林木病理学实验指导书河北农业大学林学院林木病理学课程组.doc

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1、 河北农业大学林学院林木病理学课程组2006年6月实验注意事项一、进入实验室必须遵守纪律，保持室内整洁安静。二、每次实验前必须仔细阅读实验指导书和有关的内容，以保证实验顺利进行。 三、实验时树立严谨的科学态度，完全按照实验指导书所列操作步骤认真进行实验和观察。四、爱护实验仪器，节约使用实验用具和材料，如有损坏和故障，务必报告指导教师，凡无故损坏仪器设备者应予赔偿。五、实验完毕时，请将仪器放回原处，擦净桌面，收拾整齐。按作业要求写出实验报告，方可离开实验室。离开实验室前注意关门、窗、水、灯等，并用肥皂洗手。六、每个学生的实验成绩由实验过程表现和实验报告成绩两部分组成，实验成绩将带入期末总成绩。七

2、、需要进一步培养观察的实验材料应写好标签，注明实验内容、日期和试验人员姓名，以防混淆或丢失。八、学生应准备绘图纸、报告纸、HB和2H的绘图铅笔、直尺、小刀和橡皮等绘图用具。林木病理学实验指南 林木病理学实验是农业植物病理学课程的重要组成部分，是植物病理学基本概念、基础理论、基本原理的深化理解、实验应证、增强感性认识和衔接补充，是理论与实践相结合的具体体现。对学好林木病理学具有重要意义。 林木病理学实验的目的是以植物病理学和其它关学科知识为基础，追溯引起植物病害发生的原因及过程，认识不同病原所致病害的症状特点及病原形态特征。掌握植物病害实验及研究的基本技能及方法，注重学生观察、思考、分析、解决实

3、际问题的能力培养，为将来的研究工作打下一定的基础。林木病理学实验要求学生在实验之前预习实验指导，明确实验的目的意义，复习实验相关理论知识，了解实验的方法、步骤及重难点；认真、客观、正确地、观察、记录实验内容和显微绘图，整理、归纳，分析实验数据和结果，认真完成实验报告，总结成功的经验及找出不足的原因，培养科学态度。实验重点要求学生认知和掌握主要作物、果树和蔬菜病害的症状和病原物的形态特点、学习显微绘图、制片技术；综合性实验要求学生学习和掌握从植物病害的调查、标本的采集、鉴定到灭菌、消毒、培养基制作及病原物的分离和培养等实验技能。该实验指导书对症状和病原形态特征进行了描述，通过提示对重点观察内容与

4、阐明并对实验技能进行了简述。作业与思考题，主要是实验内容的课堂作业及复习时的参考。实验一 林木病害症状类型的观察症状是有病植物外部可见的病状和病征的统称。植物生病后，有一定的病理变化程序。无论是侵染性病害或非浸染性病害，首先在植物体内发生一系列外部观察不到的生理生化的变化，继而细胞和组织开始发生病变，并出现肉眼可见到的变化这就是病状。有些侵染性病害，主要是真菌和细菌病害，不仅表现出病状，在病部还能见到引起植物生病的病原物，它们依附在病植物体人例如，病植物上的霜霉、白粉、黑粉、茵核、茵脓以及寄生在植物上的寄生性种子植物等。这些致病生物出现在病变部分即称“病征”。所以，植物病害的症状应该包括“病征

5、”和“病状”面部分。但是，植物受病毒、菌原体、类细菌和线虫等危害后，只能看到植物本身的病状，这些病害习惯上也统称为症状。人们对病害的认识和研究，机首先从症状开始，症状有一定的变化幅度，常因品种抗性、环境条件以及发病时期(或后期)不同而有变化，因此观察病害症状应连续观察它在不同时期和不同条件下的表现。一、实验目的通过植物病害症状的观察，学习描述和记载植物病害症状的方法，掌握植物病害的症状类型、特点以及了解症状在病害诊断中的作用。加深对植物病害的感性认识，认识植物病害的主要症状类型，为进一步诊断和研究植物病害打下坚实基础。二、材料和用具 各种类型的病害标本、幻灯片和挂图等。扩大镜、小刀及记载用具。

6、 三、实验内容与方法（一）病状类型 1. 变色：植物受到外来有害因素的影响后，常导致色泽的改变，如褪色、条点、白化、色泽变深或变浅等，统称为变色。主要表现有：1) 褪绿或黄化：褪绿和黄化是由于叶绿素的减少而叶片表现为浅绿色或黄色。如植物的缺铁、缺氮等。 2) 花叶与班驳：如苹果花叶病、月季花叶病、黄杨花叶病等。3) 变红色或紫色，如玉米植物生病后，病部细胞内的叶绿素被破坏或形成受到抑制而呈现出不正常的颜色。变色以叶片变色为最常见，通常为全株性的，叶片颜色深浅不匀、深绿浅绿或黄绿相嵌，有时还出现红紫等颜色。花朵变色在林木中常见的有郁金香碎锦病，缺素和病毒侵染都可以形成这种症状。观察标本：苹果花叶

