生物催化与转化的应用实例课件.ppt

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1、关于生物催化与转化的应用实例第1页，此课件共64页哦D-泛解酸内酯是D-泛酸钙与D-泛醇的重要手性中间体。OHOO第2页，此课件共64页哦维生素药物D-泛酸和D-泛醇D-泛酸，Pantothenicacid，又称遍多酸、维生素B5、或B3，是构成辅酶A的成分，它是一种重要的药物、食品添加剂和饲料添加剂。产品一般为其钙盐D-泛酸钙（CalciumPantothenate）。D-泛醇（D-panthenol），又称维生素原B5，是以液体形式存在的D-泛酸钙的同效物，D-泛醇进入人体内能转化为泛酸，进而合成辅酶A，促进人体蛋白质、脂肪、糖类的代谢，保护皮肤和粘膜，改善毛发光泽，防止疾病的发生。因此，

2、D-泛醇作为营养补剂，特别适用于医药、食品、化妆品行业。第3页，此课件共64页哦1.1 D-D-泛解酸内酯的生物制备方法泛解酸内酯的生物制备方法1.1.1 1.1.1 不对称还原酮基泛解酸内酯不对称还原酮基泛解酸内酯 以近平滑假丝酵母Candida parapsilosis及小红酵母Rhodotorula minuta为催化剂，葡萄糖作为能源，进行还原反应，在28，pH46下反应两天，还原率达到100%，反应液中产品D-泛解酸内酯的浓度达到5090 g/L，光学纯度达到94%98%e.e.。第4页，此课件共64页哦1.1.2 1.1.2 不对称还原酮基泛解酸不对称还原酮基泛解酸 与以前面的酮基

3、泛解酸内酯还原方法相比较，酮基泛解酸还原方法具有以下优点：酮基泛解酸还原酶的产生菌都属于Agrobacterium属，而许多属的微生物具有酮基泛解酸内酯还原酶的活性。酮基泛解酸还原酶的光学选择性很高（98%e.e.以上），而酮基泛解酸内酯还原酶的光学选择性与产生该酶的微生物所在属或者种无关。这些结果表明催化酮基泛解酸还原的酶为单一酶（可能是酮基泛解酸还原酶），而酮基泛解酸内酯的还原酶可能是多种具有不同光学选择性的还原酶共同作用的。第5页，此课件共64页哦1.1.3 不对称氧化和还原两步酶法转化消旋泛解酸内酯 Nocardia asteroides可以不对称氧化DL-泛解酸内酯中的L-型成酮基泛

4、解酸内酯，酮基泛解酸内酯又可以由Candida parapsilosis不对称还原成D-泛解酸内酯。在这个两步酶催化反应体系中，D-型的泛解酸内酯始终没有被修饰，而是L-型的泛解酸内酯经过两步微生物酶催化，最终变成了D-型。第6页，此课件共64页哦OHOO 可以用来代替Candida parapsilosis，与Nocardia asteroides共同进行反应，它可以在酮基泛解酸内酯自发水解为酮基泛解酸后，将其不对称还原成D-泛解酸，D-泛解酸再酯化得到D-泛解酸内酯。这一系列反应用洗涤过的细胞可在同一生物反应器内一步转化完成。第7页，此课件共64页哦OOOHOHOHCOOHOOOH+内酯化

5、，消旋化DL-PLL-PAD-PL 用L-立体专一性内酯水解酶水解，将L-泛解酸内酯水解为L-泛解酸，可直接得到未水解的D-泛解酸内酯。L-泛解酸可以回收，经过消旋化反应得到DL-泛解酸内酯重新用于拆分。第8页，此课件共64页哦+消旋化OOOHDL-PLOOOHL-PLOHOHCOOHD-PAOOOHD-PL内酯化 用镰孢霉菌Fusarium等微生物选择性水解DL-泛解酸内酯生成D-泛解酸，分离后的D-泛解酸在酸性条件下加热，转化为D-泛解酸内酯。第9页，此课件共64页哦D-泛解酸内酯水解酶的串珠镰孢霉菌FusariummoniliformeSW-902，用于发酵生产的菌丝体作酶源，水解DL-

