T7T7噬菌体噬菌体 DNADNA聚合酶聚合酶Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶逆转录酶逆转录酶55第十二页，讲稿共四十七页哦 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶1.DNA1.DNA聚合酶的分类聚合酶的分类 目前目前,从大肠杆菌中已分离出从大肠杆菌中已分离出3

8、 3种种DNADNA聚合酶聚合酶,分别为分别为:DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶:与与DNADNA复制有关复制有关主要参与主要参与DNA的修复的修复分子克隆中常用分子克隆中常用DNADNA聚合酶聚合酶第十三页，讲稿共四十七页哦2.2.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的性质的性质 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶是是KronbergKronberg等等19561956年发现年发现的第一个的第一个DNADNA聚合酶聚合酶,故也称为故也称为KronbergKronberg酶酶.5 3DNA聚合酶活性聚合

9、酶活性 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶(DNApol)发挥聚合酶发挥聚合酶活性需要活性需要:DNADNA模板、引物、模板、引物、dNTP和和Mg2+2+。57第十四页，讲稿共四十七页哦2.2.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的性质的性质 3 5核酸外切酶活性核酸外切酶活性 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 该活性识别单链，能将复制过程中该活性识别单链，能将复制过程中3 3端的错端的错配碱基切除，从而保证配碱基切除，从而保证DNADNA复制的高保真度，也复制的高保真度，也称为校对功能。称为校对功能。DNADNApolpol5 53 35 558第十五页，讲稿共四十七页哦

10、 5 3核酸外切酶活性核酸外切酶活性 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶2.2.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的性质的性质5353553353553355335-P53535353553355335-P第十六页，讲稿共四十七页哦5 3外切核酸酶活性的水解作用有外切核酸酶活性的水解作用有3 3个特征个特征：待切除的核酸分子待切除的核酸分子必须必须具有具有5 5端磷酸基团端磷酸基团。核苷酸分子被切除核苷酸分子被切除前前位于位于已配对已配对的的DNADNA双螺双螺 旋区段上。旋区段上。被切除的核苷酸既可以是被切除的核苷酸既可以是DNA也可以是也可以是RNA.5 3核酸外切酶活性核酸外

11、切酶活性2.2.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的性质的性质第十七页，讲稿共四十七页哦2.2.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的用途的用途 合成合成ds-cDNAds-cDNA第二链（第二链（Double stranded)Double stranded)杂交探针的制备杂交探针的制备 DNADNA序列分析序列分析在在DNA聚合反应体系中，如果加入聚合反应体系中，如果加入放射性核素标记放射性核素标记的的核苷酸核苷酸，则这些标记的核苷酸将取代原来的核，则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残基，产生苷酸残基，产生带标记的带标记的DNA分子分子，这就是所谓，这就是所谓的的DNA分子杂交

12、探针分子杂交探针(书书P36P36）。第十八页，讲稿共四十七页哦杂交探针的制备过程杂交探针的制备过程:3553355335533*553*DNAaseE.Coli DNA pol*dNTP图图切切口口平平移移反反应应原原理理62第十九页，讲稿共四十七页哦 Klenow 片段片段1 1.Klenow 片段的由来片段的由来E.coli DNA pol 蛋白酶蛋白酶较小片段较小片段较大片段较大片段(Klenow片段片段)5 33 5聚聚 外外合合 切切酶酶 酶酶活活 活活性性 性性性质性质5 3外切酶活性外切酶活性第二十页，讲稿共四十七页哦1.Klenow 片段的由来片段的由来2.2.通常所用的通常

13、所用的Klenow片段片段是由是由枯草杆枯草杆菌蛋白酶菌蛋白酶切割切割完整完整的的DNA聚合酶片段聚合酶片段而成而成,或是或是经过经过克隆克隆产生的一条多肽链。产生的一条多肽链。Klenow 片段片段第二十一页，讲稿共四十七页哦 Klenow 片段片段2 2.Klenow 片段的用途片段的用途l 填补由填补由DNADNA限制酶反应产生的限制酶反应产生的凹陷凹陷3 3末端末端。l 用用 3232PdNTPPdNTP填补凹陷的填补凹陷的3 3末端，即末端，即DNADNA分分 子的子的末端标记（书末端标记（书P32P32）。l 在在cDNAcDNA克隆出来后，合成克隆出来后，合成cDNAcDNA第二

