植物组织培养基本技术.ppt

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1、植物组织培养基本技术现在学习的是第1页，共35页第一节第一节 培养基及其配制培养基及其配制一、培养基成分一、培养基成分培养基：供植物材料生长的人工配制的基质。培养基：供植物材料生长的人工配制的基质。（一）水分：（一）水分：母液及培养基配制时，要用蒸母液及培养基配制时，要用蒸馏水，但大规模生产时，可用自来水代替。馏水，但大规模生产时，可用自来水代替。（二）无机元素：（二）无机元素：根据植物需要量的多少，可分为：大量根据植物需要量的多少，可分为：大量元素和微量元素。元素和微量元素。现在学习的是第2页，共35页1.大量元素：大量元素：指浓度大于指浓度大于0.5mmolL的元的元素，包括：素，包括：N

2、、P、K、Ca、Mg、S等。等。N：在制备培养基时以在制备培养基时以NO3-N和和NH4-N两种形两种形式供应。常用含式供应。常用含N物质有物质有KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4P：常用的物质有常用的物质有KH2P04或或NaH2P04等。等。K：常用的物质有常用的物质有KCI、KN03、KH2P04Ca、Mg、S：MgSO47H20、CaCl22H2O现在学习的是第3页，共35页2 2、微量元素、微量元素：指小于：指小于0.5mmol0.5mmolL L的元素，包括的元素，包括FeFe，B B，MnMn，CuCu，ZnZn，MoMo，CoCo等。等。FeFe：常用常用FeSOFeS

3、O4 47H7H2 20 0，因其在，因其在pHpH值值5.25.2以上，易形成以上，易形成Fe(OH)Fe(OH)3 3的不溶性沉淀，通常的不溶性沉淀，通常FeSOFeSO4 47H7H2 20 0 和和NaNa2 2EDTAEDTA结合成络合物使用。结合成络合物使用。B B：H H3 3BOBO3 3MnMn，CuCu，ZnZn：常用其硫酸盐；常用其硫酸盐；MoMo：NaNa2 2MoOMoO4 4 Co:Co:CoCl CoCl2 2现在学习的是第4页，共35页（三）有机营养物质：（三）有机营养物质：培养基中若只含有大量元素与微量元素，培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为常称为基本

4、培养基（基本培养基（basic medium)basic medium)。为不。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类：下几类：现在学习的是第5页，共35页1、碳水化合物、碳水化合物碳源：碳源：可可作作为为碳碳源源的的有有蔗蔗糖糖，葡葡萄萄糖糖和和果果糖糖最最常常用用的的碳碳源源是是蔗蔗糖糖，蔗蔗糖糖使使用用浓浓度度在在2%5%，常常用用3%（30g/L），即即配配制制一一升升培培养养基称取基称取30g蔗糖，有时可用蔗糖，有时可用2.5%。现在学习的是第6页，共35页2.2.维生

5、素：维生素：常用维生素有常用维生素有VBVB1 1(盐酸硫胺素盐酸硫胺素)、VBVB6 6(盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇)、VBVB3 3(又称又称VppVpp，烟酸或，烟酸或尼克酸尼克酸)、VBVB5 5（泛酸）、（泛酸）、VcVc（抗坏血酸），（抗坏血酸），有时还使用有时还使用V VH H（生物素）、叶酸、（生物素）、叶酸、VBVB1212等。等。一般用量为一般用量为0.11.0mg0.11.0mgL L。VBVB1 1对愈伤组织的产生和生活力有重要对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，作用，VBVB6 6能促进根的生长，能促进根的生长，VppVpp与植物代谢与植物代谢和胚的发育有一定关系。和胚的发

6、育有一定关系。VcVc有防止组织变有防止组织变褐的作用。褐的作用。现在学习的是第7页，共35页3.3.氨基酸：氨基酸：培养基中最常用的氨基酸是培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，用量在用量在10-10-1000mg1000mgL L之间。之间。4.4.肌醇：肌醇：使用浓度一般为使用浓度一般为50l00mgL，适，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽

7、的形成。对组织和细胞的繁殖、胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。用。现在学习的是第8页，共35页5.5.天然有机附加物：天然有机附加物：如椰汁、香蕉汁、马铃如椰汁、香蕉汁、马铃薯汁、酵母提取液等。薯汁、酵母提取液等。（四）植物生长调节剂：（四）植物生长调节剂：1 1、生长素类：、生长素类：（1 1）组培中的作用：）组培中的作用：促进细胞伸长；促进细胞伸长；促进生根；促进生根；诱导愈伤组织的形成；诱导愈伤组织的形成；2,4-D2,4-D会诱导某些植物不定胚的形成。会诱导某些植物不定胚的形成。现在学习的是第9页，共35页

