LCMS-MS定量培训班D1.pdf

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1、API 串联四极杆质谱仪串联四极杆质谱仪Analyst软件定性、定量基础培训软件定性、定量基础培训朱怀恩朱怀恩N8008203488（免费）上海市田林路888号1号楼102室02/20/20102010 ASC2基础应用培训培训日程第一天第一天上午上午9:00-下午下午4:009:00-10:30，串联液质系统分析原理10:30-10:40，茶歇，茶歇10:40-11:30，串联液质系统分析原理（续）12:00-1:30，工作午餐，工作午餐1:30-2:00，仪器的日常维护2:15-4:30，实验操作练习 日常维护演示 PPG质量校准02/20/20102010 ASC3基础应用培训培训日程第

2、二天第二天上午上午9:00-下午下午4:009:00-10:30，Analyst软件概揽、定量分析流程简介10:30-10:40，茶歇，茶歇10:40-11:30，如何建立定量方法、定量列表及结果计算，Analyst软件的使用（电脑模拟演示11:30-12:00），总结与问题解答12:00-1:30，工作午餐，工作午餐1:30-4:00，实验操作练习 定量方法建立的基本流程02/20/20102010 ASC4基础应用培训培训日程第三天第三天上午上午9:00-下午下午4:009:00-10:30，定量分析思路与成功液质分析的经验10:30-10:40，茶歇，茶歇10:40-11:30 Anal

3、yst软件的使用（电脑模拟演示）常用Script功能简介 Analyst软件的使用（电脑模拟演示）计算器、数据库功能及其他问题解答12:00-1:30，工作午餐，工作午餐1:30-4:00，实验操作练习 定量方法建立的基本流程串联液质系统分析原理串联液质系统分析原理02/20/20102010 ASC6基础应用培训100200300400500600m/z0100%254.2194.2507.3334.3399.7质谱的基本概念 质谱是什么？质谱是什么？特殊的天平：称量离子的质量。质谱学：是一门研究气相离子结构、性质及反应行为的科学。质谱能做什么？质谱能做什么？定性：化合物的结构 定量：混合物

4、的组成 领域：化学、生物学、医学、药学、环境、物理、材料、能源等 质谱的独到之处是什么？质谱的独到之处是什么？Sensitivity 灵敏 Speed 快速 Specificity 特异 Stoichiometry 化学计量02/20/20102010 ASC7基础应用培训质谱技术：质谱技术：质谱分析过程：样品通过进样系统进入离子源，由于结构性质不同而电离为各种不同质荷比（m/z）的分子离子和碎片离子，而后，带有样品信息的离子碎片被加速进入质量分析器，不同的离子在质量分析器中被分离并按质荷比大小依次抵达检测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质量谱，也就是质谱(mass spectrum)。

5、质谱：按离子的质荷比的大小依次排列形成的图谱02/20/20102010 ASC8基础应用培训质谱是如何工作的样品引入样品引入离子化离子化质量分析器质量分析器质量分析质量分析检测器检测器检测数据分析检测数据分析离子源离子源+13301330133013401340134013501350135010010010075757550505025252500 0样品引入样品引入Method to vaporize sample Solid Liquid Vapor检测离子离子的形成(带电荷的离子)根据质荷比(m/z)分离质谱图质谱图02/20/20102010 ASC9基础应用培训样品引入方法样品引

6、入方法 连续进样，提供准确的低流速。允许连续的样品引入以便仪器的调谐和优化。分流进样，使用针泵和LC系统优化离子源和化合物参数。流动注射进样（FIA），没有柱子的情况下，使用LC高通量的优化离子源参数。液相色谱，使用LC在宽的流速范围下，分离、分析混合物02/20/20102010 ASC10基础应用培训液体流路数据/信号LC数据/信号工作站API 4000/4000 QTRAP三重四极杆/串联线性离子阱质谱仪02/20/20102010 ASC11基础应用培训API4000/4000QTRAP三重四极杆三重四极杆/串联线性离子阱质谱仪串联线性离子阱质谱仪检测器三级四极杆线性离子阱LINAC线

