胥慧-中国农业大学博士研究生学术新人奖.doc

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1、中国农业大学博士研究生学术新人奖申 请 表院系名称 生物学院 申请人 胥慧 指导教师 何群 联系电话 62734599 电子信箱 xuhuiclaire 填表时间 2010年7月7日 中国农业大学研究生院制表2010年7月指导教师简况姓名何群出生年月1966.10最高学位博士职称教授职称评定时间2006年学位授予学校及国别北京大学，中国一级学科生物学二级学科微生物学研究方向微生物分子生物学是否院士 是 否指导的博士生是否得过国家优博是 否指导的博士生是否获得过北京市优博 是 否学术兼职（限填三项）无代表性学术成果（限填五项）1. Zhao, Y., Y. Shen, S. Yang, J. W

2、ang, Q. Hu, Y. Wang and Q. He. (2010) Ubiquitin ligase components Cullin4 and DDB1 are essential for DNA methylation in Neurospora crassa. J Biol Chem. 285: 4355-4365.2. He, Q., J. Cha, Q. He, H. Lee, Y. Yang and Y. Liu. (2006) CKI and CKII mediate the FREQUENCY-dependent phosphorylation of the WHIT

3、E COLLAR complex to close the Neurospora circadian negative feedback loop. Genes and Development. 20: 2552-2565.3. He, Q., P. Cheng, Q. He, and Y. Liu. (2005) The COP9 signalosome regulates the Neurospora circadian clock by controlling the stability of the SCFFWD-1 complex. Genes & Development 19: 1

4、518-1531.4. He, Q, and Y. Liu (2005) Degradation of the Neurospora circadian clock protein FREQUENCY through the ubiquitin-proteasome pathway. Biochem Soc Trans. 33: 953-956.5. He, Q.*, Cheng, P.*, Y. Yang, Q. He, H. Yu, and Y. Liu. (2003) FWD1-mediated degradation of FREQUENCY in Neurospora establi

5、shes a conserved mechanism for circadian clock regulation. EMBO J. 22: 4421-4430.在研科研项目主持的科研项目：1脉孢菌WC-1和WC-2蛋白的化学修饰对生物钟系统调控的研究。国家自然科学基金面上项目。2008至2010年度。2COP9信号体核心功能亚基生物学功能的研究。高等学校博士学科点专项科研基金。2008至2010年度。3粗糙脉孢菌泛素连接酶底物识别亚基NRRB1生物学功能的研究。教育部科学技术研究重点项目。2008至2010年度。4脉孢菌中SCF型泛素连接酶的系统研究。高等学校博士学科点专项科研基金。2010

6、至2012年度。申请人简况姓名胥慧学号ZB0706035专业微生物学民族汉出生年月1985年7月入学时间2007年9月本科毕业学校中国农业大学毕业时间2007年6月本科专业生物技术硕士毕业学校无毕业时间无一级学科二级学科研究方向生物学微生物学微生物分子生物学博士学位考生类别硕博连读 提前攻博 直 博 统一考试 攻读博士学位方式脱产攻读 在职攻读 博士学位论文情况博士学位论文开题题目，选题、学术意义、创新性、预期的研究成果作简要说明（表格空间不够，可加页）博士学位论文开题题目：粗糙脉孢菌dcaf16基因调控DNA甲基化的机制。选题背景：DNA的甲基化修饰包括从头甲基化和维持甲基化两种类型。从头甲

7、基化就是基因组中DNA甲基化建立的机制。癌症等许多疾病的发生都是由于DNA从头甲基化发生错误而引起的，可见DNA从头甲基化的调控极其重要。然而在不同物种中DNA从头甲基化的引发因子可能存在较大区别，使得研究基因组DNA甲基化建立的机制成为难点。然而，真菌、植物和哺乳动物中的研究均证明：组蛋白H3K9的甲基化修饰是DNA甲基化的前提。在粗糙脉胞菌中，组蛋白H3K9甲基转移酶DIM-5的基因突变导致所有的DNA甲基化丧失；拟南芥H3K9甲基转移酶Kryptonite基因突变导致CpNpG位点的甲基化丧失及内源逆转录转座子的活化；水稻的中一个H3K9甲基转移酶SDG714主要影响Tos17 DNA的

