测序技术回顾与第三代测序技术展望.doc

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1、测序技术回顾与第三代测序技术展望摘要：DNA测序技术是分子生物学实验中的重要的实验手段。几十年来，测序技术发展飞快，本文简述了测序技术的发展历程，详述了以单分子测序和基因组光学图谱技术为代表的第三代测序技术。关键词：DNA测序技术；单分子测序；基因组光学图谱技术The sequencing technology review and the third-generation sequencing future perspective Abstract：DNA sequencing technology is one of most important experiment methods in

2、 molecular biology field. For several decades, sequencing technology has been developing quickly. In the paper, it briefly introduces the development process of sequencing technology, and recommends the single molecule sequencing technology and Optical mapping solutions in detail, which are the repr

3、esentatives of the third generation sequencing technology.Key words：DNA sequencing; Single-molecule sequencing; Optical mapping solutions1953年Watson和Crick揭示了DNA的双螺旋结构1，这大大激励了人们对DNA序列的探索。于是DNA测序技术应运而生，是现代分子生物学中重要的实验手段。DNA测序技术及伴随产生的基因操纵技术它极大地推动了生命科学的发展 23 。现介绍DNA测序技术的发展历史及第三代测序技术中两个代表性的技术单分子测序和基因组光学图谱

4、技术。一、DNA测序技术的发展历史DNA测序技术迄今经历了三代的发展。DNA测序技术成熟于上世纪70年代中后期，随后的20多年第一代测序技术测出了不少简单的小型基因组。1990年提出人类基因组计划（Human Genome Project ,HGP），逐步诞生了高通量第二代测序技术。近年来，单分子等第三代测序技术开始出现，也预示着测序技术将应用更广，测序的成本越低45。1.1第一代测序技术1975年Sanger和Coulson发明了“Plus and Minus”（俗称“加减法”）测定DNA序列6；1977年Maxam and Gilbert发明了化学降解法测序7；1977年Sanger引入d

5、dNTP（双脱氧核苷三磷酸），发明了著名的双脱氧链终止法8。双脱氧链终止法有效控制了化学降解法中化学毒素和同位素的危害，在随后的二十多年得到很好的应用。这些技术及在此基础上发展的相关技术统称为第一代测序技术。（Stephan C Schuster Next-generation sequencing transforms todays biology）第一代测序技术在人类基因组计划中有了极大作用与发展 9。1.2 第二代测序技术 随着人类基因组计划的完成，人们开始进入后基因组时代（post-genomic era）。科学家逐步测出多种生物的序列，传统的测序技术已经无法满足高通量和高效率的大规模

6、基因组测序，第二代DNA测序技术（next-generation sequencing）就诞生了10。第二代测序技术主要有Roche公司应用焦磷酸测序原理的454测序技术及454基础上的GS FLX、GS Junior测序平台11；Illumina公司应用合成测序原理的新一代Solexa Genome Analyzer测序平台，ABI公司使用连接技术的Solid测序平台。第二代测序技术实现了高通量、高效率、高准确度的测序大大降低了测序的成本，DNA测序可以向个人测序发展。第二代测序技术很好应用于单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）的研究，对探索

7、人类的遗传及基因病有极大的意义9。1.3 第三代测序技术然而在遗传学中，成千上万的基因组需要测出及分析，高通量的二代技术还是面临成本高、效率低、准确度不是很高等的难题，第三代测序技术已经开始崭露头角。第三代测序技术主要有Helicos公司开发的单分子测序、Complete Genomics公司对人类大型基因组研究中最新技术12、OpGen公司的Optical Mapping Solutions测序等。二、单分子测序(Single-molecule sequencing)单分子测序1989年被J. H. Jett等提出来的13。单分子测序在近些年来发展迅速， Timothy D. H.等使用了单

8、分子测序的测序方法测定了M13病毒的基因组14，Doron Lipson等使用单分子测序的方法研究了Saccharomyces cerevisiae DBY746的转录组15。Helicos公司开发了新型的单分子测序仪16。2.1.单分子测序原理Helicos公司单分子测序仪的技术原理是利用合成测序理论，将样本DNA数以百万的单链分子绑定在该仪器特有的、没有背景荧光的玻璃表面，通过加入荧光标记的核苷酸(一次加入4种核苷的1种)和聚合酶到单分子阵列中，核苷酸会结合到DNA分子上特异性结合的位点上。用激光激发结合在DNA分子上的荧光标记的核苷酸，使标记物发出荧光，相机以15ms速度快速扫描整个阵列

9、，检测特异性结合到DNA片断上的荧光碱基。在此之后，结合的核苷酸对会被移动除去，然后，通过重复加入标记的核苷酸来重复这一过程16。2.2单分子测序步骤2.2.1单程单分子测序（single-pass sequencing）（见图1）1 将DNA双链解开成单链，在3端加上标记的多聚A尾(poly A tail)，再用末端转移酶封闭3端。2 3端与固定在仪器表面的基因组模板寡核苷酸的5端以共价键的形式杂交。3 通过所提取的基因组模板合成测序的位点。4 在测序仪器玻璃表面加入被标记的碱基和DNA聚合酶的混合液，碱基自然延长，使用647nm的荧光下对Cy5直接扫描成像。5 使用化学方法对去除碱基中的染

10、料标记。6 加入新的标记的碱基和DNA聚合酶使反应继续循环下去。图1：单程单分子测序图2：双程单分子测序2.2.2双程单分子测序（two-pass sequencing）（见图2）在单程单分子测序中，DNA样品是与仪器玻璃表面的固定的寡核苷酸相杂交。DNA复制的时候，其共价连接的模板也同时复制，在模板的末端提供引物序列。这个引物序列用于合成法测序。一个测序反应后，合成链解开，一个新的引物杂交上去，进行第二次测序。2.3 单分子测序的优势单分子测序减少了试剂的使用，测序成本价格大大降低，使得人的基因组测序低于1000美元慢慢走向可能。此处Helicos公司还有一个优势，就是它不需要扩增建立DNA

