生物芯片技术及其发展精.ppt
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1、生物芯片技术及其发展第1页,本讲稿共44页生物芯片的定义生物芯片的定义生生物物芯芯片片(BiochipBiochip或或BioarrayBioarray)是是指指包包被被在在固固相相载载体体上上的的高高密密度度DNADNA、抗抗原原、抗抗体、细胞或组织的微点阵体、细胞或组织的微点阵(microarray(microarray)。)。生物芯片包括生物芯片包括DNADNA芯片、抗原芯片、抗体芯片、抗原芯片、抗体芯片、细胞芯片、组织芯片等。芯片、细胞芯片、组织芯片等。19981998年世界十大科技突破之一。年世界十大科技突破之一。未来十年最具发展潜力的技术。未来十年最具发展潜力的技术。第2页,本讲稿
2、共44页特点特点高度并行性:提高实验进程、利于显示高度并行性:提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。图谱的快速对照和阅读。多样性:可进行样品的多方面分析,多样性:可进行样品的多方面分析,提高精确性,减少误差。提高精确性,减少误差。微型化:减少试剂用量和反应液体微型化:减少试剂用量和反应液体积,提高样品浓度和反应速率。积,提高样品浓度和反应速率。自动化:降低成本,保证质量。自动化:降低成本,保证质量。第3页,本讲稿共44页生物芯片分类生物芯片分类尚未统一。尚未统一。广义上:矩阵型芯片、处理型芯片广义上:矩阵型芯片、处理型芯片固化材料:基因芯片、蛋白质芯片、固化材料:基因芯片、蛋白质芯片、细
3、胞芯片、组织芯片细胞芯片、组织芯片第4页,本讲稿共44页研究历史研究历史1991 Affymatrix1991 Affymatrix公司公司Stephen Fodor:Stephen Fodor:光刻与光化学技光刻与光化学技术、术、多肽和寡聚核苷酸微阵列。多肽和寡聚核苷酸微阵列。DNA ChipDNA Chip概念概念 StanfordStanford大学大学BrownBrown实验室:预先合成,机械手阵列实验室:预先合成,机械手阵列1995 Schena1995 Schena等:基因表达谱等:基因表达谱1996 Chee et al1996 Chee et al:DNADNA测序测序1996
4、 Cronin et al1996 Cronin et al:突变检测:突变检测1996 Sapolsley&Lipshutz1996 Sapolsley&Lipshutz:基因图克隆:基因图克隆1996 Shalon et al1996 Shalon et al:复杂:复杂DNADNA样本分析样本分析1996 Shoemaker et al1996 Shoemaker et al:缺省突变定量表型分析:缺省突变定量表型分析第5页,本讲稿共44页分类(根据应用)分类(根据应用)基因变异检测芯片基因变异检测芯片疾病检测疾病检测(如如HIVHIV、P53P53基因、结核杆菌基因、结核杆菌)法医鉴定
5、法医鉴定(如如DNADNA指纹图谱指纹图谱)表达谱芯片表达谱芯片肿瘤相关基因肿瘤相关基因(正常与肿瘤组织表达差异正常与肿瘤组织表达差异)药物筛选药物筛选(培养细胞药物刺激前后表达差异培养细胞药物刺激前后表达差异)发育发育(同一组织不同发育时期基因表达差异同一组织不同发育时期基因表达差异)组织发生组织发生(不同组织或器官的基因表达差异不同组织或器官的基因表达差异)第6页,本讲稿共44页分类(根据工艺和载体)分类(根据工艺和载体)原位合成法:原位合成法:密集程度高,可合成任意序列的密集程度高,可合成任意序列的寡聚核苷酸,但特异性较差,寡聚核苷酸合成长度寡聚核苷酸,但特异性较差,寡聚核苷酸合成长度有
6、限,且随长度增加,合成错误率增高。成本较高,有限,且随长度增加,合成错误率增高。成本较高,设计和制造较烦琐费时。设计和制造较烦琐费时。DNADNA微矩阵法:微矩阵法:成本低,易操作,点样密度通常成本低,易操作,点样密度通常能满足需要。芯片的载体需表面紧质、光滑的固体,能满足需要。芯片的载体需表面紧质、光滑的固体,如硅,陶,玻璃等,如硅,陶,玻璃等,DNADNA微矩阵芯片常用玻片为载体。微矩阵芯片常用玻片为载体。第7页,本讲稿共44页分类(根据分类(根据DNADNA成分)成分)寡聚核苷酸或寡聚核苷酸或DNADNA片段:约片段:约2020 2525个核个核苷酸碱基,常用于基因类型的分析,苷酸碱基,
