猪链球菌病诊断 (2)讲稿.ppt

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1、关于猪链球菌病诊断(2)第一页，讲稿共三十四页哦病原：病原：1 猪链球菌猪链球菌2型（型（Streptococcus suis 2）2 2 马链球菌兽疫亚种（马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi subsp zooepidemicus)，旧称兽疫链球菌旧称兽疫链球菌3 3 D D、E E、L L、S S群链球菌群链球菌(Lancefield)(Lancefield)兰氏血清学分群，链球菌分为兰氏血清学分群，链球菌分为2020个血清群（个血清群（A A、B B、C.V,IC.V,I、J J除外）除外）第二页，讲稿共三十四页哦一、病原分离一、病原分离1 采样采样活猪：采样用灭菌棉

2、拭子擦拭扁桃体活猪：采样用灭菌棉拭子擦拭扁桃体病死猪：扁桃体、肺、肝、血液，有脑炎症病死猪：扁桃体、肺、肝、血液，有脑炎症状取脑组织，关节炎可取关节囊液状取脑组织，关节炎可取关节囊液第三页，讲稿共三十四页哦2 分离培养分离培养（1）培养基：）培养基：THB培养基、绵羊血或马血平板培养基、绵羊血或马血平板（2）培养条件：需氧兼性厌氧、）培养条件：需氧兼性厌氧、37、pH7.2 猪链球菌猪链球菌2性营养要求比马链球菌兽疫亚种低，后者性营养要求比马链球菌兽疫亚种低，后者需加需加3-5%的犊牛血清的犊牛血清第四页，讲稿共三十四页哦二、临床诊断二、临床诊断 主要表现为主要表现为败血症、化脓性淋巴结炎、脑

3、膜炎、败血症、化脓性淋巴结炎、脑膜炎、心内膜炎、关节炎等。心内膜炎、关节炎等。但不同链球菌病原引起的症但不同链球菌病原引起的症状类似，故该诊断不能用于确诊。状类似，故该诊断不能用于确诊。第五页，讲稿共三十四页哦关节炎症状关节炎症状第六页，讲稿共三十四页哦败血症败血症第七页，讲稿共三十四页哦1 染色镜检染色镜检猪链球菌猪链球菌2型：型：革兰氏染色阳性、革兰氏染色阳性、菌体呈圆形或椭圆形，直径小菌体呈圆形或椭圆形，直径小于于2.0m，一般呈短链或成双排列，革兰氏染色，一般呈短链或成双排列，革兰氏染色阳性，阳性，菌体表面能形成荚膜。菌体表面能形成荚膜。二、微生物学诊断二、微生物学诊断第八页，讲稿共三

4、十四页哦马链球菌兽疫亚种：马链球菌兽疫亚种：革兰氏阳性球菌，直径革兰氏阳性球菌，直径0.51um，液体培养基，液体培养基中呈长链，菌体表面能形成荚膜。营养要求较高，中呈长链，菌体表面能形成荚膜。营养要求较高，在在5%犊牛血清生长良好。根据类犊牛血清生长良好。根据类M蛋白抗原性蛋白抗原性的差异，该菌至少有的差异，该菌至少有15个血清型。个血清型。第九页，讲稿共三十四页哦马链球菌兽疫亚种猪链球菌2型菌（溶血）第十页，讲稿共三十四页哦图2 猪链球菌2型 (ZY05719)第十一页，讲稿共三十四页哦ATCC 35246株株第十二页，讲稿共三十四页哦2 培养特性培养特性猪链球菌猪链球菌2型：型：菌落形态

5、菌落形态 血平板上呈灰白色小菌落，粘稠，血平板上呈灰白色小菌落，粘稠，2型在绵型在绵 羊血平板上呈羊血平板上呈溶血，马血平板则呈溶血，马血平板则呈溶血。溶血。第十三页，讲稿共三十四页哦马链球菌兽疫亚种：马链球菌兽疫亚种：在血清肉汤培养基中培养该菌，开始时有轻度混在血清肉汤培养基中培养该菌，开始时有轻度混浊，继而变清，于管底形成沉淀。浊，继而变清，于管底形成沉淀。于于5绵羊血琼脂（绵羊血琼脂（THA）培养基上培养）培养基上培养24 h，大，大部分菌株形成部分菌株形成34mm的粘液样大菌落，产生明显的粘液样大菌落，产生明显的的溶血。小部分呈非粘液样菌落，大小约溶血。小部分呈非粘液样菌落，大小约1m

6、m左右。左右。第十四页，讲稿共三十四页哦3 生化鉴定生化鉴定猪链球菌猪链球菌2型：型：发酵乳糖、海藻糖、水扬苷，部分菌株发酵发酵乳糖、海藻糖、水扬苷，部分菌株发酵 棉实糖、菊糖；不发酵甘露醇、山梨醇棉实糖、菊糖；不发酵甘露醇、山梨醇第十五页，讲稿共三十四页哦马链球菌兽疫亚种：马链球菌兽疫亚种：能水解精氨酸，发酵乳糖、水扬苷、山梨醇能水解精氨酸，发酵乳糖、水扬苷、山梨醇产酸。不能发酵菊糖、甘露醇、棉子糖和海藻糖。产酸。不能发酵菊糖、甘露醇、棉子糖和海藻糖。V-P试验阴性，不产生靛基质，不还原硝酸盐，不试验阴性，不产生靛基质，不还原硝酸盐，不液化明胶。液化明胶。第十六页，讲稿共三十四页哦三、免疫学

