蛋白质组与蛋白质组学精选PPT.ppt

《蛋白质组与蛋白质组学精选PPT.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质组与蛋白质组学精选PPT.ppt（49页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、关于蛋白质组与蛋白质组学第1页，讲稿共49张，创作于星期三蛋白质组学蛋白质组学DNAmRNA蛋白质转录翻译基因蛋白质细胞特异性基因表达生理状态蛋白质相互作用温度应激状态培养条件药物作用数量有限结构相对稳定复杂性多变性直接反应生命现象复杂的调控第2页，讲稿共49张，创作于星期三蛋白质组与蛋白质组学的定义蛋白质组与蛋白质组学的定义 蛋白质组 protein+genome proteome 一种基因组所表达的全套蛋白质 一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质第3页，讲稿共49张，创作于星期三蛋白质组学v旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式v从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质的组

2、成、结构、性质、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间、蛋白质与大分子之间的相互作用与联系,揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律 一、蛋白质组与蛋白质组学的定义一、蛋白质组与蛋白质组学的定义第4页，讲稿共49张，创作于星期三蛋白质组及其质点的分离与分析蛋白质组及其质点的分离与分析第5页，讲稿共49张，创作于星期三 根据蛋白质溶解度、分子大小及形状、电离性 质、生物学功能的差异进行：1、根据溶解度 2、根据分子量 透析和超滤 平衡离心 凝胶过滤层析 （三）蛋白质混合物的分离方法一、分一、分 离离 纯纯 化化第6页，讲稿共49张，创作于星期三第7页，讲稿共49张，创作于星期三第8页，讲稿共49张，创作

3、于星期三3、根据电荷v毛细管电泳v离子交换层析一、分一、分 离离 纯纯 化化第9页，讲稿共49张，创作于星期三4、根据蛋白质的亲和能力 亲和层析第10页，讲稿共49张，创作于星期三（四）蛋白质分离纯化的条件v缓冲液v盐、金属离子和螯合剂v还原剂v去垢剂v蛋白酶抑制剂 表面效应v蛋白质的环境因素 温度 储存v 一、一、分分 离离 纯纯 化化第11页，讲稿共49张，创作于星期三二、分析鉴定二、分析鉴定（一）Western印迹技术基本操作步骤：蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质的电转移蛋白质与抗体的结合反应 目标蛋白质的显示western 印迹基本步骤图示第12页，讲稿共49张，创作于

4、星期三WesternWestern免疫印迹免疫印迹用于测定特定蛋白质的大小和含量用于测定特定蛋白质的大小和含量 基本原理基本原理将将经经SDS-SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳分分离离的的蛋蛋白白组组分分从从凝凝胶胶转转移移至至固固相相支支持持体体上上，以以针针对对特特定定蛋蛋白白质质的的抗抗体体作作为为探探针针，与与附附着着于于固固相相支支持持体体的的靶靶蛋蛋白白所所呈呈现现的的抗抗原原表表位位进进行行特特异异性性反应，结合上的抗体可用二抗检测。反应，结合上的抗体可用二抗检测。常用的二抗是与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的抗免疫球蛋白或常用的二抗是与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联

5、的抗免疫球蛋白或A A蛋白；蛋白；实际应用中常常还需要设置适当的对照。实际应用中常常还需要设置适当的对照。第13页，讲稿共49张，创作于星期三常需要内参蛋白量化蛋白量；GAPDH、ACTIN、ALBUMIN 第14页，讲稿共49张，创作于星期三j 将将SDS-PAGESDS-PAGE的高分辨能力与抗原抗体反应的特的高分辨能力与抗原抗体反应的特 异性、敏感性相结合异性、敏感性相结合 (灵敏度达到灵敏度达到ngng级级)k 蛋白电泳在变性条件下进行，消除了蛋白溶解、蛋白电泳在变性条件下进行，消除了蛋白溶解、聚集以及与外来蛋白共沉淀等问题聚集以及与外来蛋白共沉淀等问题 特点特点第15页，讲稿共49张