7、性加速碰撞室一级四极杆离子传输TurboV离子源02/20/20102010 ASC12基础应用培训API4000/4000QTRAP三重四极杆三重四极杆/串联线性离子阱质谱仪串联线性离子阱质谱仪检测器三级四极杆线性离子阱LINAC线性加速碰撞室一级四极杆离子传输TurboV离子源02/20/20102010 ASC13基础应用培训大气压离子化接口*(API)主要有3种大气压离子化接口：电喷雾电离(ESI)，样品通过保持在高压下的电喷雾针喷射出带电荷的液滴，最终演变成气态离子。此源是化合物在液相中离子化。我们的TurboIonSpray 离子源使用加热辅助气，保证了高流速。大气压化学电离(AP

8、CI)，样品被喷雾到加热室中，在电晕针帮助下使化合物在气相中离子化。大气压光电离(APPI)，是化合物在气相中离子化。我们的PhotoSpray 离子源也有加热的雾化气并使用UV辐射和掺杂剂（dopant）来诱导离子化。*大气压离子源（API)，是一种非常温和的、低能量离子化过程。02/20/20102010 ASC14基础应用培训离子源3.6e4Intensity,cpsMometasoneMinoxidilTIS0.51.01.52.02.53.03.5Time,min0.04.0e4Intensity,cps0.51.01.52.02.53.03.50.0Time,minMometaso

9、neMinoxidilAPCI02/20/20102010 ASC15基础应用培训电喷雾离子化(ESI)原理气帘气气帘气(CUR)蒸发蒸发库伦爆炸库伦爆炸离子喷雾电压离子喷雾电压(IS)雾化气雾化气(GS1)LC Flow形成带电液滴形成带电液滴Orifice(DP)质量分析器质量分析器真空区域大气压区域TurboHeater(TEM)/辅助加热气辅助加热气(GS2)1.2.3.1.形成带电液滴2.液滴蒸发，液滴里的场强增加3.离子从液滴中脱离，在接口处聚焦02/20/20102010 ASC16基础应用培训电喷雾离子化：形成带电液滴LCFlow+2-4kV电化学反应02/20/2010201

10、0 ASC17基础应用培训电喷雾离子化:溶剂蒸发和小液滴碎裂+溶剂蒸发液滴非均匀碎裂+.+02/20/20102010 ASC18基础应用培训电喷雾离子化：形成气相离子对于半径10nm的液滴,电荷的排斥作用导致离子从液滴表面蒸发而不是 液滴的分裂.离子从溶液中转移至气相 AH+AH+AH+AH+X-AAH+X-AH+AH+AAH+AH+AH+X-AH+AH+AH+X-AH+AH+AAH+X-AH+AH+r 10 nmAH+离子蒸发模式02/20/20102010 ASC19基础应用培训Turbo V 离子源(针对 API 3200，API 4000及API 5000 系统)垂直和水平方向可精细

11、调节 内置的气路和配线方便使用 直角设计保证了充分的去溶剂并提高了耐用性 对称的 750C 加热装置 含2个离子源:ESI&APCI02/20/20102010 ASC20基础应用培训参数优化喷针位置通常高于导管0.5至1mm根据流动相的比例和流速大小优化参数，高含水比例的流动相需要更高的温度和气流，离子源温度太低时易形成溶剂簇离子气帘气在不影响灵敏度的前提下可设定较高值，以保障仪器的抗污染及方法的重现性02/20/20102010 ASC21基础应用培训TurboIonSpray离子源指南 气帘气Curtain Gas(CUR),雾化气Nebulizer Gas(GS1),和辅助气Heate

12、r Gas(GS2)在不影响信号损失的前提下，气帘气设置的尽量高 在试验所用的LC流速下优化 喷射 对于 API 2000&API 3000 系统-不要对着孔喷射不要对着孔喷射!一般不依赖于化合物 在高流速下喷射须离孔远一些02/20/20102010 ASC22基础应用培训TurboIonSpray离子源指南 针电压 正离子:1500 到 5500V 负离子:-1500 至-4500V 温度(TEM)高流速需要高的温度 API2000，API3000：最高到500度 API3200，API4000，API5000：最高到750度02/20/20102010 ASC23基础应用培训TurboI

