第六章柠檬酸发酵过程无菌空气制备及染菌分析和防治.ppt

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1、第六章柠檬酸发酵过程无菌空气制备及染菌分析和防治现在学习的是第1页，共45页第一节第一节 柠檬酸发酵的灭菌工作柠檬酸发酵的灭菌工作v一、灭菌要求与灭菌方法一、灭菌要求与灭菌方法 柠檬酸发酵要求全过程进行纯种培养，即只允许柠檬酸生产菌的存在、生长和繁殖。特别在斜面培养、麸曲菌种、种子罐培菌以及发酵早期更要严格保证纯培养。现在学习的是第2页，共45页（一）灭菌与消毒 灭菌灭菌是指采用强烈的理化因素使被处理的物体内、外部的一切微生物永远丧失其生长、繁殖能力的措施。消毒消毒是指用理化方法消灭致病菌，即采用一定措施杀死被处理物体表面或内部存在的对人体有害的病原菌，而并不一定是杀死一切微生物，它允许对人体

2、无害的微生物存在。现在学习的是第3页，共45页（二）灭菌方法1、火焰灼烧灭菌 接种针、镊子等金属小工具和玻璃棒、试管口、三角瓶口等可直接用火焰灼烧而杀死其中各种微生物。此法简单有效，但局限性大。2、干热灭菌 培养皿、吸管等玻璃器皿，可用烘箱进行干热灭菌。100，1h可杀死营养体细胞，而杀死芽孢则需要160，2h。现在学习的是第4页，共45页3、湿热灭菌v常压间歇蒸汽灭菌 产压下蒸汽温度只能达到100，1次灭菌难以杀死各种芽孢，故可采用间歇多次灭菌法。具体操作具体操作：用蒸汽蒸煮培养基30-60min，杀死微生物的营养体细胞，冷却后置37 烘箱培养，使未被杀死的芽孢萌发成营养体。次日再蒸煮一次，

3、37 培养24h，如此反复处理3次，即可完全杀死培养基中的各种杂菌。现在学习的是第5页，共45页加压蒸汽灭菌加压蒸汽灭菌 斜面、麸曲、摇瓶培养基以及发酵培养基等都采用加压蒸汽灭菌。小件物品的灭菌是在加压锅内进行，锅内蒸汽压力为0.1MPa，温度120，以温度为准维持1530min,能杀死各种微生物及其芽孢。现在学习的是第6页，共45页4、辐射灭菌v紫外辐射灭菌 此法常用于无菌室的灭菌。波长265266nm的紫外光对细胞有极强的杀伤作用。照射1530min，可杀死大部分细菌，但紫外线穿透力极差，一层纸就能完全阻挡其辐射作用。v电离辐射灭菌 60Co、X射线等电离辐射有较强的杀菌能力，且穿透力强，

4、能杀死包装内各种微生物。现在学习的是第7页，共45页（三）常用消毒剂（三）常用消毒剂 除了巴斯德或蒸汽消毒等方法外，更多的是使用化学消毒剂，在厂区周围环境、车间地面、接种室以及皮肤表面进行消毒。现在学习的是第8页，共45页几种常用的表面消毒剂类型类型名称名称常用浓度常用浓度/%应用范围应用范围作用机理作用机理醇类乙醇7075皮肤，器皿蛋白质变性，损伤细胞膜，脱水，溶解脂类醛类甲醛戊二醛0.51.02接种箱、物品、曲房接种室、精密仪器破坏蛋白质氢键或氨基同上氧化剂高锰酸钾过氧乙酸0.10.20.5皮肤、水果、蔬菜皮肤、器皿、玻璃电极氧化蛋白质活性基团同上卤素类漂白粉碘酒10202.5厂房、厕所、