7、病 月季花叶病 大叶黄杨花叶病 杨树花叶病2、坏死和腐烂： 坏死是由于受病植物组织和细胞的死亡而引起的。1) 斑点：根、茎、叶、花、果实的病部局部组织或细胞坏死产生各种形状和大小颜色不同的斑点，如大叶黄杨叶斑病、月季黑斑病、山柳漆斑病、柿（黑枣）角斑病、柿园斑病。2) 枯死：芽、叶、枝、花局部或大部分组织发生变色、焦枯死亡。如丁香疫病、核桃枝枯病。3) 穿孔和落叶落果：在病斑外围的组织形成离层，使病斑从健康组织中脱落下来，形成穿孔，如桃细菌性穿孔病等；有些植物的花、叶、果等受害后，在叶柄或果梗附近产生离层而引起过早的落叶、落果等。4) 疮痂：果实、嫩枝、块茎等的受病组织局部木栓化，表面粗糙，病

8、部较浅，如柑桔疮痂病、梨黑星病等。 5) 溃疡：病部深入到皮层，组织坏死或腐烂，病部面积大，稍凹陷，周围的寄主细胞有时增生和木栓化，多见于木本植物的枝干上的溃疡症状。如杨树溃疡病、杨树腐烂病、柑桔溃疡病、番茄溃疡病等。观察标本：苹果腐烂病、杨树腐烂病。6）果实腐烂：如苹果炭疽病。观察标本：苹果炭疽病。3、萎蔫：植物茎部腐烂，根部坏死都能引起萎蔫。典型的萎蔫是指植物根部或茎部的维管束组织受到侵染而发生的萎蔫现象根据受害的部位不同，萎蔫可以是全株性的或是局部性的。观察标本：落叶松枯梢病，苗木立枯病 ；4、畸形：感病植物受病原物刺激，细胞和组织过度增生或发育不良，形成肿瘤丛枝、卷叶、扭曲、矮化等观察

9、标本：根癌病、泡桐丛枝病、枣疯病、桃缩叶病（二）病征类型 病征是指在植物病部形成的、肉眼可见的病原物的结构。识别各种不同类型的病征对诊断病害很有帮助。细菌性病害，通常是在受伤的病部出现粘稠的液体菌脓。但真菌在病部产生的病征较复杂依其形态不同，可区分为多种类型：大致分为霜状物、粉状物、霉状物、锈状物、小黑粒和线状物，块状物、伞状物等，并常以这些特征来命名这些病害。有些类型的病征可根据其他特征进一步区分，如粉状物可根据其色泽不同，分为白粉、黑粉等。霉状物：瓜类腐霉病、柑桔青霉病、紫薇煤污病、夹竹桃煤污病粉状物，山楂白粉病、黄栌白粉病、苹果白粉病、丁香白粉病、小麦黑粉病锈状物：牵牛花白锈病，玫瑰锈病

10、、苹果锈病、马兰锈病 煤污状物，茶煤污、桑污叶病、油茶煤污病。块状物：菌核，白绢菌引起的丝核立枯病、白绢病线状物：果树根朽病、根状菌索、紫纹羽病点状物：病原真菌在病部产生的黑色、褐色小点，多为真菌的繁殖体观察标本：核桃枝枯病、苹果腐烂病、月季黑斑病、杨树腐烂病伞状物、马蹄状物：病原真菌在病部产生的大型子实体，多为担子菌亚门，如木耳、银耳、平茹、灵芝、草菇、松白腐病的子实体。脓状物：细菌病害特有病症 （三）综合症 在同一寄主植物上一种病害可能表现出几种症状类型，这几种症状同时表现或先后接连表现出来，称为综合症。例如大豆花叶病毒病可以有变色、花叶、顶芽坏死和畸形等几种类型的症状在同一植株上出现。水

11、稻白叶枯病可以有叶枯、枯心、黄叶等症状在同一植株上出现。掌握这些症状特征对于正确诊断病害是十分重要购。 （四）复合症 由两种或两种以上的病原物(或害虫)同时或先后侵染寄主而表现的复合症状。四、实验时间 2学时。五、作业与思考题作业：根据温室和田间的参观，实验室标本的观察以及幻灯片、照片等观察到的不同症状类型的病害，扼要描述其症状特点，将观察结果填入下表 (要求至少描述六种病害)寄主名称病害名称发病部位病状类型病症类型思考题：1) 植物病害的定义是什么? ，2) “病状”、“病征”“症状”、“综合症的定义，并举例说明。3) 症状在病害诊断上有什么作用？4) 为什么种病害可以表现出不同的症状?实验

12、二 鞭毛菌、接合菌、子囊菌亚门真菌及所致病害鞭毛菌亚门真菌是一类低等真菌，其中多数是水生的。它们的共同特征是无性繁殖时产生有鞭毛的游动孢子。主要引起苗木猝倒病、白锈和霜霉。接合菌亚门真菌人多数是腐生的，少数可以引起农产品的腐烂。其中最重要的是根霉属(Rhizopus)的匍枝根霉(R.stolomifer)可引起种实霉烂。子囊菌是一类高等真菌。菌丝体一般都很发达，有隔膜，有分枝，有的菌丝体可以形成菌核、子座等机构。子囊菌的共同特点是有性生殖产生子囊和子囊孢子。子囊菌亚门是根据子囊果的有无、子囊果的形态特征、子囊着生位置、子囊孢子的特征进行分类的。子囊菌所致的病害很多，其中代表性的病害有核果类缩叶