8、（2）常用的生长素：）常用的生长素：吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（）、吲哚丁酸（IBA）、）、萘乙酸（萘乙酸（NAA）、）、2,4-二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2,4-D）（3）常用浓度：）常用浓度：0.15.0mg/L（4）需注意的问题：）需注意的问题：IAAIAA稳定性差稳定性差过滤灭菌，避光保存；过滤灭菌，避光保存；生长素与细胞分裂素（生长素与细胞分裂素（CTKCTK）配合使用：）配合使用：IAA/CTKIAA/CTK比值高，比值高，促进根的分化；促进根的分化；IAA/CTKIAA/CTK比值低，促进芽的分化；比值低，促进芽的分化；IAA/CTKIAA/CTK比值始终，形成愈伤

9、组织，不分化比值始终，形成愈伤组织，不分化 2,4-D可有效诱导愈伤组织的形成，但对芽的形成具有可有效诱导愈伤组织的形成，但对芽的形成具有抑制作用，且使用浓度范围较窄，稍过量对植物组织有抑制作用，且使用浓度范围较窄，稍过量对植物组织有毒害作用；毒害作用；诱导分化、增殖和生根阶段一般选用诱导分化、增殖和生根阶段一般选用IBAIBA和和NAANAA现在学习的是第10页，共35页2.细胞分裂素（细胞分裂素（CTK）：）：（1）作用：）作用：促进细胞分裂；促进细胞分裂；诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长；诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长；抑制顶端优势，延缓离体组织衰老；抑制顶端优势，延缓离体组织衰老；对根的

10、生长一般起抑制作用对根的生长一般起抑制作用（2 2）常用的）常用的细胞分裂素：细胞分裂素：6-苄基腺嘌呤（苄基腺嘌呤（6-BA）、激动素（）、激动素（KT）、玉米素（）、玉米素（ZT）等。）等。（3）使用浓度：）使用浓度：一般一般0.110.0mg/L现在学习的是第11页，共35页3.其他生长调节剂：其他生长调节剂：（1）GA：赤霉素：赤霉素作用：作用：a.a.促进幼苗茎的伸长和不定胚发育为小植株促进幼苗茎的伸长和不定胚发育为小植株b.b.与生长素协同作用，对形成层的分化有影响：与生长素协同作用，对形成层的分化有影响：IAA/GAIAA/GA比比值高时，有利于木质部分化值高时，有利于木质部分化

11、 IAA/GAIAA/GA比值低时，有利于韧皮部分化比值低时，有利于韧皮部分化c.c.打破休眠打破休眠d.d.抑制器官和胚状体的形成，但二者形成后，又可促抑制器官和胚状体的形成，但二者形成后，又可促进其生长进其生长常用浓度：常用浓度：0.1-0.5mg/L0.1-0.5mg/L现在学习的是第12页，共35页（2）ABA：脱落酸：脱落酸a.促进胚状体的发生促进胚状体的发生b.促进胚状体发育成熟但不萌发促进胚状体发育成熟但不萌发（五）凝固剂：（五）凝固剂：琼脂、卡拉胶等琼脂、卡拉胶等浓度：一般浓度：一般0.4%0.7%（六）其他物质（六）其他物质1.活性炭（活性炭（AC）：）：防止外植体褐变；降低

12、玻璃防止外植体褐变；降低玻璃苗的产生率；有利于生根，一般苗的产生率；有利于生根，一般0.5%3%2.抗生素：抗生素：3.抗氧化物质抗氧化物质现在学习的是第13页，共35页三、培养基的类型及特点三、培养基的类型及特点1、MS培养基培养基应用最为广泛应用最为广泛（1）特点：）特点：无机盐和离子浓度较高，硝酸盐无机盐和离子浓度较高，硝酸盐含量较高含量较高（2）适用范围：）适用范围：广泛地用于植物的器官、花广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养药、细胞和原生质体培养现在学习的是第14页，共35页2.White2.White培养基：培养基：其其特点特点是无机机盐数量较低，是无机机盐数量较低，适用