14、条链第二条链。l 用用SangerSanger双脱氧链末端终止法进行双脱氧链末端终止法进行DNADNA序列分序列分 析析等。等。65第二十二页，讲稿共四十七页哦 T4DNA聚合酶聚合酶1 1.T4 DNA聚合酶的性质聚合酶的性质T4DNA聚合酶的外切酶活性聚合酶的外切酶活性比比Klenow片段片段高高1001000倍倍与与Klenow片段片段不同不同具有具有5 5 3 3聚合酶活性聚合酶活性具有具有3 3 5 5外切酶活性外切酶活性与与Klenow片段片段相同相同不具有不具有5 5 3 3外切酶外切酶活性活性66第二十三页，讲稿共四十七页哦 T4DNA聚合酶聚合酶2 2.T4DNA聚合酶的用途

15、聚合酶的用途 填补或标记由限制酶切割填补或标记由限制酶切割DNADNA后产生的凹陷后产生的凹陷3 3末端，标记反应时需要高浓度的末端，标记反应时需要高浓度的dNTP，以，以保证聚合反应（填补）大于保证聚合反应（填补）大于3 3 5 5核酸外切酶核酸外切酶活性。活性。进行进行3 3突出末端的突出末端的DNADNA末端标记。末端标记。67第二十四页，讲稿共四十七页哦 T4DNA聚合酶聚合酶2 2.T4DNA聚合酶的用途聚合酶的用途 标记用作杂交探针的标记用作杂交探针的DNADNA片段。片段。由由3 3 5 5核酸外切酶活性部分酶切双链核酸外切酶活性部分酶切双链DNA，得，得到凹缺到凹缺3 3末端用

16、末端用 32P dNTP填补（取代合成）。填补（取代合成）。将双链将双链DNADNA的末端转化成平头末端。的末端转化成平头末端。利用利用T4DNAT4DNA聚合酶的聚合酶的3 3 5 5核酸外切酶活性从双链核酸外切酶活性从双链DNADNA上切除突出上切除突出3 3末端，在高浓度末端，在高浓度dNTPdNTP中模板上双链区的中模板上双链区的降解与合成达到平衡。降解与合成达到平衡。68第二十五页，讲稿共四十七页哦 Taq DNA聚合酶聚合酶 1.1.来源来源 Taq DNA聚合酶最初是从聚合酶最初是从耐热细菌耐热细菌Thermusaqraticus中纯化而得，因此是一种单中纯化而得，因此是一种单亚

17、基亚基耐热耐热的的依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶，现已广泛，现已广泛用于基因工程的操作中。用于基因工程的操作中。69第二十六页，讲稿共四十七页哦 Taq DNA聚合酶聚合酶70 2.2.性质性质 具有具有5 3聚合酶活性聚合酶活性 最适反应温度为最适反应温度为7580（据目的序列不（据目的序列不 同而不同）同而不同）Taq DNA聚合酶在聚合酶在60时其聚合酶活性时其聚合酶活性下下降降2 2倍倍，在，在37时时下降下降1010倍倍。第二十七页，讲稿共四十七页哦 Taq DNA聚合酶聚合酶 3.3.用途用途 Taq DNA聚合酶主要用于聚合酶主要用于聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCRPC

18、R），在体外扩增特定的），在体外扩增特定的DNADNA片段，片段，DNADNA或单或单链链cDNA都可作为起始模板。都可作为起始模板。但在使用中应注意：但在使用中应注意：Taq DNA聚合酶需要聚合酶需要Mg2+。磷酸缓冲液磷酸缓冲液抑制抑制该酶活性，应该酶活性，应避免避免使用。使用。71第二十八页，讲稿共四十七页哦 逆转录酶逆转录酶一、一般知识一、一般知识 依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶聚合酶或或RNA指导的指导的DNA聚合酶聚合酶。分子量约为。分子量约为1616万，由分子量分万，由分子量分别为别为6.26.2万和万和9.59.5万的两个结构相关的亚单位万的两个结构相关的亚单位组成。组成

19、。72第二十九页，讲稿共四十七页哦 逆转录酶逆转录酶二、来源二、来源 逆转录酶最主要的逆转录酶最主要的来源来源是是鸟类成髓细胞性白鸟类成髓细胞性白血病病毒血病病毒（AMV）。）。三、特性三、特性AMVAMV逆转录酶的活性逆转录酶的活性首先首先表现为表现为DNADNA聚合酶的活性聚合酶的活性.模板模板既可以是既可以是DNADNA,也可以是也可以是RNARNA.在以在以RNARNA为模板为模板是是称为称为RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性聚合酶活性,而以而以DNADNA为模板是为模板是则则叫做叫做DNADNA为指导的为指导的DNADNA聚合酶聚合酶.73第三十页，讲稿共四十七页哦 逆转