5、饮水、空气、皮肤皮肤酶失活、破坏蛋白质或细胞膜同上表面活性剂新洁尔灭杜灭酚0.050.10.050.1皮肤、器皿、桌面皮肤、金属蛋白质变性，损伤细胞膜同上酚类石碳酸来苏儿352地面、桌面、器皿皮肤、器皿蛋白质变性，损伤细胞膜同上酸类醋酸510ml/m3房间消毒（防呼吸道传染）破坏蛋白质与细胞膜重金属类升汞红汞0.050.12器皿皮肤作用蛋白质巯基同上现在学习的是第9页，共45页二、柠檬酸发酵培养基灭菌 培养基灭菌可分为实消和连消两种。v分批灭菌（实消）分批灭菌（实消）：将培养基置于反应器中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后维持一定时间，再冷却到发酵温度的过程称为分批灭菌。特点：无需专一灭菌设备，操

6、作简单，大容量发酵罐升降温时间长，营养成分易遭到破坏，高峰蒸汽负荷大，发酵罐利用率低，耗热量大。适用于固体培养基、小型发酵罐的液体培养基、容易产生泡沫的培养基的消毒灭菌。现在学习的是第10页，共45页v连续灭菌（连消）连续灭菌（连消）：将培养基在罐外连续进行加热、维持和冷却，最后进入到反应器的灭菌方法称为连续灭菌。特点特点：需要专门的灭菌设备，高温瞬间灭菌，能使培养基营养成分的破坏减小到最低程度，高峰蒸汽负荷低且均衡，发酵罐利用率高，耗热量小、灭菌质量好。适用于大容量发酵罐和连续自控操作。具体操作可参考喷射液化工艺，连消之前要进行空罐灭菌。现在学习的是第11页，共45页连续灭菌工艺流程连续灭菌

7、工艺流程现在学习的是第12页，共45页第二节第二节 无菌空气的制备无菌空气的制备 柠檬酸深层发酵时利用溶解于溶液中的氧，其来源则是通过压缩机提供的压缩空气。自然界的空气是带尘和细菌的空气，且通过压缩机压缩和管道疏通，增加了水、油污、金属屑等杂物，因此进入发酵罐的空气，必须是通过适当方法处理后的干净、无菌空气。目前柠檬酸发酵采用介质过滤介质过滤制备无菌空气。现在学习的是第13页，共45页一、空气中微生物的分布情况 存在于空气中的微生物主要有细菌、细菌芽孢、霉菌孢子、霉菌、酵母和病毒粒子。微生物一般是附着在空气中的尘粒上。因此除去空气中的尘埃和水、汽等，也即除去空气中存在的各种微生物。空气中微生物

8、的数量随环境、气候诸因子而变化。一般认为空气中微生物含量约在103 104个/m3。现在学习的是第14页，共45页二、二、柠柠檬酸檬酸发发酵酵对对无菌空气的无菌空气的质质量要求量要求v “无菌空气无菌空气”是指通过净化处理使空气中含菌量降低到一定极限，因而能控制发酵污染至极小机率的空气。v 发酵的生产菌种和产品不同，对无菌空气的质量要求也稍有差异。现在学习的是第15页，共45页柠檬酸发酵可以不考虑噬菌体的危害问题。深层发酵对培养基灭菌和无菌空气的除菌要求，都是按照染菌机率为10-3的依据来设计。因为一般细菌繁殖一代只需2030min，若有一个细菌进入发酵罐，15h后可繁殖109个/ml,这足以

9、使发酵受到严重影响。黑曲霉生长迅速，正常条件下很快进入产酸期，使培养基pH下降，增强了抗污染能力，按上述常规要求设计所得到的无菌空气，可以满足柠檬酸发酵要求。现在学习的是第16页，共45页三、空气预处理流程三、空气预处理流程 空气净化处理的目的是除菌，然而目前使用的过滤介质必须在干燥条件下工作才能保证除菌效率，因此空气需要预处理以除去油污、水和较大的颗粒。空气净化流程的选择应环绕着提高除菌效率进行。现在学习的是第17页，共45页 提高除菌效率的主要措施：v减少进口空气的含菌数，其方法为：加强卫生场地的卫生管理，减少生产环境中含菌数；正确选择进风口，一般空压站应在生产车间的上风向；提高进口空气位

