动物基因组和的提取优秀PPT.ppt

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1、动物基因组和的提取第1页，本讲稿共52页原理原理1、核酸的分类、核酸的分类 DNA(DNA(脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸)主要存在于细胞核的染色体中。主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量核外也有少量DNADNA，如线粒体，如线粒体DNADNA（mtDNAmtDNA），叶绿体），叶绿体DNADNA（cpDNAcpDNA），质粒），质粒DNADNA。RNA RNA（核糖核酸）（核糖核酸）存在于细胞质中，如存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNAmRNA,rRNA,tRNA等。等。除上述除上述DNADNA，RNARNA外，外，还有非细胞形式存在的病毒和噬还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只

2、含菌体，其或只含DNADNA，或只含有，或只含有RNARNA。第2页，本讲稿共52页核酸的理化性质核酸的理化性质在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在2、核酸制备的一般原则、核酸制备的一般原则微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。较稳定。DNADNA溶液粘度很大，溶液粘度很大，RNARNA的粘度较小的粘度较小在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来第3页，本讲稿共52页分离纯化核酸

3、总的原则：分离纯化核酸总的原则：2、核酸制备的一般原则、核酸制备的一般原则核酸纯化应达到的要求：核酸纯化应达到的要求：核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶有机溶剂剂和过高浓度的和过高浓度的金属离子金属离子；其它生物大分子的污染应降低到最低程度；其它生物大分子的污染应降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。应保证核酸一级结构的完整性；应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子排除其它分子(蛋白，脂类，多糖类蛋白，脂类，多糖类)的污染。的污染。第4页，本讲稿共52页核酸制备时应注意的事项核酸制备时应注意的事项:尽量简化操作步骤，缩短提取过

4、程。尽量简化操作步骤，缩短提取过程。减少化学因素对核酸的降解。减少化学因素对核酸的降解。减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解：排除防止核酸的生物降解：排除核酸酶核酸酶。第5页，本讲稿共52页 降低温度，改变降低温度，改变pHpH及盐的浓度，都利于对核酸及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。利，当然，几个条件并用更好。对于对于DNADNA，抑制，抑制DNaseDNase活力很容易，但防止机活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。械张

5、力拉断则更重要。对于对于RNARNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制但抑制RNaseRNase活力较难，故在活力较难，故在RNARNA提取中设法抑制提取中设法抑制RNaseRNase更重要。更重要。核酸酶的抑制和抑制剂核酸酶的抑制和抑制剂 第6页，本讲稿共52页lDNase抑制抑制 加入少量金属离子螯合剂，如加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA0.01 mol/L EDTA或柠檬或柠檬酸钠，酸钠，DNaseDNase基本可以全部失活。基本可以全部失活。去垢剂、蛋白变性剂及去垢剂、蛋白变性剂及DNaseDNase抑制剂也可使抑制剂也可使

6、DNaseDNase失活。失活。第7页，本讲稿共52页lRNase抑制抑制 操作要带手套。操作要带手套。所有器皿要严格消毒，所有器皿要严格消毒，试剂处理试剂处理 低温操作低温操作 在分离过程中要加入一定的在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。抑制剂。第8页，本讲稿共52页常用的常用的RNA酶抑制剂酶抑制剂 焦磷酸二乙酯（焦磷酸二乙酯（DEPC）抑制强烈、不彻底抑制强烈、不彻底 异硫氰酸胍异硫氰酸胍有效抑制、分解核蛋白有效抑制、分解核蛋白氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物有效抑制有效抑制RNA酶的蛋白抑制剂（酶的蛋白抑制剂（RNasin）有效抑制有效抑制其它：其它：SDS、尿素、硅藻土等、

7、尿素、硅藻土等有效抑制有效抑制上述大部分试剂有致癌之嫌，应谨慎操作！上述大部分试剂有致癌之嫌，应谨慎操作！第9页，本讲稿共52页l核酸制备中常用的去垢剂核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。去垢剂的作用：去垢剂的作用：1 1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2 2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；出来；3 3对对RNase、DNase有一定的抑制作用。有