6、泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯，分离得到D-泛解酸，再经过内酯化反应，可得到很高光学纯度的D-泛解酸内酯。该方法不要求水解彻底，反应时间短，得到产品D-泛解酸内酯的光学纯度高，工艺控制简单，反应容易控制，底物的浓度可以很高。此项技术已在浙江鑫富生化公司实施产业化。异丁醛等D-泛酸钙D-泛醇内酯水解酶内酯水解酶内酯水解酶内酯水解酶1.2 1.2 工业化工业化水解酶制备水解酶制备D-D-泛解酸内酯介绍泛解酸内酯介绍第10页，此课件共64页哦D-泛解酸内酯的酶法拆分工艺流程L-泛解酸内酯DL-泛解酸内酯异丁醛，甲醛，HCN消旋化反应D-泛解酸微生物酶D-泛解酸内酯内酯化反应orD-泛酸钙D-泛醇第11

7、页，此课件共64页哦应用例2微生物法制备抗抑郁药微生物法制备抗抑郁药R-R-托莫西汀中间体的研究托莫西汀中间体的研究第12页，此课件共64页哦2.1 研究意义研究意义具有特定功能基团的手性醇是用于合成手性药物和其他手性化学品重要的中间体。3-氯-1-苯丙醇是一种重要的手性药物中间体。光学纯的3-氯-1-苯丙醇可用于制备S-(+)-氟西汀，R-(-)-托莫西汀，()-尼索西汀。S-(+)-氟西汀是R-(+)-氟西汀药效的3倍；R-(-)-托莫西汀是消旋体托莫西汀药效的2倍，是S-(-)-托莫西汀药效的9倍。以上三种药物均为抗抑郁药，可通过下图制备。第13页，此课件共64页哦由由3-氯氯-1-苯丙

8、醇制备手性抗忧郁药苯丙醇制备手性抗忧郁药 第14页，此课件共64页哦2.1 菌种的筛选菌种的筛选 菌种菌种Saccharomyces P2Saccharomyces B5Candida 104Candida 1257产率产率(%)305048100光学纯光学纯度度(ee%)7410010033*第15页，此课件共64页哦标准品的GC分析图谱 A：3-氯-1-苯丙酮（31.166min），B：S-3-氯-1-苯丙醇（42.613min）第16页，此课件共64页哦Saccharomyces B5还原底物的GC图谱A：3-氯-1-苯 丙 酮（31.166min），C:R-3-氯-1-苯 丙 醇(44

9、.022min)min303234363840424446pA93.594.595.596.597.5CA第17页，此课件共64页哦以乙醇为共底物有助于辅酶再生的机理 第18页，此课件共64页哦微生物的培养条件及反应条件对还原反应的影响微生物的培养条件及反应条件对还原反应的影响微生物的培养条件及反应条件对还原反应的影响微生物的培养条件及反应条件对还原反应的影响 strainsReaction conditionAnoxybiotic cultureOxybiotic cultureYield(%)ee(%)yield(%)ee(%)shaking0/50100standing0/28100 C

10、andida 104shaking0/48100standing0/26100Saccharo-myces B5第19页，此课件共64页哦还原反应中微生物的重复利用还原反应中微生物的重复利用重复利用次数重复利用次数Saccharomyces B5Candida 104yield(%)ee(%)yield(%)ee(%)1511004810025010048100350100471004371000/50/0/第20页，此课件共64页哦S-S-氰基氰基-3-3-苯氧基苄醇苯氧基苄醇(S-CPBA)S-CPBA)的合成与应用的合成与应用应用例3第21页，此课件共64页哦3-苯氧基苯甲醛（mPBA）

11、的不对称羟氰化反应手性金属复合物生物碱催化多肽催化醇腈酶（Oxynitrilases）或醇氰裂解酶（hydroxynitrilelyases）催化剂:3.1拆分制备S-CPBAS-CPBA的过程的过程第22页，此课件共64页哦S-醇腈酶催化拆分合成S-CPBA脂肪酶催化选择性水解合成S-CPBA第23页，此课件共64页哦酶催化不对称酯化拆分合成S-CPBA酶催化不对称醇解合成S-CPBA第24页，此课件共64页哦其中R为：化学-酶催化一锅化合成S-CPBA第25页，此课件共64页哦脂肪酶催化醇解反应拆分（脂肪酶催化醇解反应拆分（R R，S S）-CPBAc-CPBAc反应式反应式第26页，此课

