细胞破碎技术 (2)课件.ppt

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1、关于细胞破碎技术(2)1现在学习的是第1页，共70页2生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程本章内容现在学习的是第2页，共70页3常见的细胞壁结构细胞破碎技术包涵体的纯化方法本章的主要内容现在学习的是第3页，共70页4概述概述不同不同类型的型的细胞分泌目胞分泌目标产物的物的类型：型：n动物物细胞多分泌到胞多分泌到细胞外培养液胞外培养液n植物植物细胞多胞多为胞内胞内产物物n微生物（微生物（细菌菌/酵母酵母/真菌）胞内、胞外真菌）胞内、胞外 对于胞内于胞内产物需要收集菌体或物需要收集菌体或细胞胞进行行破碎。破碎。现在学习的是第4页，共70页5概述概述(大多数情况下，抗生素，胞外大多数情况下，

2、抗生素，胞外酶，一些多糖，及，一些多糖，及氨基酸等目氨基酸等目标产物存在于物存在于发酵液酵液中。中。(有些目有些目标产物存在于物存在于生物体生物体中。中。l尤尤其其是是由由基基因因工工程程菌菌产生生的的大大多多数数蛋蛋白白质是是在在细胞内沉胞内沉积。l脂脂类物物质和一些抗生素包含在生物体中。和一些抗生素包含在生物体中。现在学习的是第5页，共70页6细胞破碎（细胞破碎（cell rupturecell rupture）技术是指利用外力破坏技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯

3、化细胞内合成的非分泌型生化细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。物质（产品）的基础。为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。种微生物细胞壁的组成和结构。现在学习的是第6页，共70页74.1 细胞壁结构对破碎的影响细胞壁结构对破碎的影响Z微生物微生物细胞和植物胞和植物细胞外胞外层均均为细胞壁，胞壁，细胞壁里面胞壁里面是是细胞膜，胞膜，动物物细胞没有胞没有细胞壁，胞壁，仅有有细胞膜。胞膜。Z通常通常细胞壁胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透胞膜脆弱，易受渗透压冲冲击而破碎，因此而破碎，因此细胞破碎的

4、阻力主要来自于胞破碎的阻力主要来自于细胞胞壁。壁。Z不不同同细胞胞壁壁的的结构构和和组成成不不完完全全相相同同，故故细胞胞壁壁的机械的机械强度不同，度不同，细胞破碎的胞破碎的难易程度也就不同。易程度也就不同。现在学习的是第7页，共70页8细菌细胞壁结构细菌细胞壁结构n几几乎乎所所有有细菌菌的的细胞胞壁壁都都是是由由肽聚聚糖糖组成成，它它是是难溶溶性性的的聚聚糖糖链；n相相邻聚聚糖糖链上上的的短短肽又又交交叉叉相相联，构构成成了了细胞胞壁壁的的三三维网网状状结构，包构，包围在在细胞周胞周围；n使使细胞具有一定的形状和胞具有一定的形状和强度。度。现在学习的是第8页，共70页9细菌细胞壁结构细菌细胞

5、壁结构u破碎破碎细菌的主要阻力是来自于菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状聚糖的网状结构，构，其网其网结构的致密程度和构的致密程度和强度取决于聚糖度取决于聚糖链上所存在上所存在的的肽键的数量和其交的数量和其交联的程度。的程度。u革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。不同。u革革兰氏氏阴阴性性菌菌典典型型的的生生物物是是大大肠杆杆菌菌，通通过这种种细胞生胞生产了很多了很多细胞重胞重组的的产物。物。药物名称药物名称宿主宿主用途用途胰岛素胰岛素大肠杆菌大肠杆菌治疗糖尿病治疗糖尿病人生长激素人生长激素大肠杆菌大肠杆菌治疗侏儒病治疗侏儒病-干扰素干扰素