8、一定的抑制作用。如：如：SDS、脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钠、4-4-氨基水杨酸钠、萘氨基水杨酸钠、萘-1.5-1.5-二二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠第10页，本讲稿共52页 作用：作用：1.1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。造成蛋白污染。2.2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.3.某些蛋白质变性剂也有抑制某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的活性和破裂细胞的作用。作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC核酸

9、制备中常用的蛋白质变性剂核酸制备中常用的蛋白质变性剂第11页，本讲稿共52页l核酸制备中常用的酶核酸制备中常用的酶 DNase:降解降解DNADNA RNase：降解：降解RNARNA 蛋白酶蛋白酶K K：降解蛋白质：降解蛋白质 溶菌酶溶菌酶：破碎细胞破碎细胞 第12页，本讲稿共52页3.核酸制备的一般步骤：核酸制备的一般步骤：破碎组织细胞破碎组织细胞破碎组织细胞破碎组织细胞提取提取提取提取纯化纯化纯化纯化I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂

10、质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中第13页，本讲稿共52页1 1）破碎细胞）破碎细胞（防止核酸酶的作用）（防止核酸酶的作用）微生物微生物：溶菌酶、：溶菌酶、SDSSDS裂解。裂解。高等植物高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物动物：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。细胞器细胞器DNADNA：首先纯化细胞器。：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂

11、第14页，本讲稿共52页2 2）破碎抽提核酸除去杂质）破碎抽提核酸除去杂质首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离白与其它成分分离使核酸与蛋白质分离使核酸与蛋白质分离除去脂类除去脂类 多糖的除去多糖的除去第15页，本讲稿共52页 3 3）核酸的纯化）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染染,并除去提取过程中的系列试剂并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。第16页，本讲稿共52页4 4）核酸样品的保存）核酸样

12、品的保存 核酸保存的主要条件是核酸保存的主要条件是温度温度和和介质介质 温度温度：4 4 样品经常使用样品经常使用 -70 -70是长期保存的良好温度，为一次性保存是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20 -20保存保存,避免反复冻融避免反复冻融 保存介质保存介质：灭菌水灭菌水 TETE缓冲溶液缓冲溶液(最常用最常用)：10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0第17页，本讲稿共52页一、动物基因组一、动物基因组DNA的提取的提取主要方法：主要方法：(1)浓盐法浓盐法利用利用RNP和和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。

13、1）用）用1M氯化钠提取氯化钠提取,得到的得到的DNP粘液粘液2)与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化使乳化3)离心除去蛋白质离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而中间，而DNA位于上层水相中位于上层水相中4)用用2倍体积倍体积95%乙醇可将乙醇可将DNA钠盐沉淀出来钠盐沉淀出来第18页，本讲稿共52页一、动物基因组一、动物基因组DNA的提取的提取（2）阴离子去污剂法）阴离子去污剂法:用用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以可以直接从生物材料中提取直接从生物材料中提取DNA。由

14、于细胞中由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合键结合,而阴离子去污剂能够破坏这种价键而阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用所以常用阴离子去污剂提取阴离子去污剂提取DNA。第19页，本讲稿共52页一、动物基因组一、动物基因组DNA的提取的提取（3）苯酚抽提法）苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了同时抑制了DNase的降解作用。的降解作用。用苯酚处理匀浆液时用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与由于蛋白与DNA连接键已断连接键已断,蛋白蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚

15、相，而蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含层，多次重复操作，再合并含DNA的水相。的水相。利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是使。此法的特点是使提取的提取的DNA保持天然状态保持天然状态。第20页，本讲稿共52页DNA的提取：的提取：苯酚抽提法苯酚抽提法1.材料、设备及试剂材料、设备及试剂材料：材料：冷冻或新鲜抗凝全血，组织样冷冻或新鲜抗凝全血，组织样设备：设备：EP管、微量取液器管、微量取液器(20l,200l,1000l)，台式高速离心机，台式高速离心机，涡旋振荡器涡旋振