13、病、各种植物的白粉病、黑斑病、赤霉病、苹果腐烂病、苹果黑星病和菌核病等。一、目的要求 通过观察，认识病原真菌的营养体及其变态，认识真菌的子实休、有性繁殖、无性繁殖产生的各种类型孢子，掌握各亚门的主要特征。二、用具 挑针、刀片、木板、酒精灯、火柴、载玻片、盖玻片、纱布、乳酚油、二甲苯、显微镜、擦镜纸、吸水纸等。有关病害的标本、挂图、幻灯片三、内容与方法（一） 病原真菌的营养体真菌营养生长阶段的结构统称为真菌的营养体。典型的营养体是丝状，少数为单细胞。单根丝状的营养体称为菌丝；许多菌丝在一起就称为菌丝体。用挑针挑取在培养皿内的瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)和立枯丝核菌

14、(Rhizoctonia solani)或镰刀菌的菌丝体用蒸馏水或乳酚油作浮载剂，制临时破片镜检，观察菌丝有无隔膜?菌丝体直径变化是否明显？颜色有无差别？（二） 鞭毛菌亚门 卵菌纲有发达的菌丝体，菌丝没有隔膜。无性繁殖形成游动孢子囊,其中产生多个游动孢子。1）霜霉目 许多霜霉目真菌是更要的植物病原菌，无性繁殖通常产生卵形或梨形的抱子囊。孢子囊成熟十可释放游动孢子，或直接萌发形成芽管,游动孢子无两游现象。藏卵器内只有一个卵球。霜霉科主要属的检索表A孢囊梗粗壮，上部为重复23次的不规则二叉分枝指梗霉属(Sclerospora)AA孢囊梗较细BB孢囊梗单轴分枝,小枝与主轴成直角，分枝末端平纯单轴霉属

15、(Plasompara)BB。孢囊梗成锐角二叉分枝CC分枝两侧不对称，顶端尖锐假霜霉属(Pseudoperonospora)CC分枝两侧对称DD分技顶端尖细霜霉属(Peronospora)DD分枝顶细，具34个指状周生小梗 盘梗霉属(Bremia)（三） 接合菌亚门1匍枝根霉菌的镜检 观察菌丝、假根孢子囊、孢囊孢子 用挑针仔细地从培养的匍枝根霉菌中挑取少许连有培养基培养物，制成临时玻片，在低倍镜下检查。观察菌丝的形态和具有35个分枝的孢囊及其基部的假根，从孢囊梗之间有匍枝状的菌丝相连，在孢囊梗基部有深入寄主细胞或基质中分枝状的假根，起吸收营养和固定孢囊梗的作用。在每一抱囊梗的顶端都产生一个圆球

16、形的孢子囊用高倍镜观察孢子囊内部的构造。在末成熟的孢子囊内，往往只有大量的小颗粒体，接近成熟或成熟的孢子囊则充满了许多褐色圆形的孢囊孢子。孢子囊壁破裂后，孢子散出，露出锣锤形的囊轴。注意孢子囊的形态和颜色。2接合孢子 取根霉属和犁头霉属接合孢子玻片观察原配于囊、配囊柄及配子囊的发育过程。成熟的接合孢子深褐色，表面粗糙。犁头霉菌的接合孢子在配子囊柄的着生处有附属丝，注意观察配囊柄的形状及大小。（四） 子囊菌亚门1 半子囊菌纲 属低等子囊菌,子囊不是由产囊细胞发育而来,而是由双核菌丝上的双核细胞发育形成的。子囊裸生，无子囊果。子囊壁簿，没有孔口，靠壁的胀裂或消解来释放于囊孢子。观察材料：外囊菌属(

17、Tapharian)，取桃缩叶病(Tdeformans)做临时玻片，在显微镜下检查。观察桃缩叶病害标本,注意受害叶片形态颜色有何变化?叶片正、背面有无霉层?该霜层是由什么构成的?2 核菌纲 核菌纲真菌的子囊果是子囊壳,在子囊果的顶部有固定的孔口。子囊单层壁,有的子囊间有侧丝。生活史中有发达的无性阶段。白粉菌目(Erysiphales)和小煤炱目(Mel1ales)的子囊果是闭裹壳,没有孔口，这与不整囊菌纲的子囊果相似，但是白粉菌的子囊壁不消解,在成熟的闭囊壳内能清楚地看见于囊和子囊孢子。1）白粉菌目(Erygiphales) 本目是专性寄生菌。菌丝蔓延于寄主体表，并产生白色粉状物，引起植物白粉