13、于适用于生根生根培养，胚胎培养及一般的组织培养也可以用，应用较广泛。培养，胚胎培养及一般的组织培养也可以用，应用较广泛。3.B3.B5 5培养基：培养基：其主要其主要特点特点是含有较低的铵，较高的硝酸是含有较低的铵，较高的硝酸盐和盐和V VB1B1，铵对植物的生长有抑制作用。木本植物尤，铵对植物的生长有抑制作用。木本植物尤其适宜在其适宜在B B5 5培养基上生长。培养基上生长。4.N64.N6培培养养基基：其其特特点点是是成成分分较较简简单单，KNOKNO3 3和和（NHNH4 4）2 2SOSO4 4含含量量高高，广广泛泛应应用用于于小小麦麦、水水稻稻及及其其他他植植物物的的花花药药培培养养

14、和其他组织培养。和其他组织培养。现在学习的是第15页，共35页三、培养基的配制三、培养基的配制（一）母液的配制及保存（一）母液的配制及保存1.母液的类型：母液的类型：大量元素母液（大量元素母液（N、P、S、K、Ca、Na、Mg等大量等大量元素的无机盐混合液）元素的无机盐混合液）10X或或20X微量元素母液（微量元素母液（Mn、Mo、Co、Cu、Zn、B、I等微等微量元素的无机盐混合液）量元素的无机盐混合液）100X铁盐母液（一般使用螯合铁铁盐母液（一般使用螯合铁Fe-EDTA)100X 有机营养母液（各种维生素和某些氨基酸的混合液）有机营养母液（各种维生素和某些氨基酸的混合液）100X植物激素

15、母液（各种植物激素单独配制的母液）植物激素母液（各种植物激素单独配制的母液）100X现在学习的是第16页，共35页2、配制母液的注意事项：、配制母液的注意事项：（1）配制无机盐母液要防止混合各种盐时）配制无机盐母液要防止混合各种盐时产生产生沉淀沉淀，各种药品必须在溶解后才能混，各种药品必须在溶解后才能混合，而且要注意先后次序，把钙离子、锰合，而且要注意先后次序，把钙离子、锰离子、钡离子和硫酸根、磷酸根错开，以离子、钡离子和硫酸根、磷酸根错开，以免相互结合生成沉淀。免相互结合生成沉淀。另外，在混合各种无机盐时，稀释度应大，另外，在混合各种无机盐时，稀释度应大，混合要慢，注意搅拌。混合要慢，注意搅

16、拌。现在学习的是第17页，共35页（2）在配制微量元素母液时也应注意药品的添加顺序，）在配制微量元素母液时也应注意药品的添加顺序，以防止沉淀的产生。以防止沉淀的产生。（3）铁盐由于易被氧化，易与其他混合液产生沉淀，）铁盐由于易被氧化，易与其他混合液产生沉淀，因此铁盐应与因此铁盐应与Na2-EDTA混合配制成螯合铁。混合配制成螯合铁。（4）有些生长调节物质不溶于水，）有些生长调节物质不溶于水，2,4-D、NAA、IAA、GA3等在配制时可先用少量等在配制时可先用少量95%的乙醇的乙醇溶解。溶解。KT、6-BA等可先溶解于少量等可先溶解于少量1mol/L的盐酸的盐酸中。中。叶叶酸酸则可先用少量则可

17、先用少量稀氨水稀氨水溶解。溶解。现在学习的是第18页，共35页3、配制好的母液贴上标签、配制好的母液贴上标签 标签：标签：注明母液的名称、配制倍数、配注明母液的名称、配制倍数、配制日期、配制人员及配制日期、配制人员及配1L培养基时应移取培养基时应移取的量。的量。注意：注意：母液要低温保存，储存时间不易母液要低温保存，储存时间不易过长，有沉淀或霉菌，则不可再用。过长，有沉淀或霉菌，则不可再用。现在学习的是第19页，共35页（二）培养基的制备方法（二）培养基的制备方法1.确定培养基配方及配制量；确定培养基配方及配制量；2.根据配方和配制量计算出各种母液及糖、琼根据配方和配制量计算出各种母液及糖、琼