6、，创作于星期三免疫荧光法免疫荧光法(immunofluorescence)(immunofluorescence)主要用于检测目的蛋白在细胞内的定位。主要用于检测目的蛋白在细胞内的定位。基本原理基本原理将将待待检检的的目目的的蛋蛋白白作作为为抗抗原原，固固定定在在载载玻玻片片上上，先先加加上上针针对对目目的的蛋蛋白白的的抗抗体体(第第一一抗抗体体)进进行行反反应应，再再加加上上针针对对第第一一抗抗体体的的荧荧光光素素标标记记抗抗体体(第第二二抗抗体体)进进行行反反应应，称称作作间间接接免免疫疫荧荧光光法法。如如果果将将荧荧光光素素标标记记在在第第一一抗抗体体上上，则则不不用用再再加加第第二抗体

7、，称作二抗体，称作直接免疫荧光法直接免疫荧光法。特点特点 需要在荧光显微镜下观察结果需要在荧光显微镜下观察结果；无法检测目的蛋白的大小；无法检测目的蛋白的大小；操作简便，但需设立必要的对照；操作简便，但需设立必要的对照；第16页，讲稿共49张，创作于星期三免疫荧光法免疫荧光法(immunofluorescence)(immunofluorescence)例例 1例例 2第17页，讲稿共49张，创作于星期三免疫沉淀免疫沉淀(immunoprecipitation)(immunoprecipitation)技术技术 将抗体加入蛋白混合溶液，使之与相应抗原结合；将抗体加入蛋白混合溶液，使之与相应抗原

8、结合；加入固定的抗体结合蛋白加入固定的抗体结合蛋白(如如:Protein A-琼脂糖珠琼脂糖珠)；经经离心后，与离心后，与Protein A结合的抗原结合的抗原-抗体复合物便可沉淀抗体复合物便可沉淀；将样品变性后即可获得游离的抗原蛋白将样品变性后即可获得游离的抗原蛋白；基本步骤基本步骤 基本原理基本原理利利用用一一种种可可离离心心沉沉淀淀的的抗抗体体结结合合蛋蛋白白(如如Protein A,Protein G等等)，将将抗抗原原-抗体复合物从蛋白混合溶液中分离，进行定量或定性研究。抗体复合物从蛋白混合溶液中分离，进行定量或定性研究。为方便后续分析，在免疫沉淀前，常会对抗原进行标记。为方便后续分

9、析，在免疫沉淀前，常会对抗原进行标记。第18页，讲稿共49张，创作于星期三免疫共沉淀免疫共沉淀(co-IP)技术技术 基基于于与与蛋蛋白白质质X的的生生理理性性相相互互作作用用，如如果果用用蛋蛋白白X的的抗抗体体免免疫疫沉沉淀淀X，则则蛋蛋白白 质质 Y也也 可可 能能 沉沉 淀淀 下下 来来。Y的的 这这 种种 免免 疫疫 沉沉 淀淀 被被 称称 为为免免 疫疫 共共 沉沉 淀淀(co-immunocipitation,Co-IP)，此法最常用于测定两种目标蛋白质在体内的结合。，此法最常用于测定两种目标蛋白质在体内的结合。YABY裂解细胞裂解细胞 免疫共沉淀蛋白质免疫共沉淀蛋白质X第19页，

10、讲稿共49张，创作于星期三（二）二维凝胶电泳（2-DE)v是目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定技术之一v由两相组成：第一相：等电聚焦凝胶电泳 根据蛋白质电荷差异 第二相：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据蛋白质分子量差异二、分析鉴定二、分析鉴定第20页，讲稿共49张，创作于星期三二维双向电泳二维双向电泳(2D electrophoresis)(2D electrophoresis)基本原理基本原理基于等电点与分子量分离蛋白质基于等电点与分子量分离蛋白质IEF-focused proteinsSDS-charged proteins in IPG stripSDS-charged proteinsr

