分子生物学实验方法.doc

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1、分子生物学实验新疆农业大学农学院生物技术系实验1 植物总DNA的提取和紫外分析一、实验目的了解植物DNA提取的主要方法及其原理，掌握SDS法或CTAB法抽提植物总DNA的基本程序和操作要求。二、实验原理核酸分子是基因工程研究的主要对象，核酸样品的质量直接关系到基因研究一系列试验的成败。核酸包括DNA和RNA两种分子，在细胞中它们都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子。一般地说，总DNA主要是指基因组DNA（genomic DNA），即细胞核内的染色体DNA分子。植物总DNA的抽提常采用两种方法：SDS法和C

2、TAB法。CTAB法：简便、快速，DNA产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。CTAB是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.10.5mM NaCl）下，CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用7075%酒精浸泡可洗脱掉 CTAB。再经过氯仿/异戊醇（24:1）抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离

3、出来。SDS法：离子去污剂，过程长，纯度高。三、主要仪器、试剂、耗材1、植物材料叶片（根、茎、花、果等） 2、主要仪器及试剂微量高速离心机、紫外分光光度计、水浴锅、离心管、移液枪、枪头等。CTAB提取缓冲液（2%CTAB，1.4M NaCl，20mMEDTA，100mMTris-HCl，pH8.0）、氯仿/异戊醇（24:1,v/v）、无水乙醇、75%乙醇、TE缓冲液。四、实验方法与步骤（一）CTAB法提取植物叶片DNA1、植物组织的破碎：取0.1g新鲜的植物叶片，在液氮中研磨至粉末状，转入1.5ml离心管中。2、细胞的破碎：迅速加入1ml预热（65）的CTAB提取缓冲液，65水浴中保温30mi

4、n以上，每5min上下颠倒1次。3、核酸的分离：12000g离心5min，吸取上清液约600l，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。重复操作2次。4、12000g离心5min，取上清于一新1.5ml离心管，加入0.6倍体积的预冷的异丙醇溶液，混匀，-20放置10-30min。5、12000g离心10min，去上清，用75%乙醇浸洗沉淀，自然干燥约30min。6、核酸的溶解：加入20lTE缓冲液或无菌水，混匀即可。（二）DNA的定量分析核酸的纯度和浓度可以用紫外分光光度计测定，OD值代表光密度，下标数字表示光波长，DNA样品OD260/OD280值为1.8，

5、RNA样品OD260/OD280值为2.0，表明样品纯度较好。若低于此值，则样品中可能有蛋白质污染。OD260的读数用于计算样品中的核酸浓度，OD值为1相当于大约50g/ml双链DNA或40g/ml单链RNA。1、取DNA原液5l稀释至3.0ml，用紫外分光光度计测定230nm、260nm及280nm的吸光值。2、DNA浓度（mg/mL）=50（260nm的读数）稀释倍数分光光度法是测定物质浓度的常用方法，DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强的吸收能力，因而在260nm处具有一个强烈的吸收峰；蛋白质中含有的色氨酸和酪氨酸在280nm波段有一强烈的吸收峰，利用上述特点可以测定物质含量

6、。教材的公式中“50”的含义是：在标准厚度为1cm的比色杯中，OD260（OD是光密度optical delnsity的缩写）为1相当于50mg/mL的dsDNA（双链DNA），40mg/mL的RNA，37mg/mL的ssDNA（单链DNA）以及30mg/mL的寡核苷酸，因此若是测定RNA的含量，50应该换为40，其他物质以此类推。3、DNA纯度：1.7A260/A2801.9五、实验结果处理 记录提取的DNA样本的OD值并计算样本浓度。实验2 总RNA的提取和尿素变性胶电泳一、实验目的 通过本实验，学生了解RNA的结构和特点，学会使用Trizol法提取植物总RNA，学习和掌握总RNA的检测实

7、验技术和实验原理。二、实验原理RNA的提取是进行分子克隆和基因表达分析等研究的基础。但RNA很容易被内源及外源的RNase降解，所以要得到未被降解的、不含DNA与其它杂质的RNA是进行分子生物学研究的前提。目前较为成熟的分离RNA的方法有许多，用于植物细胞总RNA的提取主要有苯酚法、异硫氰酸胍法、氯化锂沉淀法、SDS/酚抽提法，或应用商品化的Trizol试剂和Qiagen等各类试剂盒进行提取。但由于植物细胞具有坚硬的细胞壁，内含较多的多糖、脂质、多酚等次生代谢物，同种植物的不同组织和不同植物的同种组织材料，其RNA的提取方法也会有很大差异。适宜的RNA提取材料处理方法也不尽相同。Trizol试

8、剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern，RT-PCR，分离mRNA，体外翻译和分子克隆等。三、主要仪器、试剂、耗材1、无RNA酶的1.5mlEppendorf管、枪头、研钵，微量高速离心机，琼脂糖凝胶电泳槽，移液器，一次性手套等。2、实验材料：植物新鲜叶片3、实验试剂：Trizol；电泳缓冲液：0.025M柠檬酸（pH3.5）；制胶缓冲液：6M尿素+

