化学合成十三肽及其副产物液质联用分析.pdf

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1、2004年9月湖南师范大学自然科学学报Vol.27No.3Jour Nat Scie HunanNorm UnivSep.,2004第27卷 第3期化学合成十三肽及其副产物液质联用分析化学合成十三肽及其副产物液质联用分析唐新科,王贤纯,梁宋平(湖南师范大学生命科学学院蛋白质化学教育部重点实验室,中国 长沙410081)摘摘要要:利用反相高效液相色谱(RP2HP LC)与电喷雾质谱(ESI2MS和MSMS)联用技术直接分析用芴甲氧羰基(Fm oc)固相多肽合成方法手工偶联合成的一个十三肽(Lys2Lys2G lu2Ser2Asp2Phe2Leu2Met2Phe2Val2Tyr2Leu2Val,M

2、r1617.8)粗产品,以探索RP2HP LCESI2MS和MSMS在固相多肽合成产物分析和副反应机制研究中的应用.RP2HP LC结果显示:合成粗产物中含有1个主成分,2个次要成分和多个微量成分;与之联用的电喷雾质谱同步准确地测定出各成分的相对分子质量(mz)并自动对各主要成分的化学结构进行了串联质谱分析.结果证明,粗产物中的主成分即为目标十三肽,另外几个主要副产物为十三肽的残缺肽或氧化肽.对色谱和生物质谱联用技术分析合成多肽的意义和副产物形成的可能机制进行了讨论.关键词关键词:色谱2质谱;合成多肽;副产物中图分类号中图分类号:Q532.1文献标识码文献标识码:A文章编号文章编号:10002

3、2537(2004)0320075204Analysis of Crude Synthetic Product of a Tridecapeptideby RP2HPLCESI2MS and MSMSTANG Xin2ke,WANG Xian2chun,LIANG Song2ping(The Key Laboratoryof Ministryof EducationCollegeof Life Science,HunanNormal University,Changsha410081,China)AbstractAbstract:By using reverse2phase high perf

4、ormanceliquid chromatography(RP2HPLC)ion trap electrospraymassspectrometry(ESI2MS),the mainproduct and the side productsof solid phase synthesisof the tridecapeptidewere inves2tigated.One major com ponent,two minor com ponents and several trace2level com ponents were detected on the HPLCchromatogram

5、.The accurate molecular weightsof each com ponents were determined.The amine acid sequencesof themain com ponentswere analyzedby tandemmass spectrometry(MSMS)synchronously.Theresults showedthat the majorcom ponent of the crude product was the desired tridecapeptide and the main by2productswere deriv

6、edfrom the oxidationor deformityof the desiredpeptide.Thesignificanceof the applicationof biologicalmass spectrometrycoupledwith HPLCto syntheticpeptide analysis and the possibleoriginsof the by2products were discussed.K Keyey w wordsords:chromatography2mass spectrometry;syntheticpeptide;by2product固

7、相化学多肽合成是蛋白质工程研究领域中重要技术之一,该技术在蛋白质化学、蛋白质结构功能研究1,2以及医药学等研究领域中发挥着越来越重要的作用.然而,化学合成多肽时往往不可避免地伴有一系列副反应,不仅影响合成产物的纯度,而且还可能影响到目标产物的得率,所以需要根据不同的情况采取不同的有效方式对合成产物进行分离和鉴定,并进一步对副反应的发生机理进行探讨,为改进合成条件,减少副反应,提高合成产物纯度提供参考依据.质谱(MS)作为一种分析手段已出现几十年,但直到20世纪80年代“软”电离技术的出现才为分析强极收稿日期收稿日期:2004204205基金项目基金项目:国家自然科学基金(39990600)和湖

8、南省自然科学基金(01JJY2028)资助课题作者介绍作者介绍:唐新科(19712),男,湖南安仁人,湖南师范大学硕士研究生,主要从事蛋白质组学研究.76湖南师范大学自然科学学报第27卷3 性、热不稳定和难挥发性的生物样品提供了可能,生物质谱(Bio2MS)从而发展起来.基于“软”电离技术和碰撞诱导裂解(CID)技术以及近年来快速发展起来的串联质谱仪(tandem MS或MSMS),使质谱在分析生物分子结构方面进一步得到增强,特别是液相色谱与电喷雾电离串联质谱仪的偶联(LC2ESI2MSMS)使之在皮4 摩尔(pmol)左右的水平上能快速灵敏地对合成产物进行分子量测定和化学结构分析,从而更有力