6、大肠杆菌大肠杆菌治疗毛状细胞白血病等治疗毛状细胞白血病等现在学习的是第9页，共70页10n最最里里层是是由由葡葡聚聚糖糖的的细纤维组成成，它它构构成成了了细胞胞壁壁的的刚性性骨骨架，使架，使细胞具有一定的形状，胞具有一定的形状，n上面的是一上面的是一层糖蛋白，糖蛋白，n最最外外层是是甘甘露露聚聚糖糖，由由1,6-磷磷酸酸二二酯键连接接成成网网状状。在在该层的的内内部部，有有甘甘露露聚聚糖糖-酶的的复复合物。合物。n破破碎碎酵酵母母细胞胞壁壁的的阻阻力力主主要要决决定定于于壁壁结构构交交联的的紧密密程程度度和和它它的的厚度厚度。现在学习的是第10页，共70页11真菌的细胞壁真菌的细胞壁l真菌的真

7、菌的细胞壁胞壁较厚，主要由多糖厚，主要由多糖组成，其次成，其次还含有含有较少量的蛋白少量的蛋白质和脂和脂类。l不同的真菌，不同的真菌，细胞壁的胞壁的组成有很大的不同，其中成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，和葡聚糖构成，少数含少数含纤维素。素。l与与酵酵母母和和细菌菌的的细胞胞壁壁一一样，真真菌菌细胞胞壁壁的的强度度和和聚聚合合物物的的网网状状结构构有有关关，不不仅如如此此，它它还含含有有几几丁丁质或或纤维素素的的纤维状状结构构，所所以以强度度有所提高。有所提高。现在学习的是第11页，共70页12l红面面包包霉霉菌菌细胞胞壁壁具具有有同同心心

8、圆层状状结构主要存在三种聚合物构主要存在三种聚合物l最外最外层(a)是是-和和-葡聚糖的混合物，葡聚糖的混合物，l第第2层(b)是糖蛋白的网状是糖蛋白的网状结构构l第第3层(c)主要是蛋白主要是蛋白质，l最内最内层(d)主要是几丁主要是几丁质。红面包霉菌细胞壁的结构示意图红面包霉菌细胞壁的结构示意图现在学习的是第12页，共70页13微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多

9、层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-40%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质细胞壁的组成和结构细胞壁的组成和结构微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌

10、真菌真菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-40%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.

11、5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质细胞壁的组成和结构细胞壁的组成和结构现在学习的是第13页，共70页14植物细胞壁的结构植物细胞壁的结构l对于于已已生生长结束束的的植植物物细胞胞壁壁可可分分为初初生生壁壁和和次次生生壁壁两两部部分。分。l初生壁是初生壁是细胞生胞生长期形成的。初生壁一般期形成的。初生壁一般较薄（薄（13m），），富有富有弹性。性。l由多糖和蛋白由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分构成，多糖主要成分为纤维素、半素、半纤维素和素和果胶果胶类物物质。纤维素是素是长链D-葡聚糖，葡聚糖，许多多这样的的长链形成形成微微纤丝。l它是构成它是构成细胞壁的骨架，

12、胞壁的骨架，细胞壁的机械胞壁的机械强度主要来自度主要来自于微于微纤丝。现在学习的是第14页，共70页15植物次生细胞壁植物次生细胞壁 某某些些植植物物细细胞胞，当当生生长长停停止止后后，在在细细胞胞质质和和初初生生细细胞胞壁壁之之间间形形成成了了次次生生细细胞胞壁壁。次次生生壁壁一一般般较较厚厚(4m(4m以上以上)，常有三层组成。，常有三层组成。n 在在次次生生壁壁中中，纤纤维维素素和和半半纤纤维维素素含含量量比比初初生生壁壁增增加加很很多多，纤纤维维素素的的微微纤纤丝丝排排列列得得更更紧紧密密和和有有规规则则，而而且且存在木质素的沉积。存在木质素的沉积。因因此此次次生生壁壁的的形形成成提提

13、高高了了细细胞胞壁壁的的坚坚硬硬性性，使使植植物物细胞具有很高的机械强度。细胞具有很高的机械强度。现在学习的是第15页，共70页164.2 4.2 细胞破碎技术细胞破碎技术现在学习的是第16页，共70页17机械破碎机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法 物理破碎物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱酶促破碎促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。细胞破碎。通过各种化学试剂对

