实验六ABO血型鉴定、血涂片的制作与血细胞显微观察(精).pdf

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1、实验六：实验六：ABOABO 血型鉴定、血涂片的制作与血细胞显微观察血型鉴定、血涂片的制作与血细胞显微观察一、一、实验目的实验目的1.了解 ABO 和 Rh 血型分类系统的背景知识和遗传学原理2.掌握微量采血及血涂片的制作方法3.学习使用光学显微镜观察和区分红细胞与各种白细胞二、二、实验材料实验材料1.实验材料：医用采血针、酒精棉球、载玻片、血推片、消毒牙签2.实验试剂：瑞氏染液、抗 B 血清、抗 A 血清、生理盐水、蒸馏水3.仪器设备：Motic 光学显微镜三、实验内容和方法三、实验内容和方法1 ABO1 ABO 血型鉴定血型鉴定1.1 取一块清洁玻片，用记号笔标上记号。1.2 用小滴管吸

2、A 型标准血清（抗 B）一滴加入左侧，用另一小滴管吸 B 型标准血清（抗 A）一滴加入右侧1.3 以穿刺法自左手无名指指尖取血，在玻片的每侧各放入一小滴血，用牙签搅拌，使每侧抗血清和血液混和。每边用一支牙签，切勿混用。1.4 静置室温下 1015min 后，观察有无凝集现象，并据此判断血型。2 2 血涂片的制作及血细胞观察血涂片的制作及血细胞观察2.1 取末捎血一滴置于玻片的一端,左手持载玻片,右手以边缘平滑的推片的一端从血滴前方后移接触血滴，血滴即沿推片散开。然后便推片与载片夹角保持 30-45 度平稳地向前移动,载片上保留下一薄层血膜2.2 血涂片制成后可手持玻片在空气中挥动,使血膜迅速干

3、燥,以免血细胞皱缩.2.3 用蜡笔在血膜两侧划线,以防染液溢出,然后将血膜平放在染色架上.加瑞氏染液 2-3 滴,使覆盖整个血膜,固定 0.5-1.0 分钟.滴加等量或稍多的新鲜蒸馏水,与染料混匀染色 5-10 分钟.2.4 用清水冲去染液,待自然干燥后或用吸水纸吸干,即可置血涂片于显微镜下进行镜检。2.5 白细胞分类计数:选择涂片的体尾交界处染色良好的区域,在油镜下计数 100个红细胞,按其形态特征进行分类计数,求出各类细胞所占比值。注：注：1.1.瑞氏染液瑞氏染液:瑞氏染料 1g 加甲醇(AR)600ML。将瑞氏染料放在清洁干燥乳钵中,加少量甲醇,充分研磨使染料溶解.将已完全溶解的部分倒入

4、棕色试剂瓶中,未溶解部分再加少量甲醇研磨,直至染料完全溶解于甲醇为止.新配制的染料偏碱,须在室温和 37 下一定时间待染料成熟,主要美蓝逐渐增多为天青 B 后才能使用.贮存时间越久染色效果越好,因此,Deamgilliland 等采用吸光度比值(rA)作为瑞氏染料的质量规格.rA 测定方法如下:取瑞氏染液 15-25ul(视染液浓度而定 )加甲醇 10ml 稀释,混匀后以甲醇为空白管分别以波长 650nm,525nm 比色,rA=A650/A525。因为美蓝吸收峰为波长 650nm,伊红吸收峰波长为 525nm,天青 B 吸收峰也为 650nm,但吸光度 A 约为美蓝的一半.所以新配制染料的

5、RA 接近 2,随着美蓝逐渐氧化为天青 B,RA 也相应下降,RA 下降达 1.30.1 即可使用.瑞氏染料在贮存过程中必须塞严,以防甲醇挥发和氧化为甲酸.有人主张配方中加入 30ml 甘油,防止甲酸挥发,并可使细胞染色清晰.甲醇必须纯净,如甲醇中丙酮含量过多,染色偏酸,使细胞着色不良.2.2.磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(PH6.4-6.8)(PH6.4-6.8)：磷酸二氢钾 0.3g 加磷酸氢二钠 0.2g 再加蒸馏水至 1000ml,配制成磷酸盐缓冲液调整 PH,如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替.3.3.白细胞分类计数正常参考值白细胞分类计数正常参考值细胞类别 成人杆状核 0.01-0.05分叶

6、核 0.50-0.70嗜酸性粒细胞 0.005-0.05嗜碱性粒细胞 0-0.01淋巴细胞 0.20-0.40单核细胞 0.03-0.08四、注意事项四、注意事项1)玻片的清洗：新玻片常有游离碱质,因此应用清洗液或 10%盐酸浸泡 24 小时,然后再彻底清洗。用过的玻片可放入适量肥皂水或合成洗涤剂的清水中煮沸 20 分钟,再用热水将肥皂和血膜洗去,用自来水反复冲洗,必要时再置 95%乙醇中浸泡 1 小时,然后擦干或烤干备用。使用玻片时只能手持玻片边缘,切勿触及玻片表面;,以保持玻片清洁,干燥,中性、无油腻。2)细胞染色对氢离子浓度十分敏感,在染色过程中玻片必须化学清洁,配制瑞氏染液必须用优质甲

7、醇,稀释染液必须用缓冲液,冲洗用水应近中性,否则各种细胞染色反应异常,致使细胞的识别困难,甚至造成错误。3)一张良好的血片,要求厚薄适宜,头体尾分明,分布均匀,边缘整齐,两侧留有空隙。血片制好后最好立即固定染色,以免细胞溶解和发生退行性变。4)血膜未干透,细胞尚未牢固附在玻片上,在染色过程中容易脱落,因此血膜必需充分干燥.5)染色时间与染液浓度,室温高低,细胞多少有关.染液越淡,室温越低,细胞越多,所需染色时间越长或应适当增加染液量,因此染色时间应视具体情况而定.特别是更换新染料时必须经试染,摸索最佳染色条件.6)染液不可过少,以防蒸发干燥染料沉着于血片上难冲洗干净.7)冲洗时应用流水将染液冲

8、去.不能先倒掉染液,以免染料沉着于血片上.8)染色过深可用甲醇或酒精适当脱色,最好不复染,必须复染时,可将染液先稀释好再复染.9)染色时应注意保护血膜尾部细胞,不能划掉.因为体积较大细胞常在此处出现.染色结果:在正常情况下血膜外观为粉红色,在显微镜下红细胞呈肉红色；白细胞胞浆能显示各种细胞的特有色彩,细胞核染紫红色,染色质清楚,粗细松紧可辨。染色结果偏酸,则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红,白细胞核呈浅蓝色或不着色；染色结果偏碱,则所有细胞染成灰蓝色,颗粒深暗，嗜酸性颗粒可染成暗褐色,甚至紫黑色或蓝色。嗜中性颗粒偏粗,偏碱(紫黑色).血片原处呈绿色.五、思考题五、思考题(1)如何区别血液的凝集和凝固？其机理有何差别？(2)根据你的血型，判断你能接受何种血型并且能够给何种血型供血？(3)O 型血人又被称为“万能供血者”，试根据 ABO 血型分型作出你对这一说法的理解(4)试根据父母的血型，写出后代的可能血型：