12、件共64页哦3.2 3.2 3.2 3.2 酶反应体系的确定酶反应体系的确定酶反应体系的确定酶反应体系的确定 酶反应时间反应溶剂底物醇S-CPBAmPBA(mmol/l)Yield%e.e.%2228hrTHF甲醇48.7499.168.97乙醇49.9899.057.68二氯甲烷甲醇35.5998.9530.34乙醇34.8799.1124.11乙醚甲醇50.1396.1317.22乙醇50.7797.6912.432430hrTHF甲醇49.6095.3720.58乙醇46.2296.1515.4氯仿甲醇20.4691.5762.65乙醇21.3892.7355.34甲苯甲醇26.5274

13、.0297.88乙醇20.8775.1992.55第27页，此课件共64页哦无溶剂体系酶催化转酯化反应式应用例4第28页，此课件共64页哦应用例 5生物催化法制备手性2-芳基丙酸第29页，此课件共64页哦5.1 2-芳基丙酸概述 2-芳基丙酸类非甾体抗炎药(Non-SteroidAnti-InflammingDrugs，NSAIDs)，是一类重要的消炎镇痛药，可用化学通式ArCH(CH3)COOH表示。目前已经发现具有解热、消炎镇痛作用的2-芳基丙酸类药物有几十种，大多数已经工业化生产。常见的品种有：萘普生(Naproxen)、布洛芬(Ibuprofen)、氟比洛芬(Flurbiprofen)

14、、酮基布洛芬(Ketoprofen)、舒洛芬(Suprofen)等等。以酮基布洛芬为例，其消炎镇痛作用比阿司匹林强150倍，解热作用强100倍，临床上用于治疗慢性类风湿关节炎、变形关节炎、外伤和术后疼痛。第30页，此课件共64页哦第31页，此课件共64页哦酶催化水解拆分芳基丙酸酯反应示意图酶催化水解拆分芳基丙酸酯反应示意图脂肪(酯)酶或催化抗体 研究发现来源于根霉（Rhizopus）、毛霉（Mucor）和假丝酵母（Candida）属的胞外脂肪酶均对不同的萘普生酯具有很高的立体选择性，且稳定性和底物耐受性很高（1mol/L）。5.2 5.2 酶法拆分工艺酶法拆分工艺第32页，此课件共64页哦 酶

15、催化水解拆分芳基丙腈（酰胺）反应示意图酶催化水解拆分芳基丙腈（酰胺）反应示意图腈水解酶腈水合酶酰胺酶 其路线主要有两条：一是用微生物腈水解酶(Nitrilase)直接立体选择性水解拆分2-芳基丙腈为光学纯的2-芳基丙酸；二是腈水合酶(NitrileHydratase)和酰胺酶(Amidase)相结合立体选择性水解拆分2-芳基丙腈为光学纯的2-芳基丙酸。第33页，此课件共64页哦酶催化酯化酶催化酯化反应拆分酶催化酯化反应拆分2-芳基丙酸反应示意图芳基丙酸反应示意图 来源于Candida rugosa、Rhizomucor miehei、Candida antarctica等的脂肪酶均可用于2-芳

16、基丙酸酯化的拆分。如Novo公司的Lipozyme1000L(来源于Rhizomucor miehei)用于催化(R,S)-布洛芬与辛醇的选择性酯化反应，优先选择(S)-构型，对映选择率(E)100;不过对于酮基布洛芬，优先选择(R)-构型，而且E值仅有2.4。第34页，此课件共64页哦酶催化氧化微生物酶催化氧化芳基烷烃制备酶催化氧化芳基烷烃制备(S)-2-芳基丙酸示意图芳基丙酸示意图酶催化氧化芳基丙醛制备酶催化氧化芳基丙醛制备(S)-布洛芬布洛芬微生物第35页，此课件共64页哦5.3(5.3(R,SR,S)-)-萘普生酶法拆分萘普生酶法拆分 非水相酶促酯化拆分萘普生的技术路线非水相酶促酯化拆