14、细胞膜的通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破结构受到破坏，而达到细胞破碎碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理现在学习的是第17页，共70页18一机械法机械破碎法又可分为机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（高压匀浆破碎法（homogenizationhomogenization）高速珠研磨破碎法（高速珠研磨破碎法（bead grindingbead grinding）超声波破碎法（超声波破碎法（ultrasonicationultraso

15、nication）现在学习的是第18页，共70页19采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。1.高压匀浆法高压匀浆法（High-pressure homogenization）细胞胞悬浮液自高浮液自高压室室针形形阀喷出出时，每秒速度高达几百米，每秒速度高达几百米，高速高速喷出的出的浆液又射到静止的液又射到静止的撞撞击环上，被迫改上，被迫改变方向从出方向从出口管流出。口管流出。细胞在胞在这一系列高一系列高速运速运动过程中程中经历了高速剪切、了高速剪切、碰撞及碰撞及压力力骤降，造成降，造成细胞破胞破碎。碎。现在学习的是第19页，共70页20高压匀浆法使用时注

16、意事项高压匀浆法使用时注意事项u高压匀浆器的操作温度上升约高压匀浆器的操作温度上升约-/10MPa/10MPa为了控为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在口温度调节在2020左右。左右。u可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式。可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式。u在在工工业业规规模模的的细细胞胞破破碎碎中中，对对于于酵酵母母等等难难破破碎碎的的及及浓浓度度高高或或处处于于生生长长静静止止期期的的细细胞胞，常常采采用用多多次次循循环环的的操操作方法。作方法。现在学习的是第20页，共70页21高压匀浆法适用的范围高压

17、匀浆法适用的范围大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法高压匀浆法适用的范围：高压匀浆法适用的范围：n酵母和大多数细菌细胞的破碎；酵母和大多数细菌细胞的破碎；n料液细胞浓度可以很高，料液细胞浓度可以很高，20%20%左右。左右。不宜使用高压匀浆法。不宜使用高压匀浆法。易造成堵塞的易造成堵塞的团状或状或丝状真菌，状真菌，较小的革小的革兰氏阳性菌，氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易硬，易损伤匀匀浆阀）现在学习的是第21页，共70页22l升高压力有利于破碎，升高压力有利于破碎，减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎减少细胞的循环次数

18、，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。但但p p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p p超过一超过一定值时，定值时，R R增加但很慢。增加但很慢。在工业生产中，通常采用的压力为在工业生产中，通常采用的压力为555570Mpa70Mpa。l破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易生长在简单的合成培养

19、基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。破碎。影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素现在学习的是第22页，共70页23高压匀浆法高压匀浆法-X-X-挤压器挤压器l改改进的高的高压方法：将方法：将浓缩的菌体的菌体悬液冷却至液冷却至-25至至-30形成冰晶体，利用形成冰晶体，利用500MPa以上的高以上的高压冲冲击，冷，冷冻细胞胞从高从高压阀小孔中小孔中挤出。出。l细胞破碎是由于冰晶体在受胞破碎是由于冰晶体在受压时的相的相变，包埋在冰中，包埋在冰中的的细胞胞变形所引起的。形所引起的。l主要用于主要用于实验室中。室中。l优点是适用的范点是适用的范围广，破碎率高，广，破碎率高，细胞碎

20、片的粉碎胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高程度低以及活性的保留率高l对冷冷冻一融解敏感的生化物一融解敏感的生化物质不适用。不适用。现在学习的是第23页，共70页242）珠磨法 bead millu珠磨是常用的方法u细胞胞悬浮液与极浮液与极细的玻璃小珠、的玻璃小珠、石英砂、氧化石英砂、氧化铝等研磨等研磨剂（直径（直径小于小于1mm）一起快速）一起快速搅拌或研拌或研磨，研磨磨，研磨剂、珠子与、珠子与细胞之胞之间的互相剪切、碰撞，使的互相剪切、碰撞，使细胞破胞破碎，碎，释放出内含物。放出内含物。u在工在工业规模的破碎中，常采用高模的破碎中，常采用高速珠磨机速珠磨机WSK卧式高效全能珠磨机现在学习的