13、onSpray离子源指南(续)流速和溶剂组成 流速 2-400 L/min-API 2000&API 3000 系统 2-1000 L/min-API 3200,API 4000&API 5000 系统溶剂是100%水或100%有机相，仪器均可操作，但在有机相/水相下能达到最好的灵敏度02/20/20102010 ASC24基础应用培训TurboIonSpray离子源指南(续)ESI下的常用的溶剂组成 挥发性的缓冲液，如甲酸铵或醋酸铵(2 10 mM 最佳，超过20 mM会引起抑制)酸 0.1-1.0%乙酸 0.1%甲酸 正离子模式下最大0.1%TFA-可能引起抑制 不要在负离子模式下使用不要

14、在负离子模式下使用TFA02/20/20102010 ASC25基础应用培训离子源的选择ESI优点 适合范围广:分析离子型/极性化合物、难挥发或热不稳定性化合物多电荷离子的形成，可以分析高分子量化合物 灵敏度高缺点 在溶液中必须形成离子 流动相中缓冲盐的种类和浓度对灵敏度均有显著影响，因此流动相的选择非常重要 具有流速依赖性 基质抑制现象较为明显 放电现象02/20/20102010 ASC26基础应用培训电喷雾离子化(ESI)原理气帘气气帘气(CUR)蒸发蒸发库伦爆炸库伦爆炸离子喷雾电压离子喷雾电压(IS)雾化气雾化气(GS1)LC Flow形成带电液滴形成带电液滴Orifice(DP)质量

15、分析器质量分析器真空区域大气压区域TurboHeater(TEM)/辅助加热气辅助加热气(GS2)1.2.3.1.形成带电液滴2.液滴蒸发，液滴里的场强增加3.离子从液滴中脱离，在接口处聚焦02/20/20102010 ASC27基础应用培训大气压化学电离(APCI)的原理?毛细管样品送入加热管中?在加热管中溶剂挥发?加热管出口处放置电晕(Corona)放电针,使挥发出来的溶剂分子电离，形成等离子体。?等离子体与样品分子反应，生成M+H+或M-H-准分子离子。真空区域大气压区域气帘气气帘气(CUR)Orifice(DP)质量分析器质量分析器雾化气雾化气(GS1)LC Flow电晕放电针溶剂分子

16、电离电晕放电针溶剂分子电离电荷转移反应电荷转移反应目标化合物电离目标化合物电离02/20/20102010 ASC28基础应用培训Turbo V离子源的APCI 一个不用使用工具只要换探针就可以切换ESI和和APCI 的离子源 用手或螺丝起子就可调节的电晕针 电晕针一直在离子源中(显示ESI 探针）02/20/20102010 ASC29基础应用培训APCI 加热喷雾器指南加热喷雾器是高流速入口 0.2 2.0 mL/min-API 2000&API 3000 系统 0.05 2.0 mL/min-API 3200,API 4000&API 5000 系统 APCI 适合非极性热稳定的化合物

17、分子量 1300 amu 探针加热有助于蒸发需要电晕针诱导化学离子化02/20/20102010 ASC30基础应用培训APCI 加热喷雾器指南(续)电晕针位置稍偏离探针，对准孔气帘气(CUR)在不减少灵敏度的前提下设的尽量高缓冲液缓冲液/添加剂不需要离子化挥发性缓冲液最高50mM极性大的化合物可能降低极性低的化合物的灵敏度，比如TFA正离子模式下从分析物那里夺走电荷02/20/20102010 ASC31基础应用培训参数优化02/20/20102010 ASC32基础应用培训离子源的选择-APCI优点 有一定挥发性的中等极性或低极性的小分子化合物 对溶剂选择、流速和添加物的依赖性较小缺点 有

