酶工程制药技术 (2).ppt

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1、关于酶工程制药技术(2)现在学习的是第1页，共56页学习目标学习目标掌掌握握 熟熟悉悉 了了解解 酶工程的研究内容及应用酶工程的研究内容及应用酶工程的基本概念和基本技术，酶工程的基本概念和基本技术，酶和细胞的固定化技术酶和细胞的固定化技术影响工程制药酶活性的因素及影响工程制药酶活性的因素及工程制药酶的来源工程制药酶的来源现在学习的是第2页，共56页目目 录录概概 述述 工程制药酶工程制药酶 药物的酶法生产药物的酶法生产 123现在学习的是第3页，共56页思考思考叶绿体的生叶绿体的生理功能是什理功能是什么？么？光合作用光合作用6CO2+12H2OC6H12O6+6O2+6H2O光能叶绿体现在学习

2、的是第4页，共56页色素分子色素分子可见光可见光C52C3ADP+PiATP2H2OO24H多种酶多种酶酶酶C6H12O6+H2OCO2吸收吸收光解光解能能固定固定还原还原酶酶光反应光反应暗反应暗反应光合作用的过程光合作用的过程光合作用怎样进行？光合作用怎样进行？现在学习的是第5页，共56页第一节第一节 概概 述述一、酶的特性一、酶的特性 酶是生物体内具有生物催化活性的生物大分子（蛋酶是生物体内具有生物催化活性的生物大分子（蛋酶是生物体内具有生物催化活性的生物大分子（蛋酶是生物体内具有生物催化活性的生物大分子（蛋白质或核酸）。白质或核酸）。白质或核酸）。白质或核酸）。酶酶=蛋白质蛋白质/蛋白质

3、蛋白质蛋白质蛋白质+辅酶辅酶辅酶辅酶现在学习的是第6页，共56页一、酶的特性一、酶的特性普通催化剂普通催化剂普通催化剂普通催化剂酶的特性酶的特性酶的特性酶的特性反应条件温和反应条件温和反应条件温和反应条件温和催化效率高催化效率高催化效率高催化效率高专一性强专一性强专一性强专一性强加快反应速度加快反应速度降低反应活化能降低反应活化能不改变反应性质不改变反应性质活性受到调节活性受到调节和控制和控制反应前后数量、反应前后数量、质量不变质量不变现在学习的是第7页，共56页高效性高效性以分子比表示，酶的催化反应的速度比非催化反以分子比表示，酶的催化反应的速度比非催化反应高应高1081020倍，比非酶催化

4、剂高倍，比非酶催化剂高1051013倍。倍。FeCl3现在学习的是第8页，共56页高效性高效性现在学习的是第9页，共56页专一性专一性现在学习的是第10页，共56页酶的调节酶的调节现在学习的是第11页，共56页酶的分类酶的分类氧化还原酶类氧化还原酶类水解酶类水解酶类异构酶类异构酶类转移酶类转移酶类裂合酶类裂合酶类合成酶类合成酶类现在学习的是第12页，共56页二、酶工程的研究内容二、酶工程的研究内容 酶工程是酶学和工程学相互渗透结酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成一门新的技合、发展而形成一门新的技 术学科。术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特

5、异性催化功能，并通过工程化将相的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。应原料转化成有用物质的技术。现在学习的是第13页，共56页二、酶工程的研究内容二、酶工程的研究内容酶和细胞固定化、酶反应器酶和细胞固定化、酶反应器分离、提取、大生产、应用分离、提取、大生产、应用酶分子改造、修饰酶分子改造、修饰基因工程、遗传修饰酶基因工程、遗传修饰酶酶抑制、激活剂酶抑制、激活剂有机相酶反应有机相酶反应人工设计酶人工设计酶抗体、核酸酶抗体、核酸酶 内容内容现在学习的是第14页，共56页三、酶工程的研究进展及应用三、酶工程的研究进展及应用（一）酶工程的研究进展（一）酶工程的研究进展1.1.酶