21、是第24页，共70页25高速珠磨机工作原理l磨室内放置玻璃小珠，装在同心磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园上的园盘搅拌器高速旋拌器高速旋转，使，使细胞胞悬浮液和玻璃小珠相互浮液和玻璃小珠相互搅动；l细胞破碎是由剪切力胞破碎是由剪切力层之之间的碰撞和磨料的碰撞和磨料滚动引起引起l在出口在出口处，旋，旋转园园盘和出口平和出口平板之板之间的狭的狭缝很小，可阻很小，可阻挡玻玻离小珠，使不被料液离小珠，使不被料液带出。出。l由于操作由于操作过程中会程中会产生生热量，量，故磨室故磨室还装有冷却装有冷却夹套，以冷套，以冷却却细胞胞悬浮液和玻璃小珠。浮液和玻璃小珠。现在学习的是第25页，共70页26珠磨机破

22、碎作用方程u破碎作用是相对于时间的一级反应速度破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式：过程，符合下列公式：ln1/(1-R)=Kt ln1/(1-R)=Kt R R破碎率；破碎率；K K一级反应速度常数；一级反应速度常数；t t一一 时间。时间。uK K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的以下：降低能耗、减少大分子目的产物物的失活、减少由于高破碎率的失活、减少由于高破碎率产生的生

23、的细胞小碎片不易分离而胞小碎片不易分离而给后后续操作操作带来的困来的困难。现在学习的是第26页，共70页273）超声波破碎l超声波破碎法超声波破碎法利用超声波振利用超声波振荡器器发射的射的15-25kHz的超声波探的超声波探头处理理细胞胞悬浮液。浮液。l超声波振超声波振荡器以可分器以可分为槽式和探槽式和探头直接插入介直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。两种型式，一般破碎效果后者比前者好。l超声波的超声波的细胞破碎效率与胞破碎效率与细胞种胞种类、浓度度和和超声波超声波的声的声频、声能声能有关。有关。现在学习的是第27页，共70页28超声波破碎的机理JY92-II D超声波超声波细胞粉

24、碎机细胞粉碎机(一般一般认为在超声波作用下液体在超声波作用下液体发生空化作用生空化作用 液体中局部空穴的形成、增大和液体中局部空穴的形成、增大和闭合合产生极大的冲生极大的冲击波和波和剪切力，引起的粘滞性旋剪切力，引起的粘滞性旋涡在在细胞上造成了剪切力，使胞上造成了剪切力，使细胞内液体胞内液体发生流生流动，从而使，从而使细胞破碎。胞破碎。(操作操作过程程产生大量的生大量的热，因此操作需在冰水或外部，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中冷却的容器中进行。行。现在学习的是第28页，共70页29超声波破碎的适用范围超声波破碎是很超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物烈的破碎方法，适用于多数微生物

25、的破碎。的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比菌比G+细菌易破碎，菌易破碎，对酵母菌的效果酵母菌的效果较差。差。但超声波但超声波产生的化学自由基生的化学自由基团能使某些敏感性活能使某些敏感性活性物性物质失活。失活。超声波破碎的有效能量利用率极低超声波破碎的有效能量利用率极低由于由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在在在在实验实验室小室小室小室小规规模模模模细细胞破碎中常用胞破碎中常用胞破碎中常用胞破碎中常用。现在学习的是第29页，共70页30技术技术原理原理效果效果成本成本举例举例匀浆法匀浆法(孔型孔型)须使细胞通过的小孔，须使

26、细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而使细胞受到剪切力而破碎破碎剧烈剧烈 适中适中细胞悬浮液大规模细胞悬浮液大规模处理处理珠磨破碎珠磨破碎法法细胞被玻璃珠或铁珠细胞被玻璃珠或铁珠捣碎捣碎剧烈剧烈 便宜便宜细胞悬浮液和植物细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理细胞的大规模处理超声波法超声波法用超声波的空穴作用用超声波的空穴作用使细胞破碎使细胞破碎适中适中 昂贵昂贵细胞悬浮液小规模细胞悬浮液小规模处理处理研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎适中适中 便宜便宜匀浆法匀浆法(片型片型)细胞被搅拌器劈碎细胞被搅拌器劈碎适中适中 适中适中动物组织及动物细动物组织及动物细胞胞不同机械破碎方法的比较现在学习的是