18、可能发生热裂解 样品需要有一定的挥发性 适合分析分子量小于2000 Da 的样品02/20/20102010 ASC33基础应用培训什么时候使用不同源ESIAPCIAPPI极性极性化合物极性分子量10110210310104105非极性非极性02/20/20102010 ASC34基础应用培训避免的事 盐干扰离子化并成簇，使质谱图变得复杂 强碱或季铵如三乙胺，在正离子模式下引起信号抑制 强酸如磺酸、硫酸和三氟乙酸 可能在负离子模式下引起信号抑制 非挥发性添加剂或缓冲液如磷酸盐导致加合物的产生，且污染物离子源 非挥发离对子试剂如十二烷基硫酸钠（SDS)引起严重的离子抑制02/20/2010201

19、0 ASC35基础应用培训废气排放废气排放氮气氮气/空气空气氮气氮气/空气空气废气排放装置废气排放装置02/20/20102010 ASC36基础应用培训API4000/4000QTRAP三重四极杆三重四极杆/串联线性离子阱质谱仪串联线性离子阱质谱仪检测器三级四极杆线性离子阱LINAC线性加速碰撞室一级四极杆离子传输TurboV离子源02/20/20102010 ASC37基础应用培训气帘气接口如何工作的？不带电荷的粒子的屏障不带电荷的粒子的屏障不带电荷的粒子的屏障不带电荷的粒子的屏障离子进入四级杆源于:压力梯度(离子、杂质)电场梯度(离子)防止中性分子和不挥发盐由于压力梯度进入四级杆，污染四

20、级杆提高仪器的抗污染能力及稳定性辅助样品去溶剂防止离子簇的产生分子涡轮泵分子涡轮泵SkimmerOrificeCurtain Plate气帘气气帘气气帘气气帘气Q0 area分子涡轮泵分子涡轮泵02/20/20102010 ASC38基础应用培训气帘气接口ATMOSPHERIC PRESSUREVACUUMCURDPSKFPATMOSPHERIC PRESSUREVACUUMCURDPSKFPN2ATMOSPHERIC PRESSUREVACUUMCURDPSKFPN2+ATMOSPHERIC PRESSUREVACUUMCURDPSKFPN2+ATMOSPHERIC PRESSUREVACU

21、UMCURDPSKFPN2+ATMOSPHERIC PRESSUREVACUUMCURDPSKFPN2+ATMOSPHERIC PRESSUREVACUUMCURDPSKFPN2+ATMOSPHERIC PRESSUREVACUUMCURDPSKFPN2+ATMOSPHERIC PRESSUREVACUUMCURDPSKFPN2+大气压区域真空区域CURDPSKFPN2+Q0LC流速大时，流速大时，CUR抗污染助气化抗污染助气化DP：不同化合物，不同化合物，DP不同，应分别优化不同，应分别优化DP设置过大，化合物会被部分打碎设置过大，化合物会被部分打碎源内裂解源内裂解02/20/2010201

22、0 ASC39基础应用培训API4000/4000QTRAP三重四极杆三重四极杆/串联线性离子阱质谱仪串联线性离子阱质谱仪检测器三级四极杆线性离子阱LINAC线性加速碰撞室一级四极杆离子传输TurboV离子源02/20/20102010 ASC40基础应用培训四极杆质量分析器+DC/RF 电场选择过滤离子02/20/20102010 ASC41基础应用培训单四极杆质谱工作模式选择离子监测选择离子监测(SIM)全扫描全扫描02/20/20102010 ASC42基础应用培训Analyst中单四极杆扫描模式类型Q1 MSStart Stop Scan Full Scanmethod inputan

23、alysis outputmass range scan timeQ1 Center WidthQ1 MIMultiple Ion Modemass width scan timeMassdwell timeintensity200600m/zintensity200600m/zintensity010timeQ3 MS,Q3 center width,Q3 MI 三种扫描方式的操作方法与Q1完全相同Multiple Start Stop Scans02/20/20102010 ASC43基础应用培训API4000/4000QTRAP三重四极杆三重四极杆/串联线性离子阱质谱仪串联线性离子阱质谱