7、诊断三、免疫学诊断1 玻板凝集实验玻板凝集实验 用于猪链球菌用于猪链球菌2型快速定型，但要求抗体效价高；型快速定型，但要求抗体效价高；马链球菌兽疫亚种只能用于定群马链球菌兽疫亚种只能用于定群 2 乳胶凝集实验乳胶凝集实验1.敏感性较高，结果容易判断，但有非特异性敏感性较高，结果容易判断，但有非特异性第十七页，讲稿共三十四页哦3 免疫荧光免疫荧光猪链球菌猪链球菌2型：型：用用MRP特异抗体可用于菌体表面其分布的观察，特异抗体可用于菌体表面其分布的观察，但需用激光共聚焦显微镜。但需用激光共聚焦显微镜。马链球菌兽疫亚种：用类马链球菌兽疫亚种：用类M蛋白特异抗体可用于菌体蛋白特异抗体可用于菌体表面其分

8、布的观察表面其分布的观察第十八页，讲稿共三十四页哦MRP单抗介导单抗介导FITC标记标记SS2表面表面MRP的激光共聚焦图像的激光共聚焦图像 MRP单抗介导单抗介导FITC标记标记SS2表面表面MRP的激光共聚焦图像的激光共聚焦图像第十九页，讲稿共三十四页哦SS2多抗介导多抗介导FITC标记的标记的SS2的激光共聚焦图像的激光共聚焦图像第二十页，讲稿共三十四页哦4 4ELISAELISA5 5 常用链球菌多克隆抗体包被，以常用链球菌多克隆抗体包被，以MRPMRP或类或类M M蛋白的单克隆抗体夹心，敏感性高，特异蛋白的单克隆抗体夹心，敏感性高，特异性较强。性较强。第二十一页，讲稿共三十四页哦四、

9、分子诊断四、分子诊断1多酶电泳法：多酶电泳法：原理：不同型猪链球菌，胞内酶分子的氨基酸有原理：不同型猪链球菌，胞内酶分子的氨基酸有差异，因而电荷有差异，在电场中，其迁移率有差异，因而电荷有差异，在电场中，其迁移率有差异。差异。用于不同型链球菌的分析用于不同型链球菌的分析第二十二页，讲稿共三十四页哦2 限制性酶切图谱分析限制性酶切图谱分析 原理：不同种或亚种链球菌基因不同，因而用限制原理：不同种或亚种链球菌基因不同，因而用限制性内切酶酶切后，其电泳图谱不同。性内切酶酶切后，其电泳图谱不同。用于分离株变异分析，亦可用于不同种或型的鉴用于分离株变异分析，亦可用于不同种或型的鉴定定第二十三页，讲稿共三

10、十四页哦3 3随机扩增多态随机扩增多态DNA分析（分析（RAPD）4 用多对随机引物进行用多对随机引物进行PCR扩增，可得到不扩增，可得到不同的产物，且产物具有多态性。同的产物，且产物具有多态性。5 可用于种或型的鉴定或分离株变异分析可用于种或型的鉴定或分离株变异分析第二十四页，讲稿共三十四页哦4PCR5猪链球菌猪链球菌2型：型：mrp、ef、cps2、orf2以及溶血素基因均可作为以及溶血素基因均可作为靶基因进行检测靶基因进行检测 cps2具有型特异性具有型特异性第二十五页，讲稿共三十四页哦bp970744622557 mrp,ef,sly,CPS 2 1 2 3 4 51:HA9801;2

11、:ZY05719;3:Marker;4,5:阴性对照阴性对照第二十六页，讲稿共三十四页哦250bp 500bp750bpM122000bp1000bpMaker 1.HA 9801(cps2)2.ZY05719(cps2)cps2第二十七页，讲稿共三十四页哦250bp 500bp750bp2000bpM1234ef，mrp，gdh，orf2Maker1.ef(626 bp)2.mrp(316 bp)3.gdh(688 bp)4.orf2(858 bp).第二十八页，讲稿共三十四页哦250bp 500bp750bp1000bp2000bp250bp 500bp750bp1000bp2000bp1

12、099bp1310bpM1M1 slyfbpsMaker 1.slyMaker1.fbps第二十九页，讲稿共三十四页哦第三十页，讲稿共三十四页哦1040bp100bp250bp 500bp750bp1000bp2000bpM123M:DL-Marker 2000 1:ZY05719(gapdh)2:HA9801(gapdh)3:空白对照空白对照gapdh第三十一页，讲稿共三十四页哦图8orf 2PCR检测结果1marker;24,713PCRproductsofswineStreptococcus,2HA9801;56negativecontrol第三十二页，讲稿共三十四页哦图11PCR检测猪链球菌2型cps21.H2O;2.SH0033;3.35246;4.ZY05722;5.ZG05464;6.GH05458;7.HA9802;.8.ZY05719;9.HA9801;10.YJ05465;11.JDZ05802-1;12.JR05730;13.ZY05721;14.11611;15.CHZ05806;16.260;M.MarkerDL2000.bp387M161514131211109876543211002502000750第三十三页，讲稿共三十四页哦感感谢谢大大家家观观看看第三十四页，讲稿共三十四页哦