8、甲基化。随后，在小鼠胚胎干细胞中的研究也发现：组蛋白H3K9甲基化酶Suv39h1和Suv39h2双突变导致着丝粒周围区域中主要卫星序列DNA的甲基化显著降低。这些结果都说明了：组蛋白H3K9的甲基化修饰直接参与了DNA甲基化的调控。脉孢菌中异染色质蛋白HP1失活导致DNA甲基化全部丧失，因此，HP1被认为是H3K9三甲基化和DNA甲基化之间的连接分子。这些结果说明：组蛋白化学修饰引发的染色质结构的改变可能是DNA从头甲基化过程中的一个重要步骤。在粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）中，DNA的甲基化不依赖于RNAi。而是由H3K9甲基化指导DNA的甲基化。粗糙脉孢菌中DNA的甲基

9、转移酶叫DIM-2，所有已知位点的胞嘧啶甲基化都是由它来完成的。而组蛋白H3K9的甲基化是由DIM-5来执行的。HP1对于粗糙脉孢菌的DNA甲基化也是必需的，它结合到甲基化的H3K9上，维持异染色质状态，并募集DIM-2完成对DNA的甲基化。然而对于去甲基化酶及影响组蛋白修饰从而调控DNA甲基化的其他因子，未见更多报道。课题研究意义：在真核生物中，DNA甲基化和组蛋白修饰是表观遗传主要的两种调控手段。DNA胞嘧啶5位C上的甲基化修饰调控着众多的生物学过程，例如控制转座子沉默、调控基因的转录和基因沉默、参与异染色质组装、X染色体失活、胚胎发生、癌症、以及基因组印记等。在植物、哺乳动物和真菌中，D

10、NA的甲基化、组蛋白H3K9的甲基化、基因沉默以及异染色质的形成等都是彼此相关的。表观遗传学不同的调控方式以及它们之间复杂的关联成为目前表观遗传学研究的热点。然而，目前对DNA甲基化形成信号、DNA甲基化的调控等基本问题的了解仍然非常有限。本课题试图在粗糙脉孢菌中寻找新的参与调控DNA甲基化的因子，并研究它与其他已报道因子之间的相互关系，确定它参与的调控通路，并阐明它在这一调控途径中的具体作用，从而揭示DNA甲基化的部分调控途径。新的调控因子的发现，将进一步完善脉孢菌DNA甲基化的调控方式。由于DNA甲基化调控方式的保守性，本研究的展开对于其他物种的表观遗传学研究具有借鉴意义。创新性：本研究紧

11、紧抓住DNA甲基化调控上游信号通路这一重大科学问题，具有扎实的前期工作基础和合理的科学模型。我们实验室最近的工作在多细胞生物中证实：基于Cul4、DDB1的泛素连接酶参与DNA甲基化的调控；通过系统分析，我们认为AT丰富的DNA序列本身可能是引发Cul4 及其互作因子识别并聚集的信号，通过与DIM-5的互作对核小体的组蛋白H3K9进行甲基化修饰将初始较弱的DNA甲基化信号转变成为高效持久的信号。DNA甲基转移酶被HP1等蛋白募集到该区域完成DNA的甲基化。因此，基于Cul4的泛素连接酶在DNA甲基化的上游调控途径中起着至关重要的作用。而作为泛素连接酶，Cul4-DDB1可能还需要底物识别亚基，

12、介导其识别并募集底物。那么，这个或多个底物识别亚基是什么蛋白？而Cul4泛素连接酶的底物又是什么？这些蛋白的发现，将在Cul4调控DNA甲基化的原理上取得重大突破。本研究利用粗糙脉胞菌为材料，遗传学与生化分析紧密结合，深入探讨已知的表观调控因子的生物学功能和作用的分子机制；发现和鉴定新的表观遗传调控因子并开展其功能研究。对表观遗传信息建立和维持的分子机制提供新的线索。预期的研究成果：本课题试图在粗糙脉孢菌中寻找新的参与调控DNA甲基化的因子，通过突变体的遗传表型分析判断它是否参与影响DNA甲基化，通过甲基化敏感酶的酶切实验考察它是否影响DNA的甲基化修饰，染色质免疫共沉淀技术检测突变体中组蛋白