27、第30页，共70页31非机械破碎方法非机械破碎方法酶溶破碎法（酶溶破碎法（enzyme lysisenzyme lysis）化学破碎法（化学破碎法（chemical treatmentchemical treatment）去垢剂破碎法（去垢剂破碎法（detergentsdetergents）渗透压冲击破碎法（渗透压冲击破碎法（osmotic shockosmotic shock）冻融破碎法（冻融破碎法（freezing and thawingfreezing and thawing）现在学习的是第31页，共70页32二二 非机械法非机械法非机械方法很多非机械方法很多1 1 酶解酶解2 2 化学

28、法溶胞化学法溶胞3 3 物理法物理法n渗透压冲击渗透压冲击n冻结和融化冻结和融化n干燥法干燥法其中酶法和化学法溶胞应用最广其中酶法和化学法溶胞应用最广。二现在学习的是第32页，共70页33 1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis)酶解酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。胞膜。1 1）外加酶法）外加酶法常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶、甘露糖酶、甘露糖酶、糖苷酶、糖苷酶、肽键

29、内切酶、肽键内切酶、壳多糖酶等壳多糖酶等现在学习的是第33页，共70页34外加酶法n酶解法的特点是解法的特点是专一性一性强，因此在，因此在选择酶系系统时，必，必须根据根据细胞胞的的结构和化学构和化学组成来成来选择。n溶菌溶菌酶（lysozyme)能能专一性地分解一性地分解细胞壁上胞壁上肽聚糖分子的聚糖分子的-1,4糖苷糖苷键，因此主要用于，因此主要用于细菌菌类细胞壁的裂解。革胞壁的裂解。革兰氏阳性菌氏阳性菌悬浮液中加入溶菌浮液中加入溶菌酶，很快就，很快就产生溶壁生溶壁现象。但象。但对于革于革兰氏阴氏阴性菌，性菌，单独采用溶菌独采用溶菌酶无效果，必无效果，必须与螯合与螯合剂EDTA一起使用。一起

30、使用。n放放线菌的菌的细胞壁胞壁结构构类似于革似于革兰氏阳性菌，以氏阳性菌，以肽聚糖聚糖为主要成主要成分，所以也能采用溶菌分，所以也能采用溶菌酶，n酵母和真菌由于酵母和真菌由于细胞壁的胞壁的组分主要是分主要是纤维素、葡聚糖、几丁素、葡聚糖、几丁质等，等，常用常用蜗牛牛酶、纤维素素酶、多糖、多糖酶等。等。n植物植物细胞壁的主要成分是胞壁的主要成分是纤维素，常采用素，常采用纤维素素酶和半和半纤维素素酶裂解。裂解。现在学习的是第34页，共70页35外加酶法有有时采用几种采用几种酶的混合物会的混合物会产生更好的效果，加入生更好的效果，加入时需需确定相确定相应的次序。的次序。对酵母酵母细胞采用胞采用酶法

31、破碎法破碎时，先加入蛋白，先加入蛋白酶作用作用蛋白蛋白质-甘露聚糖甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生，最后只剩下原生质体，体，这时若若缓冲液的渗透冲液的渗透压变化，化，则细胞膜破裂，胞膜破裂，释出胞内出胞内产物。物。现在学习的是第35页，共70页36酶解法的特点 优点：n发生酶解的条件温和发生酶解的条件温和n能选择性地释放产物能选择性地释放产物n胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整缺点：缺点：溶溶酶价格高，价格高，溶溶酶法通用性差（不同菌种需法通用性差（不同菌种需选择不同的不同的

32、酶)产物抑制的存在。物抑制的存在。现在学习的是第36页，共70页37酶解-自溶作用 l自溶作用是自溶作用是酶解的另一种方法，解的另一种方法，利用生物体自身利用生物体自身产生的生的酶来溶胞，而不需外加其他的来溶胞，而不需外加其他的酶。l在微生物代在微生物代谢过程中，大多数都能程中，大多数都能产生一种能水解生一种能水解细胞壁上聚合物的胞壁上聚合物的酶，以便生，以便生长过程程继续下去。下去。l自溶作用：改自溶作用：改变其生其生长环境（温度、境（温度、缓冲液）冲液），可以，可以诱发产生生过剩的剩的这种种酶或激或激发产生其它的自生其它的自溶溶酶，以达到自溶目的。，以达到自溶目的。l缺点是：易引起所需蛋白