18、病。有性阶段产生闭囊壳，闭囊壳外有附属丝，附属丝形状不一。闭囊壳内子囊数目也不一样，由一个至多个。附属丝的形状和子囊数目的多少是分属的依据。取下列病害材料，挑取闭囊壳作临时玻片，在显微镜下检查，注意子囊果有无孔口。轻轻挤压盖玻片，使闭囊壳破裂，观察子囊果内是单子囊还是多子囊，子囊果表面生有附属丝，形状如何？用下列材料按检索表进行属的鉴定。白粉菌主要属检索表A闭囊壳内单个子囊B附属丝菌丝状单囊壳属(Sphaerotheca) BB附属丝刚直较粗，顶端二又状重复分枝，分枝末端螺旋状卷曲 叉丝单囊壳属(Podosphaera)AA闭囊壳内多个子囊 B附属丝菌丝状，发育不良白粉菌属(Erysiphe)

19、 (又称Blumeria)BB附属丝非菌丝状 C附属丝刚直，基部膨大，顶端尖锐球针壳属(Phyllactinia)CC附属丝基部不膨大 D附属丝粗、刚直，顶端二叉状重复分枝，分枝末端卷曲叉丝壳属(Microsphaera)DD附属丝不分枝顶端卷曲钩丝壳属(Unicular) 2） 球壳菌目(Sphaeriales) 子囊果是子囊壳，子囊壳具有真正壳壁，单生或丛生于子座上。壳壁(包被)有鲜色肉质或暗色膜质或炭质的。子囊一般排列成子实层，少数是分散的。一般都有发达的无性阶段。黑腐皮壳属(Valsa)，取苹果树腐烂病菌(Valsa mali)切片镜捡，注意子囊壳的形态和着生位置，子囊及子裹孢子的形态

20、如何？如何排列？再视察苹果树腐烂病病害标本，有什么症状特点？1) 鞭毛菌亚门与接合菌亚门真菌有什么区别?2) 绘匍枝根霉菌(Rhizopus stolonifer) 孢子囊、孢囊梗、假根匍匐菌丝图。3) 绘你所见到的接合孢子图4）绘白粉属、叉丝单囊壳属、球针壳属、钩丝壳属的形态图实验三 半知菌、担子菌亚门真菌及所致病害半知菌的种类很多，是植物病害的重要病原菌，可以引起斑点、腐烂和萎蔫等症状。半知菌大多以分生孢子繁殖，少数半知菌不产生任何孢子，而只有菌丝扣菌核两种形态，所以无性阶段的形态结构就成为分类的重要依据。担子菌是高等真菌,包括许多形态很不相似的真菌。从无担子果的黑粉菌、锈菌,到子实体很大

21、的伞菌、腹菌、较低等的担子菌几乎全为寄生菌，引起植物的黑粉病和锈病。高等担子菌大多是土壤、朽木上的腐生菌,有些能寄生树木引起林木病害.还有许多是食用菌，但一些真菌有毒一、目的要求认识半知菌、担子菌亚门中主要病原菌的形态特征及其所致病害的症状类型，掌握分类依据，尤其是锈菌目各主要属的形态特征和典型生活史。二、材料和用具有关病害标本、病原菌永久病害标本和各种类型的子实体标本.显微镜、擦镜纸、乳酚油、挑针、载玻片、盖玻片、小纱布。（一）丝孢纲(Hyphomycetes) 丝孢纲真菌的分生孢子着生在丝状的分生孢子梗上，而不是着生在特定形态(如球状或盘状)的分生孢子器内或分生孢子盘上，或者不产生任何类型

22、的分生孢子。1）粉孢属(Oidium) 引起植物白粉病。观察小麦白粉病的标本，注意叶片表面上白色粉状物。挑取少许粉状物制片镜检观察，注意分生孢子梗和分生孢子的形态及分生孢子的排列方式.2）青霉属(Penicillium) 柑桔青霉菌(Pitalicum)是柑桔贮藏和运输期中的重要病原菌。观察果腐症状和青霉菌分生孢子梗及孢子，注意观察分生孢子梗顶端的形态特征。3）镰孢属 (Fusarium) 是瘤座菌目的代表菌。特点是分生孢了梗着生在分生孢子座上。4）丝核菌属 (Rhizoctonia) 本属真菌不产生任何无性孢子，观察人工培养的立枯丝核菌(R. solani)菌丝体.幼龄菌丝无色，后期呈褐色，

23、菌丝粗，直角分枝，分枝处有缢缩，分枝附近有隔膜。（二）腔胞纲 (Coelomycetes)腔胞纲真菌的分生孢子梗和分生孢子产生在分生孢子盘或分生孢子器内。1）大茎点属 (Macrophoma) 观察大叶黄杨病叶材料，作徒手切片，镜检。观察分生孢子器、分生孢子梗、分生孢子并与茎点霉属比较,注意比较分生孢子的大小。2）色二孢属 (Diplodia) 观察松枯枝病。分生孢子器球形。 分生孢子处为单细胞，无色，成熟后为双细胞，褐色，椭圆形或卵形。（三）冬孢菌纲(Teliomycetes)本纲真菌的特征是不形成担子果，担子从冬孢子上产生，冬孢子成堆或分散。这是一类较低等的担子菌，包含两个目：锈菌目和黑粉