13、各种修饰（特别是H3K9甲基化及乙酰化修饰、H3K4甲基化修饰、H2B泛素化修饰等）的变化，及该蛋白在染色质上的定位情况，并通过蛋白质免疫共沉淀、蛋白纯化及质谱分析以及遗传分析研究它与其他已报道因子（Cul4、DDB1、DIM-5、DIM-2、HP1）之间的相互关系，阐明它在DNA甲基化调控途径中位于哪一层级、起什么具体作用，从而进一步揭示DNA甲基化的上游调控机制。至博士学位论文开题时，我已经利用同源重组原理构建了一系列基因缺失突变体，并通过突变体的表型分析及DNA甲基化检测技术，确定了一个影响DNA甲基化的因子，我把它命名为DCAF16。DCAF16的真核表达载体已经构建成功，与一些相关因

14、子的共转化菌株已经得到，蛋白质免疫共沉淀显示它能与CUL4相互作用。染色质免疫共沉淀也已开展，显示DCAF16影响组蛋白H3K9的三甲基化修饰。DCAF16既影响DNA甲基化，也影响组蛋白H3K9三甲基化修饰，提示我们DCAF16可能通过调控H3K9的三甲基化修饰来调控DNA的甲基化；dcaf16缺失突变影响菌丝生长的表型与cul4、ddb1、dim-5非常相似，而不同于dim-2，也暗示着DCAF16与Cul4、DDB1、DIM-5处于同一层级，位于DIM-2的上游；DCAF16能与Cul4相互作用，更是直接表明它能与Cul4形成复合体，来调控下游事件。因此，目前推测的模型是：DCAF16与

15、Cul4、DDB1形成复合体，它们直接募集DIM-5催化组蛋白H3K9的三甲基化，组蛋白H3K9的三甲基化信号被HP1识别，HP1募集DIM-2完成对DNA的甲基化。接下来的工作，将继续以这个模型为参考，通过进一步验证DCAF16与其它因子的相互作用、以及在各个因子的缺失突变体中检测其余因子两两的相互作用，来确定DCAF16-Cul4-DDB1-DIM-5复合体的构成方式；通过在DCAF16蛋白上引入定点突变及结构域的删除，进一步明确DCAF16在DNA甲基化调控通路中的具体作用；通过纯化DCAF16，结合质谱分析，寻找更多可能参与DNA甲基化调控的蛋白，并期望找到Cul4泛素连接酶的底物。注

16、：在撰写SCI文章时，将DCAF16蛋白更名为DCAF26。已取得的科研成果（含本科、硕士、博士期间）成果或专利名称刊物、出版社或授权单位发表、出版或授权时间作者排名（如导师是第一作者请注明）刊物级别影响因子DCAF26, an Adaptor Protein of Cul4-based E3, Is Essential for DNA Methylation in Neurospora crassa.PLoS Genetics正在复审（Revised）第一作者SCI核心期刊9.532现代微生物研究技术中国农业大学出版社2008年10月出版并列参编人员非SCI无说明：一、刊物级别请注明是否为核

17、心期刊。同时请申请人准备好以上成果的刊物封面、目录及论文摘要及首页复印件；专著封面和版权页复印件；获奖证书及专利证书复印件。以上各科研成果复印件请按序装订。二、申请人还需提交本科阶段成绩单、硕士阶段成绩单及博士在学成绩单。三、以上复印件均以A4页面复印。申请人主持或者参加过的科研项目情况项目名称项目编号项目来源项目起止年月项目主持人脉孢菌中SCF型泛素连接酶的系统研究20090008110025高等学校博士学科点专项科研基金2010.1.2012.12.何群获得资助后研究计划及预期成果（如表格空间不够，可加页）1. 粗糙脉孢菌中dcaf26基因调控DNA甲基化的机制，目前我已经取得阶段性成果，

18、总结如下：生物信息学分析发现DCAF26含有WD40结构域，这是Cul4泛素连接酶的底物识别蛋白的典型结构特征；DCAF26能与Cul4、DDB1相互作用，这符合DCAF（Cul4泛素连接酶的底物识别蛋白）的定义；因此DCAF26是Cul4泛素连接酶的一个底物识别亚基。DCAF26既影响DNA甲基化，也影响组蛋白H3K9三甲基化修饰；dcaf26缺失突变影响菌丝生长的表型与cul4、ddb1、dim-5非常相似，而不同于dim-2；DCAF26还能与DIM-5相互作用，表明Cul4-DDB1-DCAF26-DIM-5能形成一个复合体，通过调控H3K9三甲基化来调控DNA甲基化。而在ddb1缺失