7、常用于基因类型的分析,如突变、正常变异(多态性)。如突变、正常变异(多态性)。全部或部分全部或部分cDNAcDNA:约:约500500 50005000个核苷个核苷酸碱基,通常用于两种或以上样本的酸碱基,通常用于两种或以上样本的相关基因表达分析。相关基因表达分析。第8页,本讲稿共44页基因芯片的种类基因芯片的种类Science ChipScience Chip:生物分析和诊断。生物分析和诊断。Nutri ChipNutri Chip:食物分析、转基因、污染检测。:食物分析、转基因、污染检测。Leuko ChipLeuko Chip:血液分析、病毒分析、:血液分析、病毒分析、HLAHLA分析。分
8、析。Aqua ChipAqua Chip:水质分析。:水质分析。Secure ChipSecure Chip:含:含DNADNA的物质鉴定。的物质鉴定。Chromo ChipChromo Chip:基因分析和染色体序列。:基因分析和染色体序列。Prokaryo ChipProkaryo Chip:原核生物、兽医、环保等。:原核生物、兽医、环保等。第9页,本讲稿共44页生物芯片技术主要环节生物芯片技术主要环节芯片制备:微点阵芯片制备:微点阵样本制备:样本制备:DNADNA提纯、扩增、标记提纯、扩增、标记杂交:样本与互补模板形成双链杂交:样本与互补模板形成双链检测:共聚焦扫描,双色激光检测:共聚焦
9、扫描,双色激光数据处理:定量软件,数据库检索,数据处理:定量软件,数据库检索,RNARNA印迹等。印迹等。结果结果 第10页,本讲稿共44页生物芯片分析生物芯片分析1 1、测定过程应包括五个基本步骤:、测定过程应包括五个基本步骤:需解决的生物学问题需解决的生物学问题样本制备样本制备生物化学反应生物化学反应检测检测数据分析数据分析第11页,本讲稿共44页2 2、生物学系统控制必须精确地与检测目的相匹配。、生物学系统控制必须精确地与检测目的相匹配。3 3、生物学样本必须精确地与生物学种类相匹配。、生物学样本必须精确地与生物学种类相匹配。4 4、所有基因分析必须平行处理。、所有基因分析必须平行处理。
10、5 5、基因分析技术必须适合微型化和自动化。、基因分析技术必须适合微型化和自动化。6 6、平行格式必须精确的依据生物学样本的次序。、平行格式必须精确的依据生物学样本的次序。7 7、检测系统必须能精确地获得数据。、检测系统必须能精确地获得数据。8 8、检测系统获得的数据必须能被精确地控制和重复。、检测系统获得的数据必须能被精确地控制和重复。第12页,本讲稿共44页9 9、两种或以上平行数据组比较应受到单、两种或以上平行数据组比较应受到单 个实验所固有特性的限制。个实验所固有特性的限制。1010、绝对比例关系只存在于组合实验的平、绝对比例关系只存在于组合实验的平 行数据组内。行数据组内。1111、
11、平行格式包括内在和外部的整个系统、平行格式包括内在和外部的整个系统 误差的分析因素。误差的分析因素。1212、在每个系统模块中采集到该系统所有、在每个系统模块中采集到该系统所有 变量的四维数据时,才能称为完成生变量的四维数据时,才能称为完成生 物系统平行基因分析。物系统平行基因分析。第13页,本讲稿共44页生物芯片技术的生物芯片技术的1212条原则只是一个基本框架。条原则只是一个基本框架。其术语的详细定义和有关理论可参见其术语的详细定义和有关理论可参见http:/cmgm.stanford.edu/schena/http:/cmgm.stanford.edu/schena/http:/ sit
12、u synthesis):in situ synthesis):又可分为原位又可分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法。适用于寡核光控合成法和原位标准试剂合成法。适用于寡核苷酸,使用光引导化学原位合成技术。是目前制苷酸,使用光引导化学原位合成技术。是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法。造高密度寡核苷酸最为成功的方法。合成后交联(合成后交联(post-synthetic attachment):post-synthetic attachment):利利用手工或自动点样装置将预先制备好的寡核苷酸用手工或自动点样装置将预先制备好的寡核苷酸或或cDNAcDNA样品点在经特殊处理过的玻片或其他材料样品