33、缺点是：易引起所需蛋白质的的变性，自溶后性，自溶后细胞胞悬浮液粘度增大，浮液粘度增大，过滤速度下降。速度下降。现在学习的是第37页，共70页38某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。胞内物质有选择地渗透出来。2 化学渗透法化学渗透法（Chemical permeation）该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。现在学习的是第

34、38页，共70页39n酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用常采用6mol/L HCl6mol/L HCl。n碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。分从细胞内渗漏出来。成本低，反应激烈，不具选择性。成本低，反应激烈，不具选择性。（1）酸、碱处理法）酸、碱处理法现在学习的是第39页，共70页40细胞破碎常用的表面活性胞破碎常用的表面活性剂：十二十二烷基硫酸基硫酸钠（SDS，阴离子型）；。，阴离子型）；。非离子型如非离子型如Triton X-100和吐温（和吐温（Tween）等）等对疏水性物疏水性物质具有很具有很

35、强的的亲和力，能和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子磷脂双分子层，使某些胞内物，使某些胞内物质释放出来。放出来。（2）表面活性）表面活性剂无无论表面活性表面活性剂是阴离子、阳离子是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，性的，既能和水作用也能和脂作用，能与能与细胞壁上的脂胞壁上的脂蛋白蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解现在学习的是第40页，共70页41能分解能分解细胞壁中的磷脂，使胞壁中的磷脂，使细胞胞结构破坏，胞内物构破坏，胞内物质被被释放出来。放出来。有机溶有机溶剂可采用

36、丁可采用丁酯、丁醇、丙、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等仿和甲苯等（3）有机溶）有机溶剂（4）EDTA螯合螯合剂处理理G-细菌，菌，对细胞壁外胞壁外层有破坏作用。有破坏作用。G-细菌的壁外菌的壁外层结构通常靠二价阳离子构通常靠二价阳离子Ca2+或或Mg2+结合脂多糖和合脂多糖和蛋白蛋白质来来维持，一旦持，一旦EDTA将将Ca2+或或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使将脱落，使细胞壁外胞壁外层膜出膜出现洞穴。洞穴。现在学习的是第41页，共70页42u通用性差；通用性差；u时间长，效率低，一般胞内物，效率低，一般胞内物质释放率不超放率不超过50%；u有些化学有些化学试剂有毒。有

37、毒。u化学化学试剂的加入常会的加入常会给随后随后产物的物的纯化化带来困来困难，并影响最并影响最终产物物纯度度化学渗透法特点：化学渗透法特点：缺点缺点l对产物物释放有一定的放有一定的选择性，可使一些性，可使一些较小分子量的溶小分子量的溶质如多如多肽和小分子的和小分子的酶蛋白透蛋白透过，而核酸等大分子量的，而核酸等大分子量的物物质仍滞留在胞内；仍滞留在胞内；l细胞外形完整，碎片少，胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和液粘度低，易于固液分离和进一一步提取。步提取。优点优点现在学习的是第42页，共70页433 物理法物理法u渗透压冲击法渗透压冲击法u冻结冻结-融化法融化法u干燥法干燥法现在学

38、习的是第43页，共70页441）渗透压冲击法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将将细胞放在高渗透胞放在高渗透压的溶液中（如一定的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透糖溶液），由于渗透压的作用，的作用，细胞内水分便向外渗出，胞内水分便向外渗出，细胞胞发生收生收缩，当达到平衡后，将介，当达到平衡后，将介质快速稀快速稀释，或将，或将细胞胞转入水或入水或缓冲液中，由于渗透冲液中，由于渗透压的突然的突然变化，胞外化，胞外的水迅速渗入胞内，引起的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胞快速膨胀而破裂。而破裂。仅适用于适用于细胞壁胞壁较脆弱的脆弱的细胞或胞或