10、置；加强压缩前预处理。v设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。v设计合理的空气与处理设备。v降低进入空气过滤器的空气的相对湿度，保证过滤介质在干燥状态下工作，其方法是：采用无油空压机；加强空气冷却和去油、水；提高进入过滤器的空气温度，降低相对湿度。现在学习的是第18页，共45页 以上措施的具体做法应根据具体情况而定：1、将压缩空气冷却至露点以上，使其相对湿度为6070%以下，然后进入过滤器（图一）。这种流程适用于北方和内陆气候干燥地区。此流程简单，但要求进口空气的绝对湿含量不能太高，否则冷却后的压缩空气相对湿度为60%时的温度就会很高。（图一）将空气冷却至露点以上的流程 1、高

11、空采风；2、粗过滤器；3、空压机；4、冷却器；5、贮气罐；6、空气总过滤器；7、空气分过滤器现在学习的是第19页，共45页2、将压缩空气冷却至露点以下，析出部分水分，然后升温使相对湿度下降至60%左右，再进入空气过滤器。根据气候情况有一次冷却一次析水流程（图二）和二次冷却二次析水流程（图三）。这两种流程适用于空气中湿含量较大的南方沿海地区。现在学习的是第20页，共45页 (图二)一次冷却一次析水的的空气净化流程1、高空采风；2、粗过滤器；3、空压机；4、冷却器；5.6、析水器 7、贮气罐；8、加热器；9、总过滤器；10、分过滤器现在学习的是第21页，共45页 （图三）二次冷却二次析水的空气预处

12、理流程1、高空采风；2、粗过滤器；3、空压机；4.6、冷却器；5.7、析水器 8、贮气罐；9、加热器；10、空气总过滤器；11、空气分过滤器现在学习的是第22页，共45页3、利用压缩后的热空气与冷却后的冷空气进行热交换，使冷却空气温度升高，降低相对湿度（图四）。此流程对热能利用较合理，热交换器还兼做贮气罐，但由于气-气换热的传热系数很小，加热面积要足够大。现在学习的是第23页，共45页 （图四）利用热空气加热冷空气的流程 1、高空采风；2、粗过滤器；3、空压机；4、热交换器；5、冷却器；6.7、析水器；8、总过滤器；9、分过滤器现在学习的是第24页，共45页4、将压缩后的空气部分冷却析水，另一

13、部分的热空气直接与冷却析水后的空气混合，然后进入空气过滤器（图五）。此流程适用于空气的湿含量中等的地区。其对热能的利用合理，但操作要求高，要根据不同气候调节两部分空气的混合比。现在学习的是第25页，共45页 （图五）冷热空气直接混合的空气净化流程 1、高空采风；2、粗过滤器；3、空压机；4、冷却器；5.6、析水器；7、贮气罐；8、总过滤器；9、分过滤器现在学习的是第26页，共45页四、介质过滤空气除尘原理四、介质过滤空气除尘原理 用介质从空气中除菌的方法可分为两大类：v同从液相中除去固相颗粒一样，所用过滤介质的孔径小于微粒的直径，此法过滤效果可达100%的完全除菌程度，但很不经济，不适用于处理

14、发酵工业用的大量无菌空气。现在学习的是第27页，共45页各种纤维介质过滤器和金属、塑料、石墨、陶瓷等粉末烧结而成的微孔过滤器。理论上纤维介质过滤不能达到绝对除菌效果，因为纤维形成的网格空隙远大于空气中尘埃的粒径。但是纤维介质是由许许多多的纤维充填在一起，组成了一个有一定厚度而又孔道曲折的多层有一定厚度而又孔道曲折的多层截留结构。截留结构。因此，当尘粒穿过介质层时经多次阻挡而被截留，从而达到发酵工业所需无菌空气的质量标准。优点：结构简单、体积小、压力降小和运转费用低等。现在学习的是第28页，共45页五、柠檬酸发酵常用空气过滤器 发酵工业用的空气过滤器有两种组合：一种是由一台总过滤器与多台发酵罐的