9、地推动了化学合成多肽的鉴定和副反应机理的研究.到目前为止,已有多种副反应机制得到阐明,如氨基酸残基去5 6 保护不完全;裂解时脱落的保护基团转移至其他氨基酸残基上;Ser,Thr或Tyr残基的侧链羟基2OH被酰7,84 9 基化;Asp脱H2O或Gln脱NH3后形成琥珀酰亚胺;Asn脱H2O形成相应的腈以及保护基团异常裂解等.本文利用反相高效液相色谱2离子阱电喷雾串联质谱联用技术直接分析固相化学合成十三肽粗产物,一次性鉴定出目标肽以及两个主要副产物的化学结构,并就液相色谱和生物质谱联用技术分析合成多肽的意义以及副产物形成的可能机制进行了讨论.1 1材料和方法材料和方法1.1.1 1主要试剂主要

10、试剂9 乙腈(CAN)和甲酸分别为国产色谱纯和分析纯试剂;十三肽为本实验室参照Atherton等的方法手工固相合成.1.1.2 2RPRP2HPHP LCLCESIESI2MSMS和和MSMSMSMS分析分析RP2HPLCESI2MS和MSMS分析在Agilent1100HP LC和与之偶联的Bruker Esquire2LC离子阱电喷雾串联质谱仪上进行.合成粗产品的水溶液经超滤(0.22m)后直接用于分析.RP2HPLC分析中采用C18反相柱(2.1 mm150 mm).洗脱液A为0.1%甲酸水溶液,洗脱液B为含0.1%甲酸的ACN.洗脱梯度为:1040min,25%70%B;流速0.2 m

11、Lmin.紫外280 nm检测.开始洗脱约10 min后再将流出液直接引入质谱仪离子源,以减少合成粗产品对质谱离子源的污染.质谱分析主要参数:正离子模式,自动MSMS(但有时根据需要运用仪器操作软件有目的地选择某一肽段进行MSMS),碎裂电压为1.1 V,喷雾压力为50 Pa,干燥气(N2)流速为8.0 Lmin,干燥气(N2)温度为325,碰撞气为氦气(He).质谱结果借助仪器附带的Bruker DataAnalysis数据分析软件进行处理.2 2实验结果实验结果2.2.1 1RP2HPLC分离成分的分子量在线检测分离成分的分子量在线检测合成粗产品的RP2HPLC图(图1)显示,样品中含有1

12、个主成分、2个次要成分及多个微量成分.质谱分析结果表明,样品中主成分的mz+值为1 619.0,与十三肽理论分子量(MH)1618.8基本相符,提示样品中的主成分为目标十三肽,其他成分为副产物.虽然可根据副产物分子量的变化,和与目标十三肽比较相对保留时间,对它们的性质(如结构和疏水性变化等)作出一些推断,但与目标肽的最终确定一样,还需要进一步收集有关结构信息加以证实.2.2.2 2串联质谱分析串联质谱分析图图1 1合成十三肽粗产物RP2HP LC图在分析过程中,质谱仪自动对来自HPLC的洗脱成分交替进行一级质谱(MS)和二级质谱(MSMS)处理.借助分析软件,获得了有关主成分(mz为1618.

13、8即色谱图中的成分1)和两个副产物(mz分别为1 490.1和1 634.5即分别为色谱图中的成分2和3)较完整的化学结构信息.其他微量成分由于含量太低,在本实验条件下没有获得其MSMS图或MSMS谱峰太少,而未能作出其化学结构的结论.2.2.1主成分的结构鉴定成分1即主成分的质谱分析结果见图2.图中可观察到主成分分子离子(图2A中810.1为目的肽双电荷质谱峰,1 619.0为目的肽的单电荷质谱峰)及其经CID过程产生的一系列碎片离第3期唐新科等:化学合成十三肽及其副产物液质联用分析77子(图2B),其中丰度较大的为肽键断裂后电荷保留于N端形成的b系列碎片离子b2及b5b12,同时还可观察到

14、部分肽键断裂后电荷保留于C端形成y系列碎片离子y10y12,综合分析这两个系列碎片离子,再根据系列碎片离子间的质量差可以确定主成分的氨基酸序列为:H2N2Lys2Lys2Glu2Ser2Asp2Phe2Leu2Met2Phe2Val2Tyr2Leu2Val2COOH即为目的十三肽.A一级质谱,B二级质谱,C十三肽b系列和y系列碎片离子质量理论值图图2 2成分1的质谱分析图2.2.2副产物的结构鉴定成分2的结构鉴定.由于合成十三肽的真实性已经确定,所以利用MSMS数据鉴定副产物结构时用与十三肽序列对比的方式进行分析.成分2从相对分子质量(图3A中745.6为该副产物的双电荷质谱峰,1 490为单