39、细胞壁胞壁预先用先用酶处理或在培养理或在培养过程中加入某些抑制程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，胞壁有缺陷，强度减弱。度减弱。现在学习的是第44页，共70页45 2）冻结-融化法 将将细胞放在低温下冷胞放在低温下冷冻（约-15），然后在室温中融化，反），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。复多次而达到破壁作用。一方面能使一方面能使细胞膜的疏水胞膜的疏水键结构破裂，从而增加构破裂，从而增加细胞的胞的亲水性能，水性能，另一方面胞内水另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胞膨胀而破裂。而破裂。适用于适用于细胞壁胞壁较脆弱的菌体，破碎率脆

40、弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，低，需反复多次，此外，在在冻融融过程中可能引起某些蛋白程中可能引起某些蛋白质变性。性。现在学习的是第45页，共70页46使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-3025-30的气流中吹干；的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于不稳定的生化物质冷冻干燥适用于不稳定的生化

41、物质3 3）干燥法）干燥法气流干燥气流干燥真空干燥真空干燥喷雾干燥喷雾干燥冷冻干燥冷冻干燥现在学习的是第46页，共70页47现在学习的是第47页，共70页48选择破碎方法的依据：选择破碎方法的依据：u细胞胞处理量；理量；u细胞壁胞壁强度和度和结构构(高聚物交高聚物交联程度、种程度、种类和壁厚度和壁厚度)；u目目标产物物对破碎条件的敏感性；破碎条件的敏感性；u破碎程度；破碎程度；u目目标产物的物的选择性性释放放现在学习的是第48页，共70页49选择性释放目标产物的一般原则选择性释放目标产物的一般原则仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围l当目当目标产物存在于物存在于

42、细胞膜附近胞膜附近时，可采用，可采用较混和的方法，如混和的方法，如酶溶法、溶法、渗透渗透压冲冲击法和法和冻结融化法等。当目融化法等。当目标产物存在于物存在于细胞胞质内内时，则需采用需采用强烈的机械破碎法烈的机械破碎法l当目当目标产物物处于与于与细胞膜或胞膜或细胞壁胞壁结合的状合的状态时，调节溶液溶液PH值，离子，离子强度或添加与目度或添加与目标产物具有物具有亲和性的和性的试剂如：螯如：螯合合剂、表面活性、表面活性剂等，使目等，使目标产物容易溶解物容易溶解释放。放。(2)(2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，

43、降低细胞的破碎程度。相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。现在学习的是第49页，共70页50 讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究 一一.化学法化学法 20%(W/V)大肠杆菌悬浮液大肠杆菌悬浮液+B.A 37搅拌搅拌 高速离心高速离心 测上清液酶活。测上清液酶活。1.处理时间处理时间 R%2.5h2.丁酯用量丁酯用量条件：条件：37，搅拌，搅拌3小时小时适宜的适宜的B.A加量为加量为12%，释放率释放率R=55%12%55%R12%2.03U/mg比活现在学习的是第50页，共70页51二二.化学法化学法冻融法结合冻融法结合 加加B.A(12%,37搅

44、拌拌3h）菌菌悬液液 冻融融(冻结14h 融化融化)释放率放率70%；比活；比活2.69 u/mg 三三.化学化学超声波振荡法结合超声波振荡法结合 先先丁丁酯处理，再超声波（理，再超声波（90秒），秒），释放率放率72%小型小型设备，不能工，不能工业大大规模生模生产。四四.高压匀浆法高压匀浆法 20%(W/V)菌菌悬液，液，P=50MPa，N=3。释放率放率R=38.4%，原因原因:细胞破碎后胞破碎后,仍有仍有较多多酶吸附在吸附在细胞碎片上。胞碎片上。五五.高压匀浆高压匀浆化学法结合化学法结合 先高先高压匀匀浆，再加，再加10%丁丁酯，37搅拌拌3h，高速离心，高速离心(3万万rpm)，释放率

45、放率：R=60%六六.珠磨珠磨 直径直径0.4mm玻璃珠。玻璃珠。释放率放率：R=95%现在学习的是第51页，共70页52破碎率的测定破碎率的测定细细胞胞破破碎碎后后，大大量量带带电电荷荷的的内内含含物物被被释释放放到到水水相相，使使导导电率上升。电率上升。1)1)直接测定法直接测定法2)2)目的产物测定法目的产物测定法3)3)导电率测定法导电率测定法采用染色法把破碎的采用染色法把破碎的细胞与未破碎的胞与未破碎的细胞区胞区别开来。开来。如破碎的革如破碎的革兰氏阳性菌可染成革氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的氏阴性菌的颜色；色；采用革采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的氏染色法染色酵母破碎液，完整的