16、荡器试剂：试剂：裂解液裂解液lysisbuffer（40mMTris-醋酸，醋酸，20mM醋酸钠醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、）、Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇、饱和酚、氯仿、异戊醇、NaAC、RNA酶、无水乙醇、灭菌水酶、无水乙醇、灭菌水第21页，本讲稿共52页1）在在500l抗凝血中加入抗凝血中加入lysisbuffer1000l，充分颠混至，充分颠混至清亮。以清亮。以4000rpm，离心，离心5min。弃上清液。弃上清液。2）沉淀中加入沉淀中加入lysisbuffer1500l，充分匀浆。以，充分匀浆。以6000rpm，离心，离心5min。3）彻底弃去上清，加入彻底弃

17、去上清，加入extractionbuffer500l（裂解细胞）（裂解细胞），混匀置于，混匀置于37，水溶，水溶1h。4）加入加入8l的蛋白酶的蛋白酶K，颠混，颠混，37过夜（或过夜（或55，3h，但是，但是37效果要好些）。效果要好些）。5）每管加入每管加入450l饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以以5500rpm，离心，离心15min。2.操作步骤（血样）操作步骤（血样）第22页，本讲稿共52页6）取上清，每管加入取上清，每管加入250l饱和酚和饱和酚和250l氯仿异戊醇（氯仿异戊醇（24：1），），摇匀摇匀10min，以，以5500rpm，离心，离心1

18、5min。7）取上清，每管加入取上清，每管加入500l氯仿异戊醇，摇匀氯仿异戊醇，摇匀10min，以，以5500rpm，离，离心心15min。8）取上清，每管加取上清，每管加50l的的3M的的NaAC，适量无水乙醇（预冷）至满，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入摇匀放入-20保存保存2h以上。以上。9）以以12000rpm，离心，离心20min。去上清，加入。去上清，加入70乙醇乙醇500l，以以12000rpm，离心，离心5min，去上清，去上清，5060干燥。干燥。10）加入加入50l灭菌去离子水，转弹，混匀。灭菌去离子水，转弹，混匀。第23页，本讲稿共52页3.3.注意事项注意事项注意事

19、项注意事项材料准备材料准备材料准备材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融冻融提取血液基因组提取血液基因组DNADNA时，要选择有核细胞（白细时，要选择有核细胞（白细胞）胞）细胞培养时间不能过长，否则会造成细胞培养时间不能过长，否则会造成DNADNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较少，提取前先富集含量较少，提取前先富集第24页，本讲稿共52页3.3.注意事项注意事项注意事项注意事项细胞裂解细胞裂解细胞裂解细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致材料应适量，过多会影响裂解，导致DNADNA量少，量少，纯度低纯度

20、低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡第25页，本讲稿共52页3.3.注意事项注意事项注意事项注意事项核酸分离、纯化核酸分离、纯化核酸分离、纯化核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应时，应提供相应的缓冲体系的缓冲体系采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔轻柔离心分离

21、两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法杂质的方法第26页，本讲稿共52页3.3.注意事项注意事项注意事项注意事项核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分分沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀），有利于充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNA

22、，让乙醇充分挥发（不要过分干燥），让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNasepH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解第27页，本讲稿共52页DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质DNADNA在溶解前，有酒精在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶残留，酒精抑制后续酶解反应解反应DNADNA中残留有金属中残留有金属离子离子重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等杂质白、多糖、多酚等杂质重新沉淀重新沉淀DNA

23、DNA，让酒精，让酒精充分挥发充分挥发增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数（次数（2-32-3次）次）4.DNA4.DNA4.DNA4.DNA提取常见问题提取常见问题提取常见问题提取常见问题q问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。原因原因对对策策第28页，本讲稿共52页材料不新鲜或反复冻融材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的未很好抑制内源核酸酶的活性活性提取过程操作过于剧烈，提取过程操作过于剧烈，DNADNA被机械打断被机械打断外源核酸酶污染外源核酸酶污染DNADNA样品反复冻融样品反复冻融尽量取新鲜材料，低温保存材料避免

24、反尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNADNA时，时，可增加裂解液中螯合剂的含量可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将将DNADNA分装保存于缓冲液中，避免反分装保存于缓冲液中，避免反复冻融复冻融q问题二：问题二：DNADNA降解降解对对策策原因原因5.DNA5.DNA5.DNA5.DNA提取常见问题提取常