15、电荷质谱峰)推断,该成分为十三肽丢失N端第三个氨基酸残基E(Mr=129)(m后形成的“残缺肽”z=1 619-129=1 490).MSMS分析结果(图3B)进一步证实了这种推测,因为在图3B中可观察到部分系列碎片离子y2y6及b1和b2,而没有目标肽b系列的其他碎片离子,但有b42129(344.3),b52129(459.3),b62129(606.4),b72129(719.5),b82129(850.5),b92129(997.6),b102129(1 096.6),b112129(1 259.7),b122129(1 372.8)系列离子.图图3 3成分2的质谱分析图(A一级质谱,

16、B二级质谱)78湖南师范大学自然科学学报第27卷成分3的结构鉴定.该副产物的MS与MSMS分析结果见图4.结合其分子量(图4A中817.8为该副产物双电荷质谱峰,1 634.5为其单电荷质谱峰)分析,该成分为目的肽氧化所致(mz=1 618.8+16),而最可能被氧化的氨基酸残基是Met和Tyr.MSMS(图5B)分析结果表明,成分3经CID过程裂解后的碎片离子中8有b5,b6,b7,b8+16,b9+16,b10+16,b11+16和y2,y3,y5,y6+16,证实是十三肽的第8位Met(Met)残基而不是第11位的Tyr残基被氧化.图图4 4成分3的质谱分析图(A一级质谱,B二级质谱)3

17、 3讨论讨论在固相化学合成多肽时,由于“残缺肽”和“化学修饰肽”的产生,使目标产物的得率和纯度明显降低,如何优化合成条件减少副产物的生成,在固相多肽合成研究中越来越受到重视,因此在寻找合成高得率和高纯度多肽的最佳条件上,不少学者做了大量的工作.实验中RP2HPLC图谱结果显示,十三肽合成粗品中除目标肽外,还有几个含量较高的副产物存在,表明在手工操作合成该十三肽时某些不利因素明显干扰了多肽的正常合成.其中含量相对较高的副产物(成分3)由目标肽十三肽氧化生成.已有的实验结果表明,氧化是导致多肽副产物形成的重要原因之一,而且Tyr和Met都是易被氧化的氨基酸残基,经MSMS分析,结果证8118明成分

18、3的氧化位点是Met而不是Tyr,即Met生成了甲硫氨酸亚砜类物质.综合分析手工多肽合成全过程,洗涤树脂时采用抽气过滤的方式可能是造成氧化的主要原因,提示在合成序列中有易氧化氨基酸残基存在时,尤其应注意采取防氧化措施,如采用惰性气体抽滤和避光操作等.另外一个已获结构鉴定的副产物(成分2)为丢失一个氨基酸残基后的“残缺肽”.推测在偶联过程中该氨基酸残基有部分没有被偶联,而后面的氨基酸残基都被正常偶联,造成部分合成产物缺失这一氨基酸残基,从而产生这一残缺肽.这可能与偶联操作条件(如偶联时间等)控制不当有关.其他一些副产物在本实验条件下没有得到鉴定,可能是含量太低不能很好地进行CID,从而得不到较全

19、的二级质谱图或根本没有二级质谱图.MS在蛋白、多肽分析中已经得到了广泛应用,特别是在分离纯化后的在线分析中MS的高灵敏性、快速性适合多肽物质分析鉴定,色谱2质谱联用的方式直接分析合成产物,更是一种快速、灵敏、省时、省力的方法,它既利用了两种检测方式检测样品中含量较高的成分,提高鉴定的可靠性,又利用了质谱检测灵敏度高的特点,检测样品中的微量成分.另外样品几乎无需作预处理,从而不但节省了时间和样品,还避免了其他分析方法因多步骤纯化、衍生等而带来的副反应干扰.基于CID过程的MSMS技术的应用,既可一次性测定合成粗产品中各成分的分子量,又可获得目标肽和各主要副产物的共价结构信息,包括化学修饰反应发生

20、的具体位置,从而有利于快速、准确地确定合成目标肽的真实性和研究副反应发生的可能机制.(下转第下转第8282页页)10,1182湖南师范大学自然科学学报第27卷作为一个丝氨酸激酶,rhomboid家族已知成员最主要的功能是可以促进spitz的水解,以此来影响其受体EG213FR的功能,由于EGF信号途径广泛参与了包括大脑、心脏等在内的多种器官的发育,所以其表达水平的改变可能也与发育过程中的多种调控事件相关.RHBDL8在心脏、骨骼肌的表达水平的在胚胎发育期间相当高,而在成体则相对很低,这一变化很可能是其发育调控功能的体现.而其在脑部的持续高水平表达则有可能与大脑的正常功能发挥有关,但其具体功能尚