11、esolved according to sizes in SDS-PAGE gel第21页，讲稿共49张，创作于星期三2-DE原理示意图二、分析鉴定二、分析鉴定第22页，讲稿共49张，创作于星期三2-DE分析的基本步骤蛋白质溶解变性还原去除蛋白质杂志利用不同pK固定化电解质可配置不同pH范围的凝胶或利用商业化软件设计 第一相电泳：IPGIFE平衡 第二相电泳：SDSPAGE考马斯亮蓝染色、银染色、铜染色样品制备IPG胶制备双相电泳染色二、分析鉴定二、分析鉴定第23页，讲稿共49张，创作于星期三2-DE2-DE获得的蛋白质图谱二、分析鉴定二、分析鉴定第24页，讲稿共49张，创作于星期三优点：可

12、以同时直观显示数千个蛋白质点；优点：可以同时直观显示数千个蛋白质点；缺点：耗时，耗力，目前无法自动化；难以分离疏水、具极端分子量缺点：耗时，耗力，目前无法自动化；难以分离疏水、具极端分子量 或等电点的蛋白质（如膜受体蛋白、组蛋白等）。或等电点的蛋白质（如膜受体蛋白、组蛋白等）。二维双向电泳二维双向电泳(2D electrophoresis)(2D electrophoresis)silver staining (3000 spots)第25页，讲稿共49张，创作于星期三蛋白质染色蛋白质染色v考马斯亮蓝染色v银染：灵敏度高；“雪崩”效应；末端封闭v铜染第26页，讲稿共49张，创作于星期三 通过2

13、-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。(三)图像分析技术二、分析鉴定二、分析鉴定第27页，讲稿共49张，创作于星期三 2-DE图像分析软件包操作过程：图像采集图像采集斑点检测斑点检测背景消减背景消减获得蛋白质相关信息获得蛋白质相关信息图像内及图像间的比较图像内及图像间的比较二、分析鉴定二、分析鉴定第28页，讲稿共49张，创作于星期三 放射性核素标记亲和标签法正常细胞D0亲和标签病理细胞D8亲和标签混合并消化生物素亲和纯化液相色谱质谱联用分析测量两个不同样品中蛋白质的相对丰度二、分析鉴定二、分析鉴定第29页，讲稿共49张

14、，创作于星期三蛋白芯片蛋白芯片(protein chip)(protein chip)技术技术 将将一一系系列列“诱诱饵饵”蛋蛋白白以以阵阵列列方方式式固固定定在在经经过过特特殊殊处处理理的的底底板板上上，然然后后将将其其与与待待分分析析的的样样品品杂杂交交，只只有有那那些些和和“诱诱饵饵”结结合合的的蛋蛋白白才才被被保保留留在在芯芯片片上上。其其实实质质是酶联免疫吸附测定。是酶联免疫吸附测定。基于蛋白质表面化学及质谱检测的高通量蛋白质分析技术基于蛋白质表面化学及质谱检测的高通量蛋白质分析技术第30页，讲稿共49张，创作于星期三蛋白芯片蛋白芯片(protein chip)(protein ch

15、ip)技术技术 基本方法基本方法 蛋白质的结合：蛋白质的结合：未经处理的样品未经处理的样品(如血清，尿液等如血清，尿液等)直接点在芯片直接点在芯片 上，根据芯片表面不同的化学或生物特性结合相应的蛋白质；上，根据芯片表面不同的化学或生物特性结合相应的蛋白质；清洗减少非特异性蛋白清洗减少非特异性蛋白(如盐及其它污染物如盐及其它污染物)的结合；的结合；加能量吸收分子加能量吸收分子(EAM)(EAM)：EAMEAM能有效的吸收激光的能量，使样品能有效的吸收激光的能量，使样品 分子进入气相并得到电离；分子进入气相并得到电离；用表面增强的激光解吸电离法用表面增强的激光解吸电离法(SELDI)(SELDI)