25、见问题提取常见问题提取常见问题第29页，本讲稿共52页实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分沉淀不完全沉淀不完全洗涤时洗涤时DNADNA丢失丢失尽量选用新鲜（幼嫩）的材料尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；细菌、酵母裂动植物要匀浆研磨充分；细菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加胞、细菌可增加PKPK的用量）的用量）低温沉淀，延长沉淀时间低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，洗涤时，最好用

26、枪头将洗涤液吸出，勿倾倒勿倾倒q问题三：问题三：DNADNA提取量少提取量少对对策策原因原因5.DNA5.DNA5.DNA5.DNA提取常见问题提取常见问题提取常见问题提取常见问题第30页，本讲稿共52页Plasmid DNA Extraction(Midiprep).flvmRNA Extraction from Total RNA.flv第31页，本讲稿共52页1 1材料：材料：组织或者细胞组织或者细胞2.2.方法：方法：TRIzol法，试剂盒法，试剂盒二二.动物基因组总动物基因组总RNA的提取的提取第32页，本讲稿共52页总总RNA提取试剂盒提取试剂盒亚硫氢胍，巯基乙醇，亚硫氢胍，巯基乙

27、醇，n-月桂肌氨酸月桂肌氨酸：变性细胞内变性细胞内及核蛋及核蛋白复合物，释放白复合物，释放RNA；有效抑制核酸酶。；有效抑制核酸酶。苯酚：氯仿：异戊醇苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（）（pH4.7）：）：酸平衡苯仿可酸平衡苯仿可抽提去除杂物。抽提去除杂物。DNA及蛋白沉淀到有机相，及蛋白沉淀到有机相，RNA留在水相。留在水相。酸性有机溶剂的抽提可免除用氯化锂选择沉淀酸性有机溶剂的抽提可免除用氯化锂选择沉淀RNA。用锂沉淀。用锂沉淀导致小于导致小于5.8sRNA的丢失，并不利于下游操作。的丢失，并不利于下游操作。乙酸钠乙酸钠（pH4.0）：）：维持变性的细胞裂解液的维持变性的细胞裂解液的p

28、H值，及沉淀值，及沉淀RNA。第33页，本讲稿共52页1 1TRIzol试剂试剂2 2氯仿氯仿3 3异丙醇异丙醇4 475%75%乙醇（乙醇（DEPC水配制）水配制）5 5DEPC水水TRIzol法提取法提取RNA试剂准备试剂准备:第34页，本讲稿共52页操作步骤操作步骤TRIzol法（组织）法（组织）戴一次性手套将组织样品从液氮中取出，用干灭过的剪刀将样戴一次性手套将组织样品从液氮中取出，用干灭过的剪刀将样品品外包裹用纱布及表层的肉样剪掉，然后放入干灭过的研钵中，往外包裹用纱布及表层的肉样剪掉，然后放入干灭过的研钵中，往研钵中倒入液氮，快速研磨成细末状；研钵中倒入液氮，快速研磨成细末状；用用

29、1ml一次性塑料吸头挑取细末装入灭过菌的一次性塑料吸头挑取细末装入灭过菌的7mL一次性塑料离心管中用电子一次性塑料离心管中用电子天平进行称量，每管中称取天平进行称量，每管中称取0.2g样品；样品；往管中加入往管中加入2mLTRIZOL，用力振荡后于，用力振荡后于15-30 C温育温育5min以裂解以裂解细胞，再加入细胞，再加入0.4mL三氯甲烷并剧烈振荡三氯甲烷并剧烈振荡15s后于后于15-30 C温育温育3min；第35页，本讲稿共52页将离心管置于冷冻离心机将离心管置于冷冻离心机2-4 C10000rpm/min离心离心15min，小心吸取上清转入另，小心吸取上清转入另一离心管中，加入等体