24、菌目,其中绝大多数种类均寄生于植物上，是一类重要的植物病原菌。1）胶锈菌属 (Gymnosporangium)没有夏孢子阶段；冬孢子双细胞，有可以胶化的长柄， 观察梨胶锈菌(G.haraeanum)所形成的锈病症状。镜检锈孢子器和性孢子器切片。挑取桧柏上吸水膨大的冬孢子堆(角)镜检。2）柱锈菌属（Cronartium）冬孢子排列成柱状。三、作业与思考题1）半知菌亚门根据什么特征分类？有几个纲，举出代表性的病害和病菌。2）半知菌的学名和中文属名的名称中包含着什么内容。3）绘胶锈菌属的形态图。4）分清长生活史、短生活史、多型现象、转主寄主、专性寄主、锁状联合等术语概念。实验四 林木病害的其他病原观

25、察一、实验目的1了解植物病原细菌及线虫所致病害症状特点。2学习镜检细菌、线虫的基本方法。3认识植物病毒形态和病毒病主要症状类型，二、实验内容1细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁、细胞质和细胞器，有的细菌有鞭毛、荚膜和芽孢的结构。细菌个体微小，往往需制成涂片并经染色后，在显微镜油浸的物镜下观察。植物病原细菌都是杆状菌，其分属依据是鞭毛数及着生方式、格兰氏染色反应、在培养基上长成的菌落色泽、形状和生理生化反应。2一般细菌病害病斑或病部周围组织呈水渍状，在潮湿条件下可在病部溢出菌脓，干后形成菌胶。菌脓在清晨或潮湿天气较易观察到。将病部特别是病键交接处切片镜检时，一般可见到大量细菌从病部（特别是维管束向

26、外涌出），像烟囱冒出的烟雾，这种菌溢现象是诊断细菌病害的简便而可靠的方法。3植物寄生线虫是又一类重要病原物。除直接致病外，有的线虫可以传带病毒，或造成植物伤口以利于其它病原微生物侵染。植物线虫主要在寄主的根际或根内、茎、叶和种子内生存，有的形成虫瘿（如根结线虫）。引起植物病害的症状主要是营养不良、生长衰弱或畸形，从而降低产量或品质。植物寄生线虫是病原物中个体较大的，但是多数仍不能用肉眼看到或看清楚，需用低倍显微镜观察。线虫虫体分头、颈、腹、尾4部分。头部有唇、口腔、吻针和侧器；颈部包括食道、神经环和排泄孔；腹部有肠管和生殖器官，后端有肛门；尾部有侧尾腺和尾腺。分辨科、属、种的主要依据是体形、食

27、道、头和尾部的主要形态特征。4病毒颗粒很小，必须用电子显微镜才能观察到。植物病毒颗粒可以分为圆球状（或等边多面体）、炮弹状、长杆状和线条状4种。这些在课堂和本次实验课上只能通过观看电镜照片或幻灯片来了解。5植物病毒病的主要症状类型有花叶、变色、条纹、枯斑或环斑坏死、畸形。应该注意：一方面这些症状类型的分辨在病毒病鉴定上具有比起它病害更重要的意义，另一方面在实际观察中，也会发现同一种病毒病在发病过程中或在不同环境条件下会有不同的表现（不同病状甚至隐症）。6病毒病多为系统性侵染，没有病征，易与非侵染性病害相混淆，往往需要通过一定方式的传染试验证实其传染性。三、实验材料及用具植物病原细菌、病毒和寄生

28、线虫所致病害症状标本、显微镜、玻片、酒精灯、培养皿、化学试剂（碱性品红、苯酚、亚甲蓝、氢氧化钾、酒精）。四、实验步骤1观察下列病害标本，区分各类症状。桃细菌性穿孔病、青枯病等。附带观察寄生性种子植物大豆菟丝子。注意观察细菌性病害的菌脓和菌胶、线虫的虫瘿。2取细菌性病害的标本，最好是新鲜的，在病斑边缘或病健交接处切开，或将较小的叶段移到玻片上的水滴里，加盖玻片，稍停片刻在显微镜下观察菌溢现象。3涂片固定染色观察细菌形态1）涂片 取一干净的载玻片，在中央偏左处滴一滴无菌水，然后用接种针在细菌病害腐烂部分或溢脓上挑取一点脓状物，移至水滴中混匀，用另一张在玻片的一端与细菌悬浮液滴接触，并沿底边平行方向

29、向右移动，涂布后的片子须在空气中来回晃动，以加速其干燥。另一种做法是将有细菌悬浮滴的玻片直立，使菌液流动，形成一条细菌悬浮液膜，让其自然干燥。2）固定 用拇指和食指拿住涂好的玻片一端，有菌面朝上，在酒精灯上往返通过34次，注意通过火焰时要使玻片各处受热均匀，不可固定烘烤一处，温度也不要太高。进行鞭毛染色的玻片一般不用火焰加热法固定，而用1%福尔马林溶液固定。3）染色 常用于细菌染色的染色剂和染色法有以下两种：苯酚品红染色法：溶液I：碱性品红 0.3g，酒精（95%） 10mL；溶液II：苯酚（结晶）5g，蒸馏水 95mL。将溶液I和溶液II分别配好后混合，用滴管移到涂片上染色1分钟，然后用清水