13、点在经特殊处理过的玻片或其他材料上。主要用于诊断、检测病原体及其他特殊要求上。主要用于诊断、检测病原体及其他特殊要求的中、低密度芯片的制备。的中、低密度芯片的制备。第15页,本讲稿共44页两种制备方法比较原位合成:原位合成:测序、查明点突变测序、查明点突变高密度、根据已知的高密度、根据已知的DNADNA编制程序编制程序制作复杂、价格昂贵、不能测定未知制作复杂、价格昂贵、不能测定未知DNADNA序列序列合成后交联:合成后交联:比较分析比较分析制备方式直接和简单,点样的样品可事先纯化,制备方式直接和简单,点样的样品可事先纯化,交联方式多样,可设计和制备符合自己需要的芯片。交联方式多样,可设计和制备
14、符合自己需要的芯片。中、低密度,样品浪费较多且制备前需储存大量样品。中、低密度,样品浪费较多且制备前需储存大量样品。第16页,本讲稿共44页杂交杂交是芯片技术中除方阵构建外最重要的一步是芯片技术中除方阵构建外最重要的一步液相中探针与液相中探针与DNADNA片段按碱基配对规则形成片段按碱基配对规则形成双链反应。双链反应。选择杂交条件时,必须满足检测时的灵敏度选择杂交条件时,必须满足检测时的灵敏度和特异性。使能检测到低丰度基因,且能保和特异性。使能检测到低丰度基因,且能保证每条探针都能与互补模板杂交。证每条探针都能与互补模板杂交。合适长度的合适长度的DNADNA有利于与探针杂交。有利于与探针杂交。
15、温度、非特异性本底等均会影响杂交结果。温度、非特异性本底等均会影响杂交结果。最好在封闭循环条件下杂交,杂交炉。最好在封闭循环条件下杂交,杂交炉。第17页,本讲稿共44页样本制备样本制备制备高质量样本是困难的但又是极其重要的。制制备高质量样本是困难的但又是极其重要的。制备细胞、组织或整个器官样本应特别小心。温度、备细胞、组织或整个器官样本应特别小心。温度、激素和营养环境、遗传背景、组织成分等轻微改激素和营养环境、遗传背景、组织成分等轻微改变都会使基因表达的结果发生明显变化。变都会使基因表达的结果发生明显变化。用于基因类型分析的样本是用于基因类型分析的样本是DNADNA,用于表达研究的样,用于表达
16、研究的样本是本是cDNAcDNA。样本制备后应进行标记,通常为酶标记、荧光标样本制备后应进行标记,通常为酶标记、荧光标记和核素标记。记和核素标记。第18页,本讲稿共44页结果分析结果分析 芯片与标记的靶芯片与标记的靶DNADNA或或RNARNA杂交后,或与标记的靶抗原杂交后,或与标记的靶抗原或抗体结合后,可采用下列方法分析处理数据:或抗体结合后,可采用下列方法分析处理数据:共聚焦扫描仪:应用最广,重复性好但灵敏度较低。共聚焦扫描仪:应用最广,重复性好但灵敏度较低。质谱法:快速、精确,可准确判断是否存在基因质谱法:快速、精确,可准确判断是否存在基因突变和精确判断突变基因的序列位置。探针合成突变和
17、精确判断突变基因的序列位置。探针合成较复杂。较复杂。化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接电化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接电荷变化检测等。荷变化检测等。第19页,本讲稿共44页芯片扫读装置芯片扫读装置根据采用的光电偶合器件,分为光电倍根据采用的光电偶合器件,分为光电倍增管型和增管型和CCDCCD型。型。根据激光光源,可分为激光型和非激光根据激光光源,可分为激光型和非激光型。型。应用最为广泛的是激光光源的共聚焦扫应用最为广泛的是激光光源的共聚焦扫描装置,分辨率、灵敏度极高,有良好描装置,分辨率、灵敏度极高,有良好的定位功能,可定量,应用广泛。的定位功能,可定量,应用广泛。第20页,本
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- 生物芯片 技术 及其 发展
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