30、积异丙醇，混匀后于一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后于15-30 C温育温育15min以沉淀总以沉淀总RNA；将离心管置于冷冻离心机将离心管置于冷冻离心机2-8 C10000rpm/min离心离心15min，弃上清；，弃上清；加入加入2mL用冰预冷的用冰预冷的75%乙醇漂洗，乙醇漂洗，2-8 C7000rpm/min离心离心5min，弃上清，于室温干燥，弃上清，于室温干燥10min；加入适量加入适量DEPC处理水并于处理水并于55-60 C水浴水浴温育温育10min以溶解总以溶解总RNA，取适量用于，取适量用于DU640核酸蛋白测定仪测定浓度。核酸蛋白测定仪测定浓度。余下总余下总RNA样品的

31、水溶液须保存在样品的水溶液须保存在-80 C。第36页，本讲稿共52页TRIzol法（细胞）法（细胞）将将1mlTrizol加入加入1-5105细胞（细胞（6 孔板）中，室温放置孔板）中，室温放置3min。将全部溶液转移到将全部溶液转移到1.5ml离心管中，加入离心管中，加入0.2ml氯仿，振荡氯仿，振荡15s，静置，静置2min。4离心，离心，12000g15min，取上清，取上清 液液(约约400ul)。加入加入0.4ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。4离心，离心，12000g10min，弃上清。，弃上清。加入加入1ml75%乙醇，轻轻

32、洗涤沉淀。乙醇，轻轻洗涤沉淀。4，7500g5min，弃上清。，弃上清。晾干，加入适量的晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（溶解（65促溶促溶10-15min）。）。第37页，本讲稿共52页提取RNA 过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤处理RNA样品时必需仔细小心，其程度取决于样品的用途和来源由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要。第38页，本讲稿共52页提取RNA 过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤方案：1)工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离好，特别是那些用于细菌

33、接种、培养基和试剂配制的区域，那些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进行DNA的制备和操作。通常认为这些区域富含RNA酶。2)如有可能，使用标有“无RNA酶”的商品试管、吸头、溶液和水。通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶第39页，本讲稿共52页提取RNA 过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤3)双蒸水(ddH2O)和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC(焦碳酸二乙酯)进行处理：每100mL溶液或水中加入0.1mL DEPC原液，放在摇床上充分混匀并在37下作用数小时。然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活。4)用分子级的试剂和DEPC处理过的水配制的溶液通常没有RNA酶。5)分离R

34、NA以前，将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300 烘烤4h以灭活核酶。如有可能，将其他设备也灭菌处理。第40页，本讲稿共52页提取RNA 过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤从组织中提取RNA则要注意：动物器官的解剖器械 存放组织块的玻璃器皿 冻存组织块所用的器皿 组织器官的冲洗液人汗人汗含有RNA酶，故在所有步骤中均应戴手套并经常更换。周围环境含有大量的微生物和气雾，它们来自吸液操作或来自我们自己的呼吸。可能造成RNA酶的污染一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的RNA酶。细菌比哺乳动物细胞中有更多的RNA酶。因此从这些细胞中制备RNA应采取更严格的预防措施。分离后的RNA通过琼脂糖凝胶电泳再

35、经溴化乙锭染色后便可检查其是否完整。rRNA(18s和28s)条带模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解。第41页，本讲稿共52页注意事项注意事项1.所有玻璃器皿均应在使用前于所有玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤的高温下干烤2hr或更长时间；或更长时间；2.塑料器皿用塑料器皿用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗；水浸泡或用氯仿冲洗；3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温室温10min，然后用，然后用0.1%DEPC水冲洗，水冲洗，晾干；晾干；第42页，本讲稿共52页4

36、.4.配制的溶液应尽可能的用配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC0.1%DEPC，在，在3737处理处理12hr12hr以上。以上。然后用高压灭菌除去残留的然后用高压灭菌除去残留的DEPCDEPC。不能高压灭菌的试剂，。不能高压灭菌的试剂，应当用应当用DEPCDEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m0.22m滤膜滤膜过滤除菌；过滤除菌；5.5.操作人员戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换；操作人员戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换；6.6.设置设置RNARNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。操作专用实验室，所有器械等应为专用。第43页，本讲

