宏基因组技术在开发未培养环境微生物基因资源中的应用.doc

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1、宏基因组技术在开发未培养环境微生物基因资源中的应用周双摘要：环境微生物宏基因组是一个巨大的基因资源库,而人类对自然环境中约99%的微生物不能用传统的方法进行纯培养，因此,未培养微生物的基因资源开发利用受到限制。宏基因组技术直接提取环境样品总DNA, 避开了微生物分离培养的问题,极大扩展了微生物资源的利用空间。本文介绍了宏基因组的概念、研究方法包括DNA 提取、文库构建与筛选等及在定向筛选抗生素产生菌方面的应用。关键词：宏基因组;未培养微生物；基因筛选Application of metagenomic technique in the exploring of uncultured Envir

2、onmental microbial gene resourceZhou ShuangAbstract: Microbialmetagenome is the largest gene reservoir in environment. It is known that about 99% microorganisms in natural environment couldn t be obtained their pure culture by traditional culture methods. Therefore, exploring uncultured microbial ge

3、ne resource has been restricted. Metagenome libraries can be constructed by directly extracting DNA from environ- mental samples to avoid the limitations of culture dependent methods . Metagenomic technique has greatly enhanced the utilization of microbial resource. The notion and methods of study i

4、n m etagenome, including DNA extracting , libraries construction and screening, and application of metagenomic technique in the screening certain antibiotic microorganism producing strains were introduced in this paper.Keywords: Metagenome; Uncultured microorganisms; Gene screening微生物世界是分子多样性最大的天然资源

5、库，基于菌株水平的传统分离培养技术为人们认识微生物多样性提供了可能，但是传统的分离培养方法限制了认识微生物世界的视野。目前已知的微生物资源种类仅占实有总数的1%10%，自然环境中超过 99%的微生物不能用传统的方法进行纯培养1，因而也不能对它们开展依赖于纯培养的生物技术或基础方面的研究。近年来发展起来的宏基因组学技术，它是通过直接提取特定环境中全部微生物的总基因组DNA并克隆到适宜的微生物宿主中，然后筛选出目的克隆与基因的方法。利用分子生物学的研究方法绕过纯培养技术来研究微生物的多样性及功能，提供了一种探知微生物多样性结构和功能基因组的免培方法，是一条寻找新基因及其产物的新途径。微生物药物合成

6、菌的定向筛选是指从众多的微生物菌种中筛选特定次生代谢产物产生菌的筛选方法。该方法目前多采用传统的药物筛选策略，从产生菌的种类、形态特征并结合目标化合物的活性进行筛选。已有的研究证实微生物次级代谢产物生物合成基因具有呈簇排列的特征，即与特定产物合成相关的结构基因、调节基因、耐药性基因和转运蛋白等集中位于染色体的一段连续区域2。经过科学家的努力，大量各类抗生素合成基因簇也得到了深入的研究，如聚酮类化合物的聚酮类化合物合成酶(PKS)生物合成基因簇3，井冈霉素生物合成基因簇4，南昌霉素生物合成基因簇4等等。这为微生物次级代谢产物药物的研究打下了坚实的基础。本研究结合土壤宏基因组技术和抗生素生物合成基

7、因簇的研究结果，建立了一种快速从土壤环境中筛选特定类型抗生素合成菌的现代分子生物学筛选方法。1、 宏基因组学的发展历史宏基因组( metagenome) 是由Handelsman等5提出的新名词， 其定义为 the genomes of the total microbiota found in nature，即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间。目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和，也可指特定环境或共生体内所有生物遗传物质的总和，是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术。 而所谓

8、宏基因组学( metagenomics)就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。2、 宏基因组技术研究方法2.1 环境样品及目的基因/基因组富集在宏基因组文库筛选过程中，目的基因仅占总 DNA的一小部分，对环境样品的预富集可以大大提高目的基因的检出几率。预富集技术包括细胞水平富集和基因/基因组水平富集。2.1.1 样品和培养物富集 可以根据细胞大小不同的特性,采用过滤技术有效对宏基因组进行富集，利用选择培养基对目的微生物进行富集培养, 也是有

9、效的富集手段之一,其中最常用的方法是底物选择,此外还包括营养选择以及物理化学指标选择。但是,由于富集培养选择性地富集了具有快速生长特性的菌群, 因此导致大部分物种多样性信息丢失。通过先在严格胁迫条件下短期处理,然后改为较温和的处理条件, 可以从一定程度上克服这种方法的局限性。2.1.2 基因组和基因的富集 通过基因组富集可以富集微生物种群中最活跃的部分，如稳定同位素探针技术、 抑制性消减杂交技术、差异显示技术、用噬菌体展示6、亲和捕获7及DNA微阵列8等技术可以对基因(组)进行预富集。2.2 样品总DNA提取样品总DNA的提取方法有直接提取法9与间接提取法10。直接提取法是将样品直接悬浮于裂解