30、冲洗，直至水中没有红色为止。亚甲蓝染色法：溶液I：亚甲蓝 0.3g，酒精（95%） 30mL；溶液II：氢氧化钾溶液（0.01%）100mL。溶液I和II分别配好后混合放置备用。染色时将上述染色剂移到涂片上静置1分钟后，用清水冲洗直至水中看不到蓝色为止。用吸水纸吸去水分或风干，即可供镜检。4）镜检 先将物镜中的油镜（90）转至镜筒正下方，在染色的细菌涂片标本上滴一滴香柏油，将油镜降至香柏油中，再侧视，把物镜降至十分贴近载玻片的高度，然后用眼睛对准目镜，边观察边转动粗调节轮使镜筒徐徐上升，看到标本后转动细调节轮调整焦距，使物像清晰。如果没有找到细菌，则要重新再侧视的情况下将物镜降至贴近载玻片的位

31、置，重复上述操作。切不可用粗调节轮由上向下降低物镜，以免损伤镜头和玻片。油镜用毕，须用擦镜纸沾二甲苯擦净。4线虫形态的观察 将线虫虫瘿浸在水中约1小时，用解剖针挑取种皮内的白色物移到载玻片上的水滴中，盖上盖玻片镜检。用低倍镜找到适合观察的线虫后再换高倍镜观察各种器官的形态。五、作业与思考1完成2片以上的细菌涂片（经染色）。2绘制显微镜下观察到的细菌菌溢现象示意图。3绘制线虫结构简图。实验五 病原物的分离与培养基本原理：柯赫氏法则（Kochs Postulate）是通过一系列步骤确定引起病害的病原物的原则和方法，是诊断病害中的证病律。其基本步骤如下：1在染病组织上用显微镜经常检查到某种微生物；2

32、从病组织中分离得到该微生物，并获得纯培养；3将纯培养的微生物接种到健康的感病寄主植物后，发生原先观察到的症状；4从接种发病的组织中，再分离，又得到相同的微生物。全过程拟分两次实验完成，本次完成第一和第二步。包括实验十三培养基的制作和本次实验病原物的分离、培养及纯化。一、实验目的掌握病原物分离、培养和纯化的一般方法。二、实验内容（一）真菌的分离1分离前的准备工作分离和培养应在很清洁，甚至无菌的条件下进行。如在无菌室、无菌操作箱、超净工作台和清洁的室内。无菌操作箱的内壁可以用升汞液（1：1000）擦洗，使用超净工作台应事先开动运行15分钟左右。在屋顶四壁清洁而空气较静止的房间进行时，要将地面扫净擦

33、湿，用1：1000的升汞液或清水擦净工作台，并在台上铺一块干净湿白布，将所需物品都放在台布上，工作时避免走动，以减少污染。2分离材料的选择选择新近发病的植株、器官或组织作为分离材料，可以减少腐生菌的污染。从病健交界处分离这一原则对于大部分病害的分离都是适用的。而有些有晕圈的斑点病（如野火病），病菌局限在斑点中央的坏死组织中，从斑点边缘是分离不到病菌的。3组织表面消毒从植株或组织上取下的分离材料，必须进行表面消毒，以杀死或减少病组织表面的腐生菌，保留组织内部的病原菌。常用的表面消毒液有：1）升汞消毒液配方为：升汞 1g， 浓盐酸 2.5mL， 水 1000mL。将升汞溶于浓盐酸中，待其充分溶解后

34、，用水稀释。升汞剧毒、无色，为便于认识，可在溶液中加几滴红染料。消毒时间因材料质地、发病部位深浅及污染情况而异，一般35分钟。消毒后用无菌水冲洗34次。2）漂白粉消毒液有些真菌对汞、铜等金属离子敏感，可用漂白粉消毒液。其配方为：漂白粉 10g， 水 140mL。选用新鲜漂白粉，将漂白粉溶于水中，过滤后使用，随用随配，不能久留，否则因挥发而失去杀菌能力。一般处理35分钟，消毒时间亦因材料而异，处理种子用510分钟。消毒后用无菌水冲洗，有时也可不必冲洗。3）酒精和其它消毒剂70%酒精也是常用的表面消毒液。将材料在酒精溶液中浸数秒钟到一分钟，然后水洗。有些幼嫩组织只需用脱脂棉蘸酒精溶液少许，擦涂表面

35、，待酒精挥发后，即可放在培养基上培养。对于特别幼嫩的病组织，因对药物敏感，可以用灭菌水洗89次。4分离方法常用的分离方法分为两大类：1）组织分离法分离一小块染病组织，经表面消毒后，移植于平板培养基上培养。很多材料适用此法，下面介绍几种：斑点病病原菌的分离：挑取新鲜典型的病斑，在病健交界处，剪取5mm2的染病组织，在70%酒精中浸数秒钟，然后移入0.1%的升汞溶液中处理35分钟，用无菌水冲洗3次，移入平板培养基上培养。维管束病菌的分离：先用70%的酒精将根茎表面擦拭消毒，然后用灭过菌的解剖刀剥去表皮，再切取其中一小块变色的部分，用升汞液或漂白粉液消毒，用无菌水冲洗几次后，移到培养基上培养。种子内