18、脂的用量。脂的用量。3.按需吸取母液、称量蔗糖和琼脂。按需吸取母液、称量蔗糖和琼脂。4.用用60%-70%培养基最终容积的蒸馏水将琼培养基最终容积的蒸馏水将琼脂煮溶。脂煮溶。5.分别加入各种母液和糖，一些分别加入各种母液和糖，一些不耐热的激素不耐热的激素在灭菌后用过滤灭菌法加入在灭菌后用过滤灭菌法加入。现在学习的是第20页，共35页6.加蒸馏水定容至最终容积，加蒸馏水定容至最终容积，调调PH值值。7.分装分装8.包扎包扎9.瓶身上做标记瓶身上做标记10.高压灭菌高压灭菌：0.105 MPa，121，2030min现在学习的是第21页，共35页（三）计算：（三）计算：1.欲配制欲配制1L MS1

19、L MS6-BA 0.5mg/L+NAA1.0mg/L6-BA 0.5mg/L+NAA1.0mg/L3%3%蔗糖蔗糖+0.6%+0.6%琼脂培养基，已知琼脂培养基，已知 MSMS母液母液已经配制完成，其浓度分别是：大量元素已经配制完成，其浓度分别是：大量元素1010倍，微量元素倍，微量元素200200倍，铁盐倍，铁盐100100倍，有机倍，有机物物500500倍，倍，1.0mg/ml 6-BA1.0mg/ml 6-BA，0.1mg/ml NAA0.1mg/ml NAA。（1 1）计算各种母液、蔗糖和琼脂的用量）计算各种母液、蔗糖和琼脂的用量（2 2）叙述培养基的配制过程）叙述培养基的配制过程现

20、在学习的是第22页，共35页2.2.要配制要配制1mol/L NaOH 100ml1mol/L NaOH 100ml，1mol/L HCl 1mol/L HCl 1000ml1000ml，则需称取，则需称取 NaOH NaOH 多少克，量取浓多少克，量取浓HCl HCl 多少多少mlml？注：注：NaOHNaOH的摩尔质量是的摩尔质量是40g/mol40g/mol，浓盐酸的摩，浓盐酸的摩尔浓度为尔浓度为12mol/L12mol/L现在学习的是第23页，共35页第二节第二节 外植体的选择与消毒外植体的选择与消毒一、外植体的类型一、外植体的类型(一）外植体的选择原则一）外植体的选择原则1.植物的基

21、因型：决定植物组织培养难易程度的重要因素；植物的基因型：决定植物组织培养难易程度的重要因素；2.外植体的生理状态和发育年龄外植体的生理状态和发育年龄3.取材的季节取材的季节4.外植体的大小外植体的大小5.外植体的来源外植体的来源6.易于消毒易于消毒现在学习的是第24页，共35页（二）外植体的类型（二）外植体的类型1.带芽的外植体带芽的外植体适于离体快繁，脱毒适于离体快繁，脱毒培养培养2.分化的器官和组织分化的器官和组织3.种子和胚种子和胚现在学习的是第25页，共35页二、外植体的消毒二、外植体的消毒1.外植体预处理：外植体预处理：（1）适当修剪：）适当修剪：茎段：将茎上的叶片、叶柄等剪去，将茎

22、茎段：将茎上的叶片、叶柄等剪去，将茎剪成带有剪成带有23个节的茎段；个节的茎段；叶：大叶剪成带叶脉的叶块；叶：大叶剪成带叶脉的叶块；根：修去老根死根等，剪成根：修去老根死根等，剪成25cm的根段。的根段。现在学习的是第26页，共35页（2）如茎、叶外被茸毛、蜡质、不光滑等，）如茎、叶外被茸毛、蜡质、不光滑等，则用软毛刷蘸洗衣粉水刷洗则用软毛刷蘸洗衣粉水刷洗（3）流水冲洗）流水冲洗2.70%乙醇浸泡乙醇浸泡1030s，无菌水冲洗，无菌水冲洗1次次3.选择合适的消毒剂，浸泡适当时间选择合适的消毒剂，浸泡适当时间4.无菌水冲洗无菌水冲洗35次次现在学习的是第27页，共35页第三节第三节 灭菌消毒技术

23、灭菌消毒技术一、物理灭菌方法：一、物理灭菌方法：（一）高温灭菌：（一）高温灭菌：1.高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌（1）设备：高压蒸汽灭菌锅）设备：高压蒸汽灭菌锅（2）特点：简便、迅速、灭菌彻底）特点：简便、迅速、灭菌彻底（3）适用范围：耐高压高温的培养基、无菌水、无菌纸、）适用范围：耐高压高温的培养基、无菌水、无菌纸、接种工具、培养容器等接种工具、培养容器等（4）要求：）要求：0.105MPa、121、2030min现在学习的是第28页，共35页2.灼烧灭菌：灼烧灭菌：（1）设备：酒精灯）设备：酒精灯（2）特点：简便、迅速）特点：简便、迅速（3）适用范围：接种工具）适用范围：接种工具（4）要求：用