6、的化学修饰酶的化学修饰酶的化学修饰酶的化学修饰抗原性、蛋白抗原性、蛋白水解酶水解、水解酶水解、抑制剂抑制、抑制剂抑制、体内半衰期短体内半衰期短应用受限应用受限提高稳定性、提高稳定性、解除抗原性、解除抗原性、改变酶学性质、改变酶学性质、扩大应用范围扩大应用范围现在学习的是第15页，共56页（一）酶工程的研究进展（一）酶工程的研究进展（一）酶工程的研究进展（一）酶工程的研究进展1.酶的化学修饰酶的化学修饰 对酶在分子水平上用化学方法进行改对酶在分子水平上用化学方法进行改造，即在体外将酶分子通过人工方法与造，即在体外将酶分子通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性一些化学基团，特别是具有生物

7、相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶分的大分子进行共价连接，从而改变酶分子的酶学性质的技术。子的酶学性质的技术。现在学习的是第16页，共56页2.酶的人工模拟酶的人工模拟 根据酶的工作原根据酶的工作原理，用人工方法合理，用人工方法合成的具有活性中心成的具有活性中心和催化作用的非蛋和催化作用的非蛋白质结构的化合物白质结构的化合物叫叫人工模拟酶。人工模拟酶。人工磷酸化酶的催化简图人工磷酸化酶的催化简图（一）酶工程的研究进展（一）酶工程的研究进展（一）酶工程的研究进展（一）酶工程的研究进展现在学习的是第17页，共56页（一）酶工程的研究进展（一）酶工程的研究进展3.有机相的酶反应有机相的酶反应在含

8、有在含有有机溶剂有机溶剂的介质中进的介质中进行的催化反应。行的催化反应。增加疏水性物质的溶解度增加疏水性物质的溶解度热力学平衡向合成方向移动热力学平衡向合成方向移动可抑制有水参与的副反应可抑制有水参与的副反应利于酶的回收再利用利于酶的回收再利用容易从沸点低的溶剂中分离产物容易从沸点低的溶剂中分离产物酶的热稳定性高，酶的热稳定性高，pH适应性扩大适应性扩大无微生物污染无微生物污染能测定水介质中不易测定的常数能测定水介质中不易测定的常数固定化酶法简单固定化酶法简单现在学习的是第18页，共56页1 1酶基因的克隆酶基因的克隆和表达和表达酶基因的遗酶基因的遗传修饰传修饰酶的遗传酶的遗传设计设计基因工程

9、酶基因工程酶2 23 3 4 44.基因工程酶的构建基因工程酶的构建（一）酶工程的研究进展（一）酶工程的研究进展现在学习的是第19页，共56页药物生产药物生产药物生产药物生产亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析医疗医疗医疗医疗应用应用酶工程的特点：工艺简单、效率高、生产成本低、污染环境小，产酶工程的特点：工艺简单、效率高、生产成本低、污染环境小，产品收率高、纯度好。可制造出化学法无法制备的产品。品收率高、纯度好。可制造出化学法无法制备的产品。（一）酶工程在医药工业中的应用（一）酶工程在医药工业中的应用（一）酶工程在医药工业中的应用（一）酶工程在医药工业中的应用现在学习的是第20页，共56页固定化青

10、霉素固定化青霉素固定化青霉素固定化青霉素酰化酶酰化酶酰化酶酰化酶磷酸二酯酶磷酸二酯酶磷酸二酯酶磷酸二酯酶L-L-氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸（一）酶工程在医药工业中的应用（一）酶工程在医药工业中的应用现在学习的是第21页，共56页（一）酶工程的研究进展（一）酶工程的研究进展亲和层析亲和层析现在学习的是第22页，共56页第二节第二节 工程制药酶工程制药酶一、工程制药酶的来源一、工程制药酶的来源 现在学习的是第23页，共56页微生物生产酶制微生物生产酶制微生物生产酶制微生物生产酶制剂特点剂特点剂特点剂特点微生物种类繁多微生物种类繁多繁殖快、生产周期繁殖快、生产周期短、培养简便短、培养简便适应性强，能通