36、病原菌的分离：用升汞溶液或漂白粉溶液进行种子表面消毒，然后用无菌水冲洗，再移于平板培养基上。2）稀释分离法用无菌水从发病组织表面冲下孢子，配成孢子悬浮液，用无菌移液管或滴管吸取一定体积的菌液至平板培养基上，然后用无菌玻璃棒将菌液轻轻的均匀涂布在整个平板上，或将菌液移至无菌培养皿中，然后倾入融化后冷却至45的培养基，轻轻振荡、平置、凝固后倒置培养。并在皿盖上写上日期、分离物名称、分离者姓名。分离工作有时并不顺利，要从分离材料、培养基、培养条件及操作处理方法等方面找原因，改变工作方法，不断进行试验（二）菌种的纯化按照上述步骤分离病原物，如果材料很新鲜，本身很少污染，有可能一次分离出纯培养菌。然而多

37、数情况下会发现同一培养皿中有不同的菌落，要做菌种的纯化。纯化的方法很多，下面介绍三种方法。1琼脂平板稀释纯化法将菌种上产生的孢子用无菌水冲洗下，在无菌培养皿中适当稀释后（大致每个培养皿中只有30个左右的孢子），取一定量的孢子悬浮液与融化后冷却至45左右的琼脂培养基混合，制成平板培养基，在适宜温度下培养。然后，从形成的单个菌落边缘上分离菌丝到斜面培养基上培养。这种方法实质上是分离菌落，主要用于酵母菌和细菌等的纯化，也适用于其它产生孢子较多的真菌的纯化。操作简便，但不能确定一个菌落是否从单个孢子繁殖而来，纯化的可靠性较差。2干孢子分离法干的孢子，如黑粉菌的厚垣孢子和有些担子菌的担孢子等，可用细的缝

38、衣针或解剖针挑取。先将干孢子放在灭菌的玻片上，用食指和大拇指握住缝衣针，在低倍镜下检查，当针尖接触孢子时，孢子即离开玻片附在针尖上，然后移到适宜的培养基上培养。不过，初学者较难成功地利用此法。3菌丝尖端分离法此法适用于不产生孢子或产生孢子而孢子不容易分离的真菌。将真菌培养在培养基表面，用低倍镜找到单独的菌丝尖端后，用内径0.5mm左右的毛细管从菌丝尖端徐徐插入，连同培养基将菌丝尖端切下，然后将这一带有培养基的菌丝移到新的培养基上培养。（三）真菌的培养无论是从病部移到培养基上的病原菌，还是准备用于回接到寄主上的病原菌，都要在一定条件下培养。根据试验的要求，可将纯化的菌种，移植到适当的固体或液体培

39、养基上培养，也可以用锥形瓶盛PDA基质，进行大量繁殖。一般真菌只要满足2030的温度即可生长，少数真菌由于研究其生理的特殊需要，应在一定的恒温条件下培养。培养过程中要注意检查和记载，一般真菌经24小时培养后即可检查其生长情况，如：有无污染、温度是否合适等。真菌的培养性状最好是培养在琼脂平板培养基上观察和描述，观察和记载的项目主要有：1菌落的质地；2菌落是凸起的还是成簇的菌丝体；3形成成堆的孢子是干性的还是粘性的；4各种子实体和休眠结构（厚垣孢子、菌核等）的形成及所需的时间；5菌落正面和背面的颜色，有无色素渗入培养基中；6有无特殊气味；7菌落中有无部分呈扇形；8生长率的快慢，如菌落长到一定直径所

40、需的时间。菌落的颜色也要仔细地不断地观察，它的颜色往往随着培养时间而改变。此外，培养性状的描述，要注明培养基的种类、培养温度和有无光照等。三、实验材料与用具无菌室或接种箱，手提式高压蒸汽灭菌锅、电炉、天平、铁架台、灭菌培养皿、250mL锥形瓶、漏斗、试管、2000mL烧杯、小烧杯、移液管、止水夹、石蕊试纸、乳胶管、报纸、棉花、医用纱布、解剖剪、接种环、酒精灯；马铃薯、琼脂、葡萄糖（或蔗糖）、NaOH溶液、盐酸、漂白粉、70%酒精、升汞；苹果叶斑病病叶、杨树腐烂病枝条。四、实验步骤（一）叶斑病类的分离法1准备工作1）PDA培养基的制作及无菌水的准备按照前面介绍的方法，配制好PDA培养基，分装入试

41、管和锥形瓶中，包装好，在250mL的锥形瓶中装入100mL左右自来水，塞上棉塞，包装好，连同培养基一起灭菌，灭菌完毕，制作斜面培养基和平板培养基。制好的培养基最好保温培养23天，检查灭菌效果后使用。2）分离室的清洁用5%石炭酸或1：40福尔马林溶液在分离室或接种箱中消毒，或用紫外线照射1020分钟。3）穿好工作服。4）用肥皂洗净手。2分离工作一切准备工作就绪后，进入分离室或坐在分离箱旁。1）点燃酒精灯，用少许脱脂棉蘸70%酒精擦手。2）取装有培养基的培养皿二套，在皿盖上注明分离材料、日期及分离者姓名。3）从病叶上选择典型的单独病斑，在病健交界处剪取约4mm2的病组织10块，放入小烧杯中。4）用