24、酒精灯外焰灼烧）要求：用酒精灯外焰灼烧现在学习的是第29页，共35页3.干热灭菌：干热灭菌：（1）设备：电热干燥箱、接种器械灭菌器）设备：电热干燥箱、接种器械灭菌器（2）特点：干燥、但耗时较长）特点：干燥、但耗时较长（3）适用范围：金属接种工具）适用范围：金属接种工具，玻璃培养，玻璃培养容器容器（4）要求：）要求：160170，12h，如有玻璃器，如有玻璃器皿则必须待温度降至皿则必须待温度降至50时，才能打开烘时，才能打开烘箱门，以防温度骤降玻璃破碎。箱门，以防温度骤降玻璃破碎。现在学习的是第30页，共35页（二）紫外线灭菌：紫外灯，适于接种室、（二）紫外线灭菌：紫外灯，适于接种室、培养室及超

25、净工作台的空气和物体表面灭培养室及超净工作台的空气和物体表面灭菌。菌。（三）过滤灭菌：细菌过滤器、注射器，适（三）过滤灭菌：细菌过滤器、注射器，适用于高温高压下易分解的试剂，主要是植用于高温高压下易分解的试剂，主要是植物生长调节物质，如物生长调节物质，如IAA、GA3、ZT的灭的灭菌。菌。现在学习的是第31页，共35页二、化学方法二、化学方法（一）适用范围：适用于外植体表面、接种器械表面、（一）适用范围：适用于外植体表面、接种器械表面、环境、空气和操作人员皮肤的消毒。环境、空气和操作人员皮肤的消毒。（二）常用化学消毒剂（二）常用化学消毒剂灭灭菌菌剂剂使用使用浓浓度度(%)持持续时间续时间（mi

26、n）去除的去除的难难易易效果效果次次氯氯酸酸钙钙910530易易很好很好次次氯氯酸酸钠钠2530易易很好很好氯氯化汞化汞0.1158较难较难最好最好抗菌素抗菌素450mg/L3060中中较较好好现在学习的是第32页，共35页第四节第四节 接种与培养技术接种与培养技术一、接种一、接种1.定义：定义：把把无菌无菌的培养物或经过表面消毒后的培养物或经过表面消毒后的外植体，的外植体，转移到转移到新鲜培养基上的过程。新鲜培养基上的过程。2.注意事项：注意事项：（1）接种过程中要树立无菌意识，保证）接种过程中要树立无菌意识，保证无菌无菌操作操作；（2）操作迅速。）操作迅速。现在学习的是第33页，共35页3

27、.无菌操作技术：无菌操作技术：（1）实验器具和材料的准备）实验器具和材料的准备（2）用）用70%的酒精擦拭超净工作台，开超净的酒精擦拭超净工作台，开超净工作台和室内紫外灯。工作台和室内紫外灯。（3）关紫外灯、打开风机，过）关紫外灯、打开风机，过510分钟进入分钟进入缓冲间。缓冲间。（4）用）用70%的酒精擦拭台面并消毒双手及实的酒精擦拭台面并消毒双手及实验用具。验用具。（5）进行外植体的消毒与接种）进行外植体的消毒与接种（6）完成工作后清理工作台上的废弃物，用）完成工作后清理工作台上的废弃物，用70%的酒精擦拭台面和双手的酒精擦拭台面和双手现在学习的是第34页，共35页二、植物组织培养条件二、植物组织培养条件一、温度一、温度 一般为一般为20203030。喜温性植物如茄科、。喜温性植物如茄科、禾本科、兰科等禾本科、兰科等262628 28，冷凉性植物如，冷凉性植物如百合科、十字花科、菊科等百合科、十字花科、菊科等181822 22。培。培养室。养室。一般设置（一般设置（252252）。二、光照二、光照1.1.光照强度光照强度 一般为一般为200020003000lx3000lx2.2.光质：光质：一般在一般在419419467nm467nm3.3.光周期光周期:16h16h的光照，的光照，8h8h的黑暗。的黑暗。现在学习的是第35页，共35页