11、过适应性强，能通过遗传变异手段培育遗传变异手段培育高产菌株高产菌株 1 2 3一、工程制药酶的来源一、工程制药酶的来源 现在学习的是第24页，共56页一、影响工程制药酶活性的因素一、影响工程制药酶活性的因素 现在学习的是第25页，共56页底物浓度底物浓度 现在学习的是第26页，共56页酶浓度酶浓度 底物过量底物过量现在学习的是第27页，共56页温度温度 现在学习的是第28页，共56页pH 现在学习的是第29页，共56页抑制剂抑制剂 非竞争性抑制剂非竞争性抑制剂现在学习的是第30页，共56页抑制剂抑制剂-可逆性抑制可逆性抑制 现在学习的是第31页，共56页中毒、解毒中毒、解毒中毒、解毒中毒、解毒

12、巯基酶巯基酶巯基酶巯基酶抑制抑制抑制抑制羟基酶羟基酶羟基酶羟基酶抑制剂抑制剂抑制剂抑制剂 抑制剂抑制剂不可逆抑制不可逆抑制 现在学习的是第32页，共56页抑制剂抑制剂不可逆抑制不可逆抑制 二巯丙醇二巯丙醇现在学习的是第33页，共56页抑制剂抑制剂不可逆抑制不可逆抑制 解磷定、阿托品解磷定、阿托品现在学习的是第34页，共56页第三节第三节 药物的酶法生产药物的酶法生产一、酶的选择一、酶的选择1.底物特异性底物特异性2.pH3.温度温度4.激活剂和抑制剂激活剂和抑制剂5.价格因素价格因素现在学习的是第35页，共56页第三节第三节 药物的酶法生产药物的酶法生产二、酶的反应条件二、酶的反应条件1.底物

13、浓度对反应速度的影响底物浓度对反应速度的影响2.酶浓度对反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响3.pH对反应速度的影响对反应速度的影响4.温度对反应速度的影响温度对反应速度的影响5.激活剂和抑制剂对反应速度的影响激活剂和抑制剂对反应速度的影响现在学习的是第36页，共56页三、酶和细胞的固定化技术（一）固定化酶的制备（一）固定化酶的制备 1.固定化酶的定义固定化酶的定义是指限制或者固定于特定空间位置的酶，是指限制或者固定于特定空间位置的酶，具体来说，就是指经过物理、化学方法处理，使酶变成不易具体来说，就是指经过物理、化学方法处理，使酶变成不易随水流失的固定化催化剂。随水流失的固定化催化剂。制备固定

14、化酶的过程称为酶的固定化。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。酶可以采用经过分离后高纯度的提纯酶、也可以是菌体细胞碎片上的酶可以采用经过分离后高纯度的提纯酶、也可以是菌体细胞碎片上的酶系，甚至可以是死细胞上的酶。酶系，甚至可以是死细胞上的酶。现在学习的是第37页，共56页三、酶和细胞的固定化技术（一）固定化酶的制备（一）固定化酶的制备 2.固定化酶的特点固定化酶的特点（1）稳定性很高，可以多次连续使用。）稳定性很高，可以多次连续使用。（2）产物中不含酶，易于纯化。）产物中不含酶，易于纯化。（3）反应条件易于控制，可实现连续化和自动控制。）反应条件易于控制，可实现连续化和自动控制。（4）酶的利用率

15、高，实际使用量较少。）酶的利用率高，实际使用量较少。（5）比水溶性酶更适合进行多酶反应。）比水溶性酶更适合进行多酶反应。（6）固定化酶属于修饰酶，可以改良）固定化酶属于修饰酶，可以改良。现在学习的是第38页，共56页（一）固定化酶的制备 3.酶和细胞的固定化方法酶和细胞的固定化方法现在学习的是第39页，共56页（1）物理吸附法A、物理吸附法的优点：、物理吸附法的优点：（1）操作简单（2）可选用不同的吸附剂（3）酶失活之后，载体可以再生B、物理吸附法的缺点：、物理吸附法的缺点：（1）酶的最适吸附量无规律可寻（2）酶与载体之间的吸附力不强，酶容易脱落。C、常用的吸附剂、常用的吸附剂现在学习的是第4