37、稿共52页RNA电泳检测和定量电泳检测和定量RNA电泳检测电泳检测核酸浓度仪检测核酸浓度仪检测第44页，本讲稿共52页RNA电泳检测和定量电泳检测和定量核酸浓度仪检测核酸浓度仪检测纯度：纯度：OD260/OD2801.8 浓度：浓度：稀稀释倍数释倍数读数读数比色皿需经浓盐酸：甲醇（比色皿需经浓盐酸：甲醇（1 1：1 1）溶液浸泡！）溶液浸泡！第45页，本讲稿共52页RNA电泳检测和定量电泳检测和定量琼脂糖电泳检测琼脂糖电泳检测制备制备1.2%凝胶：将凝胶：将1.2g琼脂糖溶于琼脂糖溶于63mLDEPC处理水，冷却至处理水，冷却至60 C，加入，加入20mL5 甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛凝胶电泳缓

38、冲液和17mL37%甲醛，混匀后甲醛，混匀后在通风橱内灌制凝胶，于室温放置在通风橱内灌制凝胶，于室温放置30min，使凝胶凝固，使凝胶凝固;制备总制备总RNA样品：在一灭过菌的样品：在一灭过菌的0.5mL的微量离心管中混合的微量离心管中混合4.5L总总RNA，2L5 甲醛凝胶电泳缓冲液，甲醛凝胶电泳缓冲液，3.5L37%的甲醛和的甲醛和10L去离去离子甲酰胺，于子甲酰胺，于65 C水浴温育水浴温育15min，冰浴冷却，稍加离心使管内液，冰浴冷却，稍加离心使管内液体集中于管底。往管中加入体集中于管底。往管中加入2L甲醛凝胶加样缓冲液和甲醛凝胶加样缓冲液和1L1mg/mL的的EB溶液，混匀溶液，混

39、匀;第46页，本讲稿共52页电泳检测：将已凝固的凝胶浸入电泳检测：将已凝固的凝胶浸入1 甲醛凝胶电泳缓冲液中，甲醛凝胶电泳缓冲液中，5V/cm电压预电泳电压预电泳5min。然后将已制备好的总。然后将已制备好的总RNA样品加入点样孔，样品加入点样孔，5V/cm电压电泳电压电泳1h。结束电泳，。结束电泳，将凝胶放入紫外透射仪内观察。将凝胶放入紫外透射仪内观察。通城猪肌肉组织总通城猪肌肉组织总RNA电泳检测结果电泳检测结果第47页，本讲稿共52页通城猪不同组织总通城猪不同组织总RNA的电泳检测结果的电泳检测结果第48页，本讲稿共52页RNA检测结果检测结果第49页，本讲稿共52页 注意事项注意事项1

40、.所有玻璃器皿均应在使用前于所有玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤的高温下干烤2hr或更长时间；或更长时间；2.塑料器皿用塑料器皿用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗；水浸泡或用氯仿冲洗；3.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在在3%H2O2室温室温10min，然后用，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干；水冲洗，晾干；4.配制的溶液应尽可能的用配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在，在37处理处理12hr以上。然后用高压灭菌除以上。然后用高压灭菌除去残留的去残留的DEPC。不能高压灭菌的

41、试剂，应当用。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然处理过的无菌双蒸水配制，然后经后经0.22m滤膜过滤除菌；滤膜过滤除菌；5.操作人员戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换；操作人员戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换；6.设置设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。操作专用实验室，所有器械等应为专用。第50页，本讲稿共52页思考：思考：如何从总如何从总RNA中分离中分离mRNA?分离的总分离的总RNA可利用可利用mRNA3末端含有多聚末端含有多聚(A)+的特点的特点,当当RNA流经流经oligo(dT)纤维素纤维素柱时柱时,在高盐缓冲液作用下在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸被特异的吸附在附在oligo(dT)纤维素上纤维素上,然后逐渐降低盐浓然后逐渐降低盐浓度洗脱度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。被洗下。经过两次经过两次oligo(dT)纤维素柱纤维素柱,可得到较纯的可得到较纯的mRNA。纯化的。纯化的mRNA在在70%乙醇中乙醇中-70可保存一年以上。可保存一年以上。第51页，本讲稿共52页mRNA Extraction from Total RNA.flv第52页，本讲稿共52页