20、录酶逆转录酶三、特性三、特性 AMV逆转录酶的活性逆转录酶的活性其次其次表现为表现为RNaseH活活性性。此酶可以特异性此酶可以特异性降解降解RNA-DNA杂种双链中杂种双链中的的RNA部分。部分。另外，还具有另外，还具有DNA内切酶活性内切酶活性和和核酸结合活性。核酸结合活性。74第三十一页，讲稿共四十七页哦 逆转录酶逆转录酶四、用途四、用途 逆转录酶逆转录酶在基因工程中可用于在基因工程中可用于cDNA的合成的合成。即可将任何真核基因的即可将任何真核基因的mRNA经经反转录反转录形成形成cDNA拷贝拷贝,然后构建然后构建克隆克隆,大量大量扩增扩增,并并表达表达这种这种基因基因,从而为真核基因

21、的研究与其核遗传工程提供从而为真核基因的研究与其核遗传工程提供了一项必不可少的手段。了一项必不可少的手段。75第三十二页，讲稿共四十七页哦一、性质一、性质 末端转移酶末端转移酶催化催化脱氧核苷酸脱氧核苷酸添加到添加到DNA分分子的子的3 3-OH-OH末端末端。这很像这很像DNADNA聚合酶通过聚合酶通过5 5 3聚合聚合5-脱氧核脱氧核苷三磷酸合成一条苷三磷酸合成一条DNA链。所链。所不同不同的是末端转的是末端转移酶移酶不需要不需要模板模板。第四节第四节 末端转移酶末端转移酶76第三十三页，讲稿共四十七页哦二、用途二、用途主要用途是给主要用途是给载体载体和和外源外源DNADNA分别加上分别加

22、上互补互补的同聚的同聚物尾巴，以便二者在物尾巴，以便二者在体外体外连接。进行连接。进行DNA3DNA3-OH末端末端标记。标记。标记物可以是标记物可以是放射性放射性的，如的，如-32P-dNTP,也也可以可以是非放射性是非放射性的的,如如生物素生物素-11-dUTP（生物素和亲和生物素和亲和素）素）,它们可用于它们可用于DNA序列分析序列分析、DNase足迹分足迹分析析、分子杂交等实验中分子杂交等实验中。77第三十四页，讲稿共四十七页哦二、用途二、用途 进行同聚物接尾进行同聚物接尾 用末端转移酶给用末端转移酶给一群一群DNADNA分子分子3 3-OH-OH末端接上末端接上oligooligo（

23、dAdA）或或（dGdG）,给给另一群另一群DNADNA分子分子3 3-OH-OH末端末端接上接上oligooligo（dTdT）或或（dCdC）,混合混合这两群分子这两群分子,就能就能使末端转移酶接上的同聚物尾部使末端转移酶接上的同聚物尾部退火退火形成形成环状分子环状分子。这种方法称为这种方法称为同聚物接尾法同聚物接尾法。78第三十五页，讲稿共四十七页哦第五节第五节 核酸酶核酸酶 核酸酶是一类能降解核酸的水解酶，它在基核酸酶是一类能降解核酸的水解酶，它在基因工程操作中应用非常广泛。根据核酸酶对底因工程操作中应用非常广泛。根据核酸酶对底物作用的专一性，可将其分为三类：物作用的专一性，可将其分为

24、三类：l 核糖核酸酶（核糖核酸酶（RNase）：只作用于只作用于RNA。l 脱氧核糖核酸酶（脱氧核糖核酸酶（DNase）：只作用于只作用于DNADNA。l 核酸酶（核酸酶（nuclease）：既作用于既作用于DNA，又，又 作用于作用于RNA。79第三十六页，讲稿共四十七页哦一、核酸外切酶一、核酸外切酶（exo）exo是一种的是一种的单链核酸外切酶单链核酸外切酶，它能够从，它能够从5 5末端末端或或3 3末端末端降解降解DNADNA分子，产生出寡核苷酸短片分子，产生出寡核苷酸短片段，且不需要段，且不需要MgMg2+2+的参与。的参与。第三十七页，讲稿共四十七页哦二、核酸外切酶二、核酸外切酶（e