19、突变体中，Cul4不再能与DCAF26相互作用，证明DDB1是连接Cul4与DCAF26的桥梁；dcaf26缺失突变导致DDB1不再能与DIM-5相互作用，证明DCAF26是连接DDB1与DIM-5的桥梁。同时，我对DCAF26蛋白的定点突变及结构域删除实验找到了DCAF26与DDB1相互作用的结构域；缺失这个结构域的DCAF26蛋白不能救回dcaf26缺失突变体的H3K9me3及DNA甲基化，证明DCAF26与DDB1的结合是DIM-5募集过程中十分关键的一环。因此，dcaf26调控脉孢菌DNA甲基化的模型是：DCAF26与Cul4、DDB1形成泛素连接酶复合体，Cul4-DDB1-DCAF

20、26复合体通过募集DIM-5催化组蛋白H3K9的三甲基化，组蛋白H3K9的三甲基化信号被HP1识别，HP1募集DIM-2完成对DNA的甲基化。在募集DIM-5到DDB1所在的甲基化起始区域的过程中，DCAF26起到了关键的桥梁作用。这部分工作已经完成数据整理和论文撰写，投稿到PLoS Genetics，并按审稿意见补充了数据，目前已进入到复审（Revised）阶段。 2. 我们对DCAF26进行了蛋白纯化以及共沉淀蛋白的质谱分析。除了Cul4、DDB1、DIM-5以外，还得到了一些被DCAF26共沉淀下来的蛋白。我将构建这些共沉淀蛋白的基因缺失突变体及蛋白表达载体，检测它们是否参与DNA甲基化

21、调控，若DNA甲基化在突变体中受到影响，则继续检测H3K9的一、二、三甲基化是否受到影响、H3K27及H4K20的甲基化是否受到影响，从而判断目标蛋白是否通过调控组蛋白修饰来调控DNA甲基化。若找到影响DNA甲基化的因子，再通过遗传分析和生化方法，确定它参与的调控途径，阐明它调控DNA甲基化的机制。3. 在DCAF26的共沉淀蛋白中，我已经发现了一个影响DNA甲基化的蛋白，它在2个月前也被Selker的研究组报道，并命名为DIM-7。Selker的文章仅报道DIM-7能影响DNA及H3K9的甲基化，并且DIM-7能与DIM-5相互作用，却并未深入研究DIM-7与Cul4、DDB1等的关系，不明

22、确DIM-7在募集DIM-5的通路中处于什么样的位置。而我的实验也已证明dim7缺失突变体遗传表型与cul4、ddb1、dcaf26、dim-5非常相似；dim-7缺失突变体中DNA甲基化及H3K9三甲基化完全丧失；DIM-7能分别与Cul4、DDB1、DCAF26相互作用。接下来，我将在dcaf26缺失突变体中检测DIM-7与DDB1、DIM-7与DIM-5、DIM-7与Cul4的相互作用；在dim-7缺失突变体中检测DCAF26与DIM-5的相互作用；在dim-5缺失突变体中检测DCAF26与DIM-7的相互作用。通过这些数据，建立起这些蛋白之间的相互关系，明确DIM-5募集过程中的传导通

23、路。而后，再寻找这些蛋白相互结合的位点，为更好的理解这一调控通路打下坚实的基础。申请人承诺我保证本申请表内容的真实性。如果获得教育部博士研究生学术新人奖资助，我将严格遵守教育部、国务院学位委员会及学校的相关管理规定；发奋学习，刻苦钻研，积极投身于高水平科学研究和创新研究，努力完成研究计划。若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。 申请人（签名）： 2010年 月 日导师推荐意见(包括对博士生思想品德、学风、业务能力、学习成绩、外语水平和科研潜力的总体评价)胥慧是一个热爱科学、勤勉踏实、爱国守纪、乐于助人的好学生。她具有很强的动手能力、逻辑思维能力、文献阅读能力、及交流与协作能力，正因如此，她取得了非常不错的科研成果。她根据自己的求知欲和兴趣点来选择课程，取得了优秀的成绩。她的英语很好，口语非常地道，写作也不错，常常帮助同学纠正发音和句式表达。她对生物学有着强烈的好奇心和求知欲，又兼有聪明的头脑和灵巧的双手，还有毅力、耐心和严谨的科研态度，相信在不久的将来，她将成长为一位优秀的青年科学家。 导师签字： 2010年 月 日学院推荐意见学院主管院长签字：学院盖章： 2010年 月 日 学校审定意见负责人签字： 2010年 月 日