16、0页，共56页（2）离子结合法A、离子结合法的优点、离子结合法的优点-操作简单、处理条件温和，酶的活性中心不容易被破坏。B、离子结合法的缺点、离子结合法的缺点-载体和酶的结合力较弱、常常发生酶脱落的现象C、常用的离子结合剂、常用的离子结合剂树脂-阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、多糖类离子交换剂、合成高分子类离子交换剂。每克载体能吸附50-150mg酶蛋白。DEAE-纤维素 Amberlite-CG-50 Amberlite-XE-97 Amberlite-IR-45 Dowex-50现在学习的是第41页，共56页（3）共价键结合法酶分子上的氨基、羧基、羟基、咪唑基、巯基与载体表面的反应基团形成

17、共价键，因而将酶固定在载体上的方法。A、共价键结合法的优点、共价键结合法的优点-酶与载体结合牢固，酶不会发生脱落。B、共价键结合法的缺点、共价键结合法的缺点-操作复杂、反应条件苛刻，酶的活性中心会遭到部分性的破坏。C、共价键结合法的类别、共价键结合法的类别重氮化迭氮化酸酐活化法酰氯法异硫氰酸酯法缩合剂法溴化氰活化法烷基化法纪硅烷基化法现在学习的是第42页，共56页交联法交联法交联法是采用双功能、或者多功能试剂，使得酶与酶之间发生交联的固定化方法。基团之间的交联通过共价键结合。交联法的优点-交联后的酶活性较高交联法的缺点-反应条件剧烈、酶的回收率低。现在学习的是第43页，共56页交联法的类别和内

18、容交联法的类别和内容类别类别酶与酶交联法酶与辅助蛋白交联法吸附交联法载体交联法内容内容分子内交联分子间交联酶与辅助蛋白分子之间交联酶与载体之间交联现在学习的是第44页，共56页（3）参与交联的酶蛋白功能团和常用的交联剂）参与交联的酶蛋白功能团和常用的交联剂参与交联的酶蛋白功能团参与交联的酶蛋白功能团N-末端的-氨基赖氨酸的-氨基酪氨酸的酚基半胱氨酸的巯基组氨酸的咪唑基常用的交联剂常用的交联剂戊二醛双重氮联苯胺-2、2-二磺酸1、5-二氟-2、4-二硝基苯已二酰亚胺二甲酯现在学习的是第45页，共56页3、包埋法包埋法的优点-不需要改变酶的高级结构，酶的回收率较高。包埋法的缺点-包埋酶容易导致酶的

19、失活，包埋法只适用于小分子底物的反应过程，大分子底物由于无法进入凝胶，故不适用。包埋法分为三类（1）网格型）网格型（2）微囊型）微囊型 现在学习的是第46页，共56页（1）凝胶包埋法网格法也称凝胶包埋法，是指将酶包埋在高分子凝胶的细策网格之中。凝胶包埋法是目前因定化技术中用得最多的方法。所用的凝胶有：聚丙烯酰胺聚乙烯醇光敏树脂淀粉明胶胶原海藻胶（卡拉胶）角叉菜胶现在学习的是第47页，共56页（2）微囊化包埋法将酶包埋在高分子半透膜中的方法，称为微囊化包埋法。微囊化固定化酶的优点-微囊化固定化酶的直径为几微米到几百微米之间的球状体，其颗粒较小，有利于大分子底物进行反应。微囊化固定化酶的缺点-反应