25、xo ）该酶可以从该酶可以从双链双链DNA的的3 3-OH-OH末端末端起逐一切去起逐一切去5 5单核酸单核酸,其作用底物为含切口或缺口的其作用底物为含切口或缺口的线性双链线性双链DNADNA和和开环开环DNADNA。作用后在双链。作用后在双链DNA上形成一条长上形成一条长的的单链区单链区,这种外切酶这种外切酶不能不能降解降解单链单链DNA和带和带突出突出3 3末端的双链末端的双链DNA。81第三十八页，讲稿共四十七页哦二、核酸外切酶二、核酸外切酶（exo ）第三十九页，讲稿共四十七页哦三、核酸酶三、核酸酶S1 1.1.基本知识基本知识 核酸酶核酸酶S1S1是从米粉状曲菌（是从米粉状曲菌（As

26、pergillus Aspergillus oryzaeoryzae）提取带的一种金属蛋白，分子量）提取带的一种金属蛋白，分子量32 00032 000（32 ku32 ku），相对耐热，催化反应通常需要），相对耐热，催化反应通常需要Zn2+和酸性条件，产生带和酸性条件，产生带5 5磷酸的寡核苷酸。磷酸的寡核苷酸。83838383第四十页，讲稿共四十七页哦2.2.特性特性 降解降解单链单链DNADNA或或RNARNA,包括双链分子中的单链区域包括双链分子中的单链区域(如如发夹结构发夹结构),),这种单链区域甚至可以小到这种单链区域甚至可以小到1 1个碱基对个碱基对的程度。的程度。降解单链降解单

27、链DNADNA的速度比的速度比RNARNA的速度的速度快快1010倍倍。降解发应的方式为降解发应的方式为内切内切和和外切外切。降解发应的降解发应的最适最适pH为为4.04.04.54.5。酶量酶量过大过大时，伴有时，伴有双链双链核酸的降解，该酶的双链降核酸的降解，该酶的双链降解活性仅为单链的解活性仅为单链的1/75 0001/75 000。第四十一页，讲稿共四十七页哦核酸酶核酸酶S1的基本反应的基本反应：内切单链内切单链DNA或或RNA第四十二页，讲稿共四十七页哦核酸酶核酸酶S1的基本反应的基本反应：内切带切口或缺口的双链内切带切口或缺口的双链DNA第四十三页，讲稿共四十七页哦3.3.用途（用

28、途（在在DNADNA上定位上定位RNARNA）第四十四页，讲稿共四十七页哦四、四、RNA酶酶A RNA酶酶A是一种是一种RNA限制酶，专一性地作用于限制酶，专一性地作用于单链单链RNA的的3 3端嘧啶残基，切开其与邻近核苷酸相连端嘧啶残基，切开其与邻近核苷酸相连的磷脂键。产物为带的磷脂键。产物为带3 3-P的的嘧啶和末端为嘧啶和末端为3-P嘧啶嘧啶的寡核苷酸。的寡核苷酸。从从DNA-RNADNA-RNA中切除未杂交的中切除未杂交的RNARNA区；区；图谱分析图谱分析DNADNA或或RNARNA上单碱基突变体；上单碱基突变体；确定确定RNARNA序列中胞嘧啶的位置进行序列中胞嘧啶的位置进行RNA

29、RNA测序测序.用用途途第四十五页，讲稿共四十七页哦五、五、RNA酶酶H 该酶也为该酶也为RNARNA限制酶，可水解限制酶，可水解RNA-DNARNA-DNA杂杂交分子中的交分子中的RNARNA链，产生链，产生5 5-P-P核苷酸核苷酸.cDNAcDNA第一条链合成的过程中除去第一条链合成的过程中除去RNA-DNARNA-DNA杂交分子杂交分子中的中的RNARNA链或进行第二条链合成前切割链或进行第二条链合成前切割RNARNA引物引物.检测检测RNA-DNARNA-DNA杂合体；杂合体；通过与寡聚通过与寡聚dTdT杂交，从杂交，从mRNAmRNA中除去多聚中除去多聚A A序列序列.特异性地切割与寡脱氧核苷酸结合的特异性地切割与寡脱氧核苷酸结合的RNARNA。用用途途第四十六页，讲稿共四十七页哦感谢大家观看第四十七页，讲稿共四十七页哦