11、库，从而切断数据结果中潜在错误的来源。三、基因组光学图谱系统(Optical Mapping Solutions)Phil Latreille等利用光学图谱研究了X. nematophila基因组，完成了基因组的组装17。OpGen公司在近年开发了一种新型的光学图谱技术18。3.1光学图谱技术原理18这种光学图谱技术是一个利用单个DNA分子基因组限制性内切酶图谱快速生成高分辨率、有序的全基因组限制性内切酶图谱的方法。该技术提供了一种从纯菌株或混合样品中全面了解细菌、酵母或真菌的基因组结构的方法。这一技术方法的优势在于能够提供有序、高分辨率的多于100个限制性内切酶酶切位点/ 数MB的图谱，而不

12、需要进行耗时和耗力的基因组测序。3.2光学图谱技术的实验步骤181 提取DNA从微生物细胞中提取高分子量的DNA(High molecular weight ,HMW DNA)。将微生物细胞包埋在低熔点的琼脂糖中，用裂解液进行处理。再将裂解液完全洗净，在70下溶解琼脂糖，使用-琼脂糖酶释放出HMW DNA。样品的预处理随微生物样品不同而异。2 DNA固定与消化基因组DNA以单分子的形式固定在带电的光学基质上，再使用限制性内切酶进行消化。将制备HMW DNA载入微流体光学芯片的阵列孔道中。基因组DNA以单个DNA分子的形式固定在长的平行的阵列中，固定的DNA依然保持其原有的静电属性。DNA被限制

13、性内切酶处理，切得的限制性酶片段按DNA原来的顺序保持不变。3.染色与组装将基因组DNA进行染色、扫描、计算、组装一系列工作，作出全基因组限制性内切酶酶切图谱。消化的DNA使用荧光染料染色，再置于全自动的荧光显微观察仪采集数据。OpGen公司配套的图像分析软件测量每个DNA分子限制性内切酶片段的大小和顺序，光信号转化成数字信号生成单个DNA分子的限制性内切酶酶切位点图谱。通过DNA分子限制性内切酶酶切位点图谱相互重叠的部分拼接得到全基因组限制性内切酶酶切位点图谱光学图谱。4. 分析应用OpGen的“MapSolver”光学图谱软件，可以比较不同的基因组的遗传变异，完成高分辨率的流行病学分析和加

14、快基因组测序工作的完成。3.3光学图谱技术的优点及应用该技术拥有很大的优点：1.不用扩增 ；2.无需PCR反应； 3.不需基因组抽提的试剂； 4.不需末端配对的文库； 5.不用具有序列信息； 6.强大的分析软件 基因组光学图谱技术在比较基因组学、流行病学、食品安全、菌种质量监控、全基因组序列拼接、菌株分型等有重要应用。展望随着HGP的实施与完成，DNA测序技术得到了飞跃的发展，在科技迅速发达的当今社会，新的测序技术提出的周期也越来越短。越来越多的生物全基因组的成功测序，也极大的推动了遗传学、免疫学、肿瘤学等的理论研究，也促进了基因组信息在临床医学中应用。测序技术发展的趋势就是不断发展，创造更为

15、科学、廉价、更高效率的测序技术，使得其更好应用在临床应用中。但是随着个人基因图谱时代的来临，同样测序技术也面对很多挑战，比如隐私问题，基因图谱是个人的隐私，如何保证在治疗过程中被泄露或是被他人改变基因图带来很多的负面问题。伴随着测序技术的发展，整个社会的道德方面也要同时处理好才能使测序更好的造福人类。参考文献1 Watson J.D., Crick F.H.C. A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature.1953, 171:737-738. 2 Venter J. C. et al. The Sequence of the Human G

16、enome. Science.2001,291:1304 -13513 Lander E. S. et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001, 409: 860-921.4 Sjblom et al, The Consensus Coding Sequences of Human Breast and Colorectal Cancers. Science. 2006, 314:268-274.5 Jay S., Hanlee J. Next-generation DNA sequencing

17、. Nature .2008 ,26:1135-1145. 6 Sanger F. ,Coulson A.RA rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 1975,94:44l-448.7 Maxam A.M. ,Gilbert W.A. A new method for sequeneing DNAPNAS. 1977,74:560-564.8 Sanger F.，Nieklen S. Coulson A.RDNA sequencing

18、with chain-terminating inhibitorsPNAS.1977,74:5463-5467.9 Stephan C. S. Next-generation sequencing transforms todays biology. Nature Methods .2008,5:16-1810 Elaine R. M. Next-Generation DNA Sequencing Methods . Annual Review of Genomics and Human Genetics.2008,9:387-40211 12 Jared C. R. et al. Analy

19、sis of Genetic Inheritancein a Family Quartet by Whole-Genome Sequencing. Science. 2010,328: 636-639 13 Jett J.H. High-speed DNA sequencing: an approach based upon fluorescence detection of single molecules . Journal of Bimolecular Structure & Dynamics, 1989,7(2):301-309.14 Timothy D. Harris, et al.

20、 Single-Molecule DNA Sequencing of a Viral Genome. Science.2008, 320:106-109.15 Doron Lipson,et al. Quantification of the yeast transcriptome by ingle-molecule sequencing. Nature. 2009,27:652-659. 16 17Phil L. et al. Optical mapping as a routine tool for bacterial genome sequence finishing. BMC Genomics. 2007, 8:321-32818