46、细胞呈紫色，而胞呈紫色，而受受损害的害的细胞呈亮胞呈亮红色。色。将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与并与100%100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。破碎率的标准值比较，计算其破碎率。现在学习的是第52页，共70页53破碎技术的研究方向破碎技术的研究方向 -多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合化学法、化学法、酶法、机械法相法、机械法相结合。合。酶法与高法与高压匀匀浆、超声波震、超声波震荡、鳌合合剂、渗透、渗透压法法结合合如用溶解如用溶解酶预处理面包酵母，然后高理面包酵母，然后高压匀匀浆，95MPa压力下匀力

47、下匀浆4次，次，总破碎率接近破碎率接近100%。而。而单独采用高独采用高压匀匀浆法，同法，同样条件下破碎率只条件下破碎率只有有32%。有机溶有机溶剂与与冻融法、干燥法融法、干燥法结合合现在学习的是第53页，共70页54破碎技破碎技术的研究方向的研究方向-与上游与上游过程相程相结合合v在在发酵培养酵培养过程中，培养基、生程中，培养基、生长期、操作参数（如期、操作参数（如pH、温度、温度、通气量、通气量、搅拌拌转速、稀速、稀释率等）等因素都率等）等因素都对细胞壁膜的胞壁膜的结构与构与组成有成有一定的影响。一定的影响。v在生在生长后期，加入某些能抑制或阻止后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物胞壁物质合

48、成的抑制合成的抑制剂(如青霉素如青霉素)，继续培养一段培养一段时间后，新分裂的后，新分裂的细胞其胞其细胞壁有胞壁有缺陷，利于破碎；缺陷，利于破碎；v选择较易破碎的菌种作易破碎的菌种作为寄主寄主细胞，如革胞，如革兰氏阴性氏阴性细菌；菌；v用基因工程的方法用基因工程的方法对菌种菌种进行改造，如在行改造，如在细胞内引胞内引进噬菌体基因，噬菌体基因，培养培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，胞自内向外溶解，释放出内含物。放出内含物。现在学习的是第54页，共70页554.4 4.4 基因工程包含体的纯化基因工程包含体的

49、纯化基因工程菌培养液不同表达形式的前处理基因工程菌培养液不同表达形式的前处理(胞外分泌型表达：离心胞外分泌型表达：离心,收集液相收集液相浓缩纯化。化。(胞内表达：胞内表达：l胞内可溶性表达：离心胞内可溶性表达：离心,收集菌体收集菌体细胞破碎胞破碎离心，离心，收集上清收集上清纯化化l胞内周胞内周质表达：离心表达：离心,收集菌体收集菌体低低浓度溶菌度溶菌酶或渗或渗透透压冲冲击等溶解目等溶解目标物物离心离心,收集上清液收集上清液纯化。化。l不溶性包涵体：离心不溶性包涵体：离心,收集菌体收集菌体细胞破碎胞破碎离心离心,收集收集沉淀沉淀包涵体洗包涵体洗涤目目标蛋白蛋白变性溶解性溶解复性复性纯化。化。现在

50、学习的是第55页，共70页56外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白蛋白产物占菌体总蛋白产物占菌体总蛋白外源蛋白的积累外源蛋白的积累人胰岛素人胰岛素50%50%形成包涵体形成包涵体-丙酰胺酶丙酰胺酶20%20%在细胞间区在细胞间区-人体干扰素人体干扰素25%25%形成包涵体形成包涵体凝乳酶原凝乳酶原形成包涵体形成包涵体牛生长激素牛生长激素30%30%形成包涵体形成包涵体-内酰胺酶内酰胺酶形成间区包涵体形成间区包涵体人胰岛素原人胰岛素原5%26%5%26%形成包涵体形成包涵体现在学习的是第56页，共70页57Z包涵体：一种蛋白包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。