20、条件要求高，制备成本也较高。现在学习的是第48页，共56页（3）纤维包埋法此法适用于大规模生产。此法适用于大规模生产。纤维包埋法所形成的聚合物，每克能够包埋纤维包埋法所形成的聚合物，每克能够包埋1500mg1500mg的转化酶，并且具有良好的稳定性。的转化酶，并且具有良好的稳定性。制备时，先把含酶水溶液在高聚物（醋酸纤维素、聚氯乙烯）的有机溶剂（二氯甲制备时，先把含酶水溶液在高聚物（醋酸纤维素、聚氯乙烯）的有机溶剂（二氯甲烷）中进行乳化，烷）中进行乳化，然后将乳化液通过一多孔喷丝头挤压进凝结浴池中，形成纤维然后将乳化液通过一多孔喷丝头挤压进凝结浴池中，形成纤维酶溶液便被包裹在纤维内酶溶液便被包

21、裹在纤维内将纤维编织成各种酶布，以适合反应器的要求。将纤维编织成各种酶布，以适合反应器的要求。现在学习的是第49页，共56页 选择性热变性法选择性热变性法-此法专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处理，使其细胞膜蛋白质变性，但不使其酶变性，从而使酶固定于细胞内的方法。现在学习的是第50页，共56页（1）吸附法制备固定化酶技术）吸附法制备固定化酶技术 物理吸附物理吸附 离子交换离子交换等电点、低离子强度、载体颗粒、蛋白质量、温度等电点、低离子强度、载体颗粒、蛋白质量、温度（2）包埋法制备固定化酶技术）包埋法制备固定化酶技术 凝胶包埋凝胶包埋 将凝胶材料（卡拉胶、海藻胶、琼脂及明胶）与水混合，加

22、热使之将凝胶材料（卡拉胶、海藻胶、琼脂及明胶）与水混合，加热使之溶解，再降至其凝固点温度，然后加入预保温的酶溶液、混合均匀，最溶解，再降至其凝固点温度，然后加入预保温的酶溶液、混合均匀，最后冷却凝固成型、破碎即成固定化酶。后冷却凝固成型、破碎即成固定化酶。微囊包埋微囊包埋 4.固定化酶的制备技术固定化酶的制备技术现在学习的是第51页，共56页界面沉降微囊包埋法界面沉降微囊包埋法采用与水不相溶的、沸点比水低的有机相A。将酶液在有机相A中乳化、形成油包水的微滴。再在乳化液中加入溶于有机溶剂的高聚物B。再加入不能溶解高聚物B的另上种有机溶剂C。结果使得高聚物在油水界面上沉淀、析出，形成微囊型固定化酶

23、。现在学习的是第52页，共56页界面聚合微囊包埋法界面聚合微囊包埋法含酶的、10%的血红蛋白溶液+已甲叉二胺水溶液-充分混合加入1%的Span-85的氯仿-环已烷进行分散乳化，再加入溶于有机相的癸二酰氯，酶和载体在油-水界面上发生聚合反应，弃去上清液，加入Tween-20去乳化，洗去有机溶剂用未聚合的单体，将聚合物转移到水相之中，就成微囊。所制得的微囊直径在1-300um之间，每1ml酶溶液可以制得2500cm2总表面积的微囊。现在学习的是第53页，共56页交联法是指向酶液中加入多功能试剂，在一定的条件下使酶在分子内、或者在分子间形成网络结构，最终形成固定化酶的技术。交联法可以分为：（1）酶与

24、辅助蛋白交联法（2）吸附交联法（3）载体交联法。如0.2%的木瓜蛋白酶和0.3%的戊二醛、在H=5.2-5.7、温度为0的条件下，24小时即完成酶的固定化。共价键结合法-实质上是一种酶 与包埋剂之间的化学反应过程现在学习的是第54页，共56页（二）固定化细胞的制备（二）固定化细胞的制备1.固定化细胞的定义 2.固定化细胞的特点无需进行酶的分类纯化；细胞保持酶的原始状态；细胞内无需进行酶的分类纯化；细胞保持酶的原始状态；细胞内酶稳定性高；细胞内酶的辅因子可再生；细胞含多酶体酶稳定性高；细胞内酶的辅因子可再生；细胞含多酶体系，可催化一系列反应；抗污染性强。系，可催化一系列反应；抗污染性强。3.固定化细胞的制备技术现在学习的是第55页，共56页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第56页，共56页