10、缓冲液中，然后再提取。此方法简便，成本较低，但由于机械损伤较大，因而所获得的片段较小；间接提取法是采用较温和的方法，将分离出来的菌体用低熔点琼脂糖等包埋来进行DNA的提取。 该方法可以获得片段较大的DNA，但是成本高，可能会在微生物分离时有丢失的现象。2.3 宏基因组DNA/cDNA文库的构建2.3.1 载体的选择载体选择的原则是有利于目的基因的扩增、表达及在筛选细胞毒类物质时表达量的调控等等。细菌人工染色体(BAC) 和柯斯质粒(Cosmid)是目前构建宏基因组文库常用的载体,前者插入的片段大(可达350kb),但克隆效率低，后者插入的片段较小(约为2040kb)，但克隆效率较高。很多微生物

11、活性物质是其次生代谢产物，代谢途径由多基因簇调控，因此需要尽量插入大片段 DNA以获得完整的代谢途径。Fosmid载体的插入片段与Cosmid相当,但Fosmid插入片段在E. coli中的克隆效率和稳定性更高11。BAC和Cosmid载体在宿主细胞中的拷贝数低,基因扩大表达存在一定困难，为了提高宏基因的表达,便于重组克隆子活性检测,可以直接利用表达载体构建宏基因组文库。表达载体可插入的宏基因片段一般小于10 kb，适合于筛选单基因或小操纵子产物。2.3.2 宿主的选择宿主菌株的选择主要考虑转化效率、重组载体在宿主细胞中的稳定性、宏基因的表达、 目标性状(如抗菌性)及缺陷型等因素。E.coli

12、是最为常用的宿主，此外，链霉菌和假单胞菌也可以作为构建文库的宿主1214。研究经验表明,不同微生物种类所产生的活性物质有明显差异，不同的研究目标应选择不同的宿主菌株。2.3.2 宏基因组cDNA文库(转录库)构建一直以来，对 cDNA克隆文库的大规模测序是发现新真核基因的一种快速方法，但由于真核生物基因组存在内含子序列，因此宏基因组表达库技术往往并不适合开发真核基因资源15。此外，在操作上也存在一些需要解决的问题，首先，完整宏基因组mRNA的提取十分困难；其次，由于宏基因组cDNA文库不包括非表达基因，因此所包含的信息不如基因组文库全面；此外，RT-PCR扩增限制了插入子的大小，并且使文库具有

13、较强的序列偏倚性16。2.4 宏基因组文库测序和拼接纯培养微生物基因组DNA的测序分析技术已比较成熟，为完整宏基因组测序和最终开发新的基因资源奠定了坚实的基础16,17。近年来,随着自动化高通量测序设备和强大序列分析软件的开发，使完整宏基因组测序具备了技术可行性。但是，完整宏基因组测序任务仍十分繁杂，因此,昂贵的费用和繁冗的工作成为限制宏基因组测序技术应用的主要原因。2.5 宏基因组文库的筛选由于环境样品中微生物种类繁多，宏基因组文库容量一般较大，活性克隆子的筛选成为开发新活性物质资源的瓶颈。近年来，根据研究目的不同,相继报道了各种宏基因组文库筛选方法。根据是否依赖已知序列信息，大致可以分为两

14、大类，即序列依赖性筛选和非序列依赖性筛选。如我们常见的反转录PCR、DNA微阵技术、亲和捕获等技术的应用3、 宏基因组技术在定向筛选抗生素产生菌方面的应用 自从1991年Pace等首次构建了海洋微小浮游生物环境DNA文库以来，目前已构建了土壤、海洋、人唾液、堆肥样品等环境样品的宏基因组文库。为了快速从土壤中定向筛选抗生素产生菌，利用宏基因组技术进行了土壤中抗生素产生菌快速筛选方法的探索。如要得到土壤中Herbimycin产生菌时，可根据微生物抗生素Herbimycin合成基因簇设计引物进行PCR扩增，从而快速定向筛选土壤中Herbimycin抗生素产生菌。并从阳性土样中分离纯化该产生菌并进行培

15、养, 通过对该菌代谢产物进行高效液相色谱分析从而最终确认特定抗生素产生菌。不 同抗生素的产生菌的筛选其要旨就是根据不同微生物抗生素合成基因簇设计不同的引物而其筛选方法基本一致。4、结语宏基因组克隆充分运用前沿分子生物学技术，不依赖于传统培养方法发掘丰富的微生物资源, 同时也是一种基因资源的保存形式。但是，正如上文所述，宏基因组技术还存在诸多问题亟待解决。不管怎样，随着研究方法的不断进步和创新, 宏基因组技术在微生物资源的开发利用上无疑能够发挥巨大的潜力。我国地域辽阔，蕴藏着丰富的微生物资源,但是应用宏基因组技术开发环境微生物资源的研究才刚刚起步18,19，许多新的技术方法还有待建立和不断完善。

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