16、将保留在芯片上的蛋白质将保留在芯片上的蛋白质 洗脱下来；洗脱下来；电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱仪精确地测定它们的质量；电离的蛋白质可以通过飞行时间质谱仪精确地测定它们的质量；第31页，讲稿共49张，创作于星期三蛋白芯片蛋白芯片(protein chip)技术技术从未经提纯的生物或临床样品中直接捕获、检测从未经提纯的生物或临床样品中直接捕获、检测 和分析蛋白质不需任何标记或加尾和分析蛋白质不需任何标记或加尾 超高的检测灵敏度超高的检测灵敏度(1-50 fmole的蛋白质的蛋白质)从超小样品体积从超小样品体积(0.5 l)到大体积到大体积(400l)快速获取实验结果快速获取实验结果第32页，讲

17、稿共49张，创作于星期三蛋白芯片蛋白芯片(protein chip)(protein chip)技术技术 ProteinChip的的应用应用第33页，讲稿共49张，创作于星期三蛋白质芯片蛋白质芯片第34页，讲稿共49张，创作于星期三v原理 样品分子离子化后，根据不同离子间的质量和 电荷比值（质荷比，m/e）的差异确定分子量。v应用 蛋白质的序列分析 研究蛋白质的修饰（五）质谱技术（五）质谱技术二、分析鉴定二、分析鉴定 第35页，讲稿共49张，创作于星期三（六）其它方法vEdman降解法测定蛋白质多肽的排列顺序。v核磁共振（NMR）、荧光光谱法测定溶液中蛋白质 分子的结构。vX射线衍射分析法、小

18、角中子衍射法测定晶体蛋白 质的分子结构等。二、分析鉴定二、分析鉴定第36页，讲稿共49张，创作于星期三蛋白质数据库及其应用蛋白质数据库及其应用第37页，讲稿共49张，创作于星期三蛋白质数据库及其应用蛋白质数据库及其应用二、蛋白质数据库的应用一、蛋白质数据库(Protein Database)第38页，讲稿共49张，创作于星期三一、蛋白质数据库一、蛋白质数据库（一）蛋白质序列数据库（二）蛋白质结构数据库（三）蛋白质直系同源簇数据库（四）DIP数据库第39页，讲稿共49张，创作于星期三一、蛋白质数据库一、蛋白质数据库（一）蛋白质序列数据库 SWISS-PROT数据库：http:/www.ebi.a

19、c.uk/swissprot PIR和PSD数据库 http:/pir.georgetown.edu/ftp:/nbrfa.georgetown.edu/pir 第40页，讲稿共49张，创作于星期三 蛋白质数据仓库 http:/www.rcsb.org/pdb/蛋白质结构分类数据库 http:/scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/PROSITE数据库 http:/www.expasy.ch/proside/（二）蛋白质结构数据库一、蛋白质数据库一、蛋白质数据库第41页，讲稿共49张，创作于星期三（三）蛋白质直系同源簇（COGs)数据库 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/COG（四）DIP数据库(DIP Database)http:/dip.doe-mbi.ucla.edu/一、蛋白质数据库一、蛋白质数据库第42页，讲稿共49张，创作于星期三二、蛋白质数据库的应用二、蛋白质数据库的应用（一）序列比较 序列两两对比 多序列对比（二）临床诊断（三）肿瘤治疗药物的开发第43页，讲稿共49张，创作于星期三第44页，讲稿共49张，创作于星期三第45页，讲稿共49张，创作于星期三第46页，讲稿共49张，创作于星期三第47页，讲稿共49张，创作于星期三第48页，讲稿共49张，创作于星期三感感谢谢大大家家观观看看第49页，讲稿共49张，创作于星期三