24、仪检测器三级四极杆线性离子阱LINAC线性加速碰撞室一级四极杆离子传输TurboV离子源02/20/20102010 ASC44基础应用培训串联四极杆质谱的工作模式扫描 Q1 和 Q3同时计算质量数差异中性丢失扫描子离子扫描过滤母离子扫描子离子扫描母离子母离子扫描过滤子离子多反应监测(MRM)过滤母离子过滤子离子02/20/20102010 ASC45基础应用培训碰撞气碰撞气MRM原理母离子母离子子离子子离子Q1 质量过滤器Q2Q3 质量过滤器02/20/20102010 ASC46基础应用培训串联四极杆质谱的核心技术碰撞反应池对于串联四极杆质谱，单位时间内监测的MRM通道的多少，即在一次采样

25、中可同时测定MRM的数目，被认为是仪器效率高低的标志。事实上，“可同时测定MRM的数目”就是通常所说的串联四极杆质谱的“快慢”。一台串联四极杆质谱更“快”，就是指在单位时间内能监测的MRM数目更多。而且，一台更快的串联四极杆质谱仪，就要求碰撞反应池足够快地将前一个母离子产生的子离子“赶”出去，并允许下一个母离子进入。如果，碰撞反应池没来得及将前一个母离子产生的子离子“赶”出去，就把下一个母离子放入，那么我们就无从分辨哪些子离子是前一个母离子产生的，而哪些是后者产生的。这就被称为串联四极杆质谱仪的交叉干扰。归根结底，串联四极杆质谱仪MRM工作的快慢与四极杆质量扫描速度没有任何直接关联，决定MRM

26、工作效率的瓶颈在于碰撞反应池！02/20/20102010 ASC47基础应用培训LINAC/LINAC/高压碰撞室高压碰撞室-无交叉污染，有效消除有效消除“假阳性假阳性”Low Gas PressureHigh Gas Pressure,Collisional FocusingHigh Pressure8 mTorrHigh Pressure8 mTorrLINAC线性离子加速碰撞池技术 高（气）压碰撞池设计使离子连续加速，快速通过碰撞池 提高灵敏度 MRM模式下（定量），允许减少离子驻留时间，而不损失灵敏度“n in 1”MRM up to 300 pairs 提高分析速度 有效消除“记忆

27、效应”增加分析结果可靠性02/20/20102010 ASC48基础应用培训碰撞室入口碰撞室出口field on center line 5.75 vfield on center line 4.25 v碰撞室入口碰撞室出口+5.75 v+4.25 v+1.5v 连续梯度电场由四极杆摆放位置而形成梯度电场线性离子加速技术 LINAC02/20/20102010 ASC49基础应用培训300个个MRM同时测定同时测定XIC of+MRM(297 pairs):226.2/170.0 amu from Sample 1(MRMs 100)of Data MRM pesticides_02.wiff

28、(Turbo Spray)Max.1.1e6 cps.1234567891011121314151617181920212223Time,min0.005.00e41.00e51.50e52.00e52.50e53.00e53.50e54.00e54.50e55.00e55.50e56.00e56.50e57.00e57.50e58.00e58.50e59.00e59.50e51.00e61.05e611.7902/20/20102010 ASC50基础应用培训API4000/4000QTRAP三重四极杆三重四极杆/串联线性离子阱质谱仪串联线性离子阱质谱仪检测器三级四极杆线性离子阱LINAC线性加速碰撞室一级四极杆离子传输TurboV离子源02/20/20102010 ASC51基础应用培训API4000/4000QTRAP三重四极杆三重四极杆/串联线性离子阱质谱仪串联线性离子阱质谱仪检测器三级四极杆线性离子阱LINAC线性加速碰撞室一级四极杆离子传输TurboV离子源02/20/20102010 ASC52基础应用培训02/20/20102010 ASC53基础应用培训结束