21、需进一步研究.参考文献参考文献:1WASSERM ANJ,URBANS,FREEMANM.Afamilyof rhomboid2like genes:Dros ophila rhomboid21 and roughoidrhomboid23 cooper2ate to activate EGF receptor signalingJ.Genes Der,2000,14:1 65121 663.2 BIER E,JANL,JAN Y.Rhomboid,a gene requiredfor dors oventralaxis establishmentand peripheral nerv ous

22、 systemdevelopmentindros ophila melanogasterJ.Genes Der,1990,4:1902203.3 URBAN S,LEE J,FREEMANM.Dros ophila rhomboid21 definesa familyof putative intramembraneserine proteasesJ.Cell,2001,107:1732182.4WU X,G OLDEN K,BODMERR.Heart developmentin dros ophila requiresthe segmentpolaritygenewinglessJ.Deve

23、lopmentalBi2ology,1995,169(2):6192628.5WU S,PARKM,G OLDEN K.The wingless signalingpathway is directily involved in Dros ophila developmentJ.Development,1996,177(1):1042116.6 LUO K,Y UANW,ZHU C,et al.Expressionof a novel Krupple2like zinc2finger gene,ZNF382,in human heartJ.BiochemBio2phys Res Commun,

24、2002,299(4):6062612.7ZENG W,Y UANW,WANGY,et al.Expressionof a novelmemberof sortingnexingenefamily,SNX2L,in humanliver developmentJ.BiochemBiophysRes Commun,2002,299(4):5422528.(Cys)2(His)2 zinc2fingertranscriptionfactor ZNF323in early humanembry onic de28 PI H,LI Y,ZHU C,et al.A novelhumanSC ANvelo

25、pmentJ.BiochemBiophysRes Commun,2002,296(1):2062213.9 BATE MAN A,BIRNEYE,CERRUTIL,et al.Thepfamproteinfamilies databaseJ.NucleicAcids Research,2002,30:2762280.10 卢圣栋.现代分子生物学实验技术.第二版M.北京:中国协和医科大学出版社,1999.(上接第上接第7878页页)参考文献参考文献:1 ALITALO K,PART ANEN P,VAHERIA.Syntheticpeptide in biologyand medicineM.A

26、msterdamNewY orkOx ford:Elsevier Sci2ence Press.1985.2 王贤纯,梁宋平,罗泽民.虎纹捕鸟蛛毒素2I突变体A1Y2HWTX2I的固相合成和生物学活性测定J.中国生物化学与分子生物学报,2000,16(3):3572362.3 李蓉,梁恒.生物质谱2蛋白质组研究的关键技术J.化学通报,2002:11:7482757.4 SIUZDAK G.Mass spectrometryfor biochemistryM.San Dieg o:Academic Press,1996:13218.5 SCH NO LZERM,JONESA,ALEWOOD P

27、F.Ion2spray tandem mass spectrometryin peptide synthesis:structuralcharacterizationofminorby2productsin the synthesisof ACP(65274)J.Anal Biochem,1992,204(2):335243.6ENGE BRETSE N M,AGNER E,SANDONSH AMJ.Unexpectedlability of cysteine acetamidomethylthiol protecting group.Tyrosinering alkylationand di

28、sulfidebondformationupon acidolysisJ.J Pept Res,1997,49(4):3412346.7 LITOWSKIJ R,SEMCH UK P D,MANTC T.Hydrophilicinteractioncation2exchangechromatography for the purificationof syntheticpeptidesfrom closelyrelated impurities:serine side2chain acetylatedpeptidesJ.J Pept Res,1999,54(1):1211.8 MARTI NE

29、ZJ,TOLLEJ C,BODANSZKY M.Side reactionsin peptide synthesisJ.IntJ Pept ProteinRes,1997,13(1):22227.9 ATHERT ON E,SHEPPARDR C.Solid phase peptide synthesis:a practical approachM.Ox ford:Oxford UniversityPress,1989.10 郑集,陈均辉.普通生物化学M.北京:高等教育出版社,2001.11王贤纯,陈平,梁宋平.液相色谱2串联质谱分析化学合成多肽及其主要副产物J.中国生物化学与分子生物学报,2003:19(5):5762581.