17、分萘普生的技术路线 产品分离消旋非水介质+ROH,Lipase水解S-萘普生第36页，此课件共64页哦 酶促选择性水解萘普生酯的技术路线酶促选择性水解萘普生酯的技术路线第37页，此课件共64页哦5.4 5.4 布洛芬布洛芬(ibuprofen)ibuprofen)酶法拆分酶法拆分 +ROH,Lipase非水介质产品分离水解消旋S-布洛芬非水相酶促酯化拆分布洛芬的技术路线非水相酶促酯化拆分布洛芬的技术路线第38页，此课件共64页哦 酶促选择性水解布洛芬酯的技术路线酶促选择性水解布洛芬酯的技术路线第39页，此课件共64页哦(S)-布洛芬的提取工艺布洛芬的提取工艺水解反应液盐酸酸化石油醚提取水相有机

18、相丢弃5%NaOH溶液反应水相有机相盐酸酸化石油醚提取水相有机相丢弃S(+)-布洛芬R(-)-布洛芬乙酯布洛芬消旋乙酯第40页，此课件共64页哦5.5 5.5 酮洛芬(Ketoprofen)Ketoprofen)酶法拆分酶法拆分+ROH,Lipase产品分离水解消旋非水相酶促酯化拆分酮洛芬的技术路线非水相酶促酯化拆分酮洛芬的技术路线第41页，此课件共64页哦乙醇乙醇Novozym 4351,2-二氯丙烷总产率：60%Novozym 4351,2-二氯丙烷OCOOHOCOOEtOCOOHOCOOHOCOOHOCOOHOCOOR(+)-1,(500 g)(-)-2,ee 55%(322 g)(+)

19、-1,ee 77%(209 g)(+)-1,(209 g)(+)-1,ee 38%(418 g)(+)-1,ee 96%(209 g)(-)-2,ee 20%(232 g)大规模的制备（大规模的制备（S）-酮基布洛芬酮基布洛芬第42页，此课件共64页哦OCOOHOCOOROCOOHOCOOROCOONaOCOOR+酯化lipase，水解分离有机相水相消旋化1234+酶促选择性水解酮洛芬酯的技术路线酶促选择性水解酮洛芬酯的技术路线第43页，此课件共64页哦应用例6L-苯丙氨酸的酶法制备第44页，此课件共64页哦6.1 6.1 L-L-苯丙氨酸的性质用途苯丙氨酸的性质用途 苯丙氨酸纯品为白色粉末，

20、有苦味，微溶于醇，不溶于苯，熔点283，比旋光D25=34.4（c=1，H2O）。25时在水中溶解度是2.97g/100g。等电点为pH5.48。结构式：L-苯丙氨酸是人体必需的八种氨基酸之一，作为一种营养增补剂，是配制氨基酸输液和制剂及氨基酸营养食品的主要成份，L-苯丙氨酸目前最大的用途是用于天苯二肽甜味剂的合成，其中阿斯巴甜的世界销量为4万吨/年。阿斯巴甜以安全、美味、低热值、高甜度而成为优秀的无糖甜味剂。第45页，此课件共64页哦6.2 6.2 L-L-苯丙氨酸的酶法制备路线苯丙氨酸的酶法制备路线 苯丙酮酸转氨酶酶法第46页，此课件共64页哦 肉桂酸酶法(苯丙氨酸解氨酶（PLA）)苄基海

21、因酶法横关健三等以苯甲醛和海因为原料合成得到DL-苄基海因，在L-海因酶和N氨甲酰水解酶的作用下酶法水解得到L-苯丙氨酸，该路线的关键是前体苄基海因的低成本制备和高活性L-海因酶的筛选。第47页，此课件共64页哦苯丙酮酸脱氢酶法以苯丙酮酸为前体，通过还原性氨化作用合成L-苯丙氨酸。1987年，Asano等人采用从自然界中分离到的尿素芽孢八叠球菌（Sporosurcina ureae）SCRC-R04所生产的高活性苯丙氨酸脱氢酶，与用于辅酶NADH再生的甲酸脱氢酶组成共轭反应体系，L-苯丙氨酸产率达到116g/L，转化率可以达到89%。工艺路线示意如下：第48页，此课件共64页哦药用氨基酸：L-