42、70%的酒精或0.1%升汞对病组织块进行表面消毒。5）用无菌镊子将消毒过的组织块移到平板培养基上，每皿45块。6）将培养皿倒置于2628的恒温箱中培养。7）数日后病组织周围长出菌丝体而形成菌落，经鉴定（镜检）无误后，可留作纯菌种。8）用火焰灭菌接种针，在菌落边缘取一小块带病菌的培养基，移到试管斜面上培养，得到纯菌种。（二）果实、枝干或维管束内部病菌的分离法1准备工作：同叶斑病类分离法。2分离工作1）点燃酒精灯，用70%的酒精擦手。2）取平板培养基两培养皿，在皿盖上注明分离材料、分离者姓名等。3）取有黑疤病的甘薯，用脱脂棉蘸70%的酒精少许，涂杨树病部表面及周围，通过火焰烧去遗留的酒精，重复进行

43、23次。4）用解剖刀经火焰灭菌后，将病部表皮削去，在病健交界处取小块变色的组织，直接移到平板培养基上，每皿34块。5）将培养皿倒置于2628恒温箱中培养。6）以下步骤同叶斑病类分离法。五、作业1每人交纯菌种试管一支。2书面报告分离结果，有无污染发生，分析原因。实验六 林木病害的接种试验一、实验目的1深对病原物传染、侵染等概念的理解；2掌握几种常用的接种方法；3在上一次试验的基础上，了解柯赫氏法则的全过程。二、讲解要点病原菌的种类很多，其传播途径各不相同，主要有种子、土壤、气流和昆虫等。因此，在人工接种时，要采用不同的方法。接种技术广泛地应用于寄主范围和品种抗病性测定、病菌致病性变异、病害流行及

44、防治等项研究。下面介绍几种常用的接种方法。（一）种子传染病害的接种1拌种法 用病菌的孢子拌种是常用的接种方法。2浸种法 孢子悬浮液浸种也是常用的方法。浸种时抽气减压，可以使孢子渗入种子内部，从而提高接种效率。在人工培养基上不易产生孢子的病原菌，可以用搅碎的菌丝悬浮液浸种。（二）土壤传染病害的接种1土壤接种法 是将病菌在播种前或播种时拌在土壤中的接种办法。如立枯病即可将人工培养的菌丝拌入灭菌的土中，然后播种。在所有病害的接种实验中，以土壤接种最为复杂。主要原因是病菌易受土壤物理、化学及生物学性质的影响。2蘸根接种法 是将幼苗的根部稍加损伤，然后将受伤的根部蘸上孢子或菌丝悬浮液的接种方法。这种方法

45、使病菌能与根部直接接触，受土壤微生物的影响较小。同时，根部有损伤，病菌也易侵入，效果比土壤接种法好，常用于枯萎病等的接种。（三）气流和雨水传播病害的接种1喷雾法 将孢子（或菌丝）悬浮液喷洒在寄主表面，病菌可以从气孔、伤口和表皮直接侵入。叶背气孔数目一般比叶正面的多，对于从气孔侵入的病菌，则应注意喷洒叶背；对于从伤口侵入的病菌，喷洒前应用细砂土或金刚砂摩擦叶面，使叶表稍损伤；叶面有蜡质的，接种时可用湿布将蜡质层擦去。2喷粉法 是将一定量的干孢子与滑石粉混匀后，放在小喷粉器中喷洒在潮湿的植物表面的接种法。滑石粉的量一般是孢子量的10倍左右。如白粉菌和锈菌等的接种。3涂抹法 涂抹法是先用手指蘸水摩擦

46、叶片，去掉蜡质层，使表面有一薄层水膜，然后将孢子涂抹在上面的接种法。喷雾、喷粉和涂抹接种后的植物，必须保湿约24小时左右，使病菌孢子能萌发侵入。4注射法 是将病菌孢子悬浮液用注射器注入寄主生长点或幼嫩部分的接种法。5针刺法 是指用灭菌的针刺伤寄主植物组织，然后将病菌接种在伤口内或用灭菌的针蘸菌脓刺伤寄主组织的接种法。此法用于伤口侵入的病菌。如块茎、果实、块根等的腐烂病菌。（四）昆虫传播病害的接种针对昆虫主要作为病毒病的传播媒介。三、实验材料及用具立枯病菌、腐烂病、溃疡病病菌；杨树、柳树枝条、刺槐种子；恒温恒湿箱、小喷雾器、显微镜、接种针、接种环、酒精灯、70%酒精等。四、实验步骤（一）苗木立枯病的接种喷雾法1取立枯病病菌丝核菌、镰刀菌、瓜果腐霉的纯培养，用无菌水配成孢子和菌丝悬浮