9、0.025M柠檬酸（pH3.5）；上样缓冲液：6M尿素+0.025M柠檬酸（pH3.5）+20%蔗糖+0.0025%溴酚蓝四、实验步骤（一）总RNA的提取1、取0.1g左右新鲜植物叶片置于研钵中，加入液氮，迅速研磨成均匀的粉末。2、将粉末移入预冷的1.5ml离心管中，加入1.0mlTrizol，轻轻摇动离心管使混合均匀，室温放置5min。3、加入0.5ml氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min后，12000rpm，4离心15min，上层水相移到新管中。重复操作2次。4、加入0.6倍体积预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，-20放置20min。5、12000rpm，4离心15min，弃上清。6、加入1ml

10、 75%乙醇，12000rpm，4离心5min，弃上清。7、超净台内干燥10min左右（切忌完全干燥，否则不易溶解）。8、加20ul的0.1%DEPC处理水溶解RNA，-80保存。（二）尿素变性胶电泳分析1、制备2%的琼脂糖凝胶电泳。2、上样量为5l左右。3、电压通常为75V左右。实验3 RT-PCR一、实验目的通过本实验，学生了解小麦18SrRNA的特点，学会使用PCR进行反转录获得cDNA技术，学习和掌握RT-PCR的实验技术和实验原理。二、实验原理RT-PCR为反转录RCR（reverse transcription PCR）的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR（reverse tr

11、anscription-PCR，RT-PCR），是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测

12、基因表达的方法，参见Northern Blot法。RT-PCR的关键步骤在是RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia vrius,MMLV）反转录酶。三、器材与试剂1、实验仪器：PCR扩增仪，琼脂糖凝胶电泳槽，移液器，枪头等。2、小麦18S rRNA扩增引物序列为(53)：18SL：CTTCTTAGAGGGACTATGGC18SR：TACGGAAACCTTGTTACGAC四、实验步

13、骤（一）cDNA的合成1、在冰浴的无RNA酶的PCR管中加入如下溶液：总RNA1-5ugOligo(dT)2uldNTP2ulRNase-free ddH2O定容至14.5ul2、70加热5min后迅速在冰上冷却2min。短暂离心后，继续加入如下溶液：5*Frist-Strand Buffer4ulRNasin0.5ulMMLV1ul3、混匀后，42温浴50min。4、95加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。5、加入如下溶液，PCR扩增目的基因片段：Buffer2.5uldNTP1ul引物10.5ul引物20.5ulTaqE0.3ul上述反应液2ulddH2O定容至25ul反应

14、程序为：945min9430S5430S 30次721min7210min4保存（二）1%琼脂糖电泳检测分析实验4 动物组织总DNA提取与电泳分析一、实验目的：掌握动物DNA提取的原理及步骤。二、实验原理：动物DNA提取的材料来源可以是培养的细胞、血液、肝、脾、肾等组织，通常的方法是在有EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚/氯仿/异戊醇抽提，可以得到动物基因组DNA。用此方法得到的DNA长度为100-150Kb。（注：核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，其作用为：1. 溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2. 解聚细胞中的核蛋

15、白；3.与蛋白质结合成为R-O-SO3-R+蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来；4.对RNAase、 DNAase有一定的抑制作用）。三、实验材料与试剂：1、材料：蝗虫后腿股节；2、器材：移液器、水浴锅、台式离心机等；3、试剂：A液：Tris 0.05 mol/L，NaCl 0.1 mol/L，Na2EDTA 0.1 mol/L，pH 7.08.0；B液：5% SDS；C液：2 mg/ml Proteinase K。酚、氯仿、异戊醇，冰乙醇（提取所用试剂）；10*TBE缓冲液、0.7%琼脂糖、上样缓冲液、EB。4、实验方法：蛋白酶K法（酚-氯仿抽提法）四、实验步骤: 配制DNA提取消化液

16、取蝗虫腿节肌肉 加600l抽提液，在离心管中将肌肉磨碎 65 水浴35 h 加入等体积的酚，8000 rpm离心10 min，取上清 加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），8000 rpm离心10 min，取上清 加入2倍体积的冰无水乙醇沉淀DNA，在冰箱中放置20 min，1000015000 rpm离心15 min，弃上清 加入1 ml的70%冰乙醇洗涤DNA，10000 rpm离心5 min，弃上清 真空干燥 电泳检测实验5 微生物基因组DNA提取与分析一、实验目的：掌握微生物基因组DNA提取的原理及步骤。二、实验原理：微生物基因组DNA提取三、实验材料与试剂：1、材料：过夜培养的大肠杆

17、菌DH5；2、器材：移液器、水浴锅、台式离心机等；3、试剂： 4、实验方法： 四、实验步骤: （一）基因组DNA提取1、8000rpm，5min，收集1-5mL过夜培养的大肠杆菌DH5，弃上清。2、加入100L2mg/mL蛋白酶K，65水浴，30min-1h。3、再加等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提两次，12000g，4离心2min，取上清。4、加入0.6倍体积的异丙醇溶液，混匀，-20沉淀1H。5、12000g，4离心10min，弃上清。6、用1mL 70%乙醇洗涤沉淀，晾干。7、用适量体积的TE溶液充分溶解即可。（二）电泳检测1、制备2%的琼脂糖凝胶电泳。2、上样量为5l左右。3、电压通常为75V左右。