22、色氨酸、L-蛋氨酸等 1969年日本千铀一郎首先在工业上应用固定化氨基酰化酶拆分DL-氨基酸获得成功。被称为酶工程的开始。有些氨基酸发酵法很难，酶工程方法是目前推崇的方法第49页，此课件共64页哦天冬氨酸转氨酶催化转氨反应生产L-苯丙氨酸 以苯丙酮酸和L-天门冬氨酸为原料，用天冬氨酸转氨酶催化转氨反应，生成 L-苯丙氨酸和草酰乙酸，草酰乙酸脱羧生成丙酮酸和二氧化碳。反应式右图。L-天冬氨酸天冬氨酸 E.coli SW0209-31第50页，此课件共64页哦应用例应用例7 7酶法制备D-氨基酸第51页，此课件共64页哦7.1 7.1 D-D-氨基酸的应用氨基酸的应用 （1）多肽抗生素短杆菌肽A第

23、52页，此课件共64页哦生长抑制素八肽类似物(oxtreotide)，用于治疗VIP瘤、类癌综合症及胃泌素瘤等醋酸奥曲肽(sandostatinacetate，商品名：善得定),用于治疗肢端肥大症、胰瘘、肿瘤激素性腹泻的肽激素分泌失调、非肿瘤性腹泻，治疗胃切除后发生的腹泻综合症。第53页，此课件共64页哦半合成抗生素以D-HPG或D-PG为侧链的半合成抗生素，因其肽键很难被-内酰胺酶作用从而具有较高的稳定性，而且具有抗菌谱广、毒性小、过敏性低、吸收快、血浓度高、药力持续时间长、口服效果好等远优于青霉素G的药理性能。第54页，此课件共64页哦肽类甜味剂具有很高的商业价值。目前市售的天苯二肽（商品

24、名阿斯巴甜，aspartame）是一种优良的甜味剂，其甜度为蔗糖的200倍，适用于肥胖症、糖尿病和心血管病人食用。但它不适合苯丙酮酸尿患者，并且对酸碱和温度稳定性差，限制了其在食品领域的广泛应用。由D-Ala与L-Asp反应合成得到的天丙二肽（商品名阿力甜，alitame），其甜度为蔗糖的2,000倍，且对热和酸碱稳定，可广泛适用于食品工业、日用化学工业作甜味剂，具有极好的市场前景。1983年由BrennanT.M.获得的阿力甜的美国专利，目前已在澳大利亚、新西兰等国获准应用、上市。第55页，此课件共64页哦7.2 D-7.2 D-氨基酸的制备方法氨基酸的制备方法 酰化酶法酰化酶拆分消旋化氨基

25、酸的过程Tripathi等研究了从Alcaligenes denitrificans和Alcaligenes faecalis中诱导产生D-氨基酸酰化酶，利用培养产生的完整细胞可将各种N-乙酰-D-氨基酸转化为D-Met、D-Val、D-Phe和D-Leu。第56页，此课件共64页哦羧肽酶法目前，应用此法获得D-氨基酸的最成功实例是荷兰DSM公司采用恶臭假单胞菌L-羧肽酶拆分DL-羧基酰化氨基酸，以生产半合成青霉素和头孢菌素类抗生素的重要侧链D-PG和D-pHPG。第57页，此课件共64页哦7.3 7.3 海因酶法制备海因酶法制备D D氨基酸氨基酸 海因酶法制备D氨基酸的工艺路线许多5-取代海

26、因在反应条件下可以自发消旋，也可用消旋酶加速消旋，利用此过程可以进一步将海因消旋而使其100%地转化为光学纯的产品。第58页，此课件共64页哦7.4 7.4 海因酶法制备海因酶法制备D-D-苯丙氨酸苯丙氨酸 一菌双酶转化工艺第59页，此课件共64页哦一酶一树脂法制备工艺一酶一树脂法是一酶一酸法的改进方法，通过采用强酸性树脂代替强酸，可减少反应中大量产生盐，从而减轻D-苯丙氨酸的分离纯化难度。第60页，此课件共64页哦7.57.5其他其他D-D-氨基酸的酶法制备工艺氨基酸的酶法制备工艺 化学酶法制备D-氨基酸的反应历程图第61页，此课件共64页哦方法：方法：指由原料L或DL-氨基酸5-取代海因的方法第62页，此课件共64页哦8 其它应用例药用葡萄糖第63页，此课件共64页哦感感谢谢大大家家观观看看第64页，此课件共64页哦