15、分过滤器组合；另一种是各发酵罐单独设置预过滤器和精过滤器的组合。显然后者优于前者，特别在空气系统发生污染事故时，可分别处理而不影响生产。现在学习的是第29页，共45页v棉花过滤器常称为总过滤器。过滤介质通常采用未脱脂的棉花和棒状活性炭。v超细玻璃纤维纸过滤器，多作为分过滤器使用。一般采用质量较好的无碱玻璃纤维制成的纸。v维尼纶纤维过滤器：结构简单，过滤效果好，机械强度高，压力降小，使用寿命长，操作方便。但不耐热，故不能灭菌。使用前先用40的热空气对滤层吹10h以上。现在学习的是第30页，共45页六、无菌空气制备系统流程和要求六、无菌空气制备系统流程和要求v空气净化系统的设备功能功能，在过滤器之

16、前是脱油、除湿，保证洁净干燥的空气进入过滤器滤层之后除去了空气的杂菌。只有保持滤层的干燥和完好，才能达到除菌的目的，因此除湿、脱油设备是不可缺少的。现在学习的是第31页，共45页两级冷却、加热除菌流程示意图1.1.粗过滤器粗过滤器 2.2.压缩机压缩机 3.3.贮罐贮罐 4 4、6.6.冷却罐冷却罐 5.5.旋风分离器旋风分离器 7.7.丝网分离器丝网分离器 8.8.加热器加热器 9.9.过滤器过滤器现在学习的是第32页，共45页七、无菌空气的检查肉汤培养基检查法肉汤培养基检查法：在分过滤器空气出口端的管道支管的小考克上用橡皮管与一只装有250ml肉汤培养基的三角瓶连接，少许打开小考克使空气进

17、入肉汤培养基内，连续数小时或十几小时，小心卸下橡皮管，用无菌纸包扎好管的末端，置于37培养箱培养16h，若出现浑浊，表明空气中有杂菌。此法所测定的空气体积与进入发酵罐空气体积之比悬殊太大，兼之生物测定操作繁琐，测定结果较难反映出真实情况。现在学习的是第33页，共45页检查无菌空气装置示意图检查无菌空气装置示意图现在学习的是第34页，共45页光学检查法光学检查法：此法原理是利用微粒对光线的散射作用来测量空气中粒子大小和数量。常用的检测仪器为Y09-1型粒子计数器。测量时以一定速度将试样空气通过检测区，同时用聚光透镜将光源来的光线聚成强烈光束射入检测区，由于空气受到光线强烈照射，空气中的微粒把光线

18、散射出去，由聚光透镜将散射光聚集投入光电倍增管，将光转换成电讯号，经自动计数器计算出粒子的大小与数量。现在学习的是第35页，共45页第三节、第三节、柠檬酸深层发酵染菌分析及防治柠檬酸深层发酵染菌分析及防治（一）柠檬酸发酵常见的污染菌（一）柠檬酸发酵常见的污染菌 柠檬酸发酵初期，即发酵液pH3.0时，常见的污染菌有细菌、酵母、曲霉及青霉菌等，随着发酵液pH的下降，大多数细菌和曲霉菌被抑制或自溶，而耐酸性的酵母和青霉菌等则继续繁殖，重者导致发酵倒罐，轻者产酸很低且粘度增加，提取困难。现在学习的是第36页，共45页常见的污染菌有以下几种：A、细菌：产气杆菌、琥珀酸菌、荧光杆菌等；B、酵母：酿酒醭酵母

19、、葡萄酒醭酵母、清酒酵母等；C、霉菌：米曲霉、泡盛酒曲霉、皱褐青霉等。现在学习的是第37页，共45页（二）污染菌的检查（二）污染菌的检查1、感官检查 大部分被污染的发酵液可以从发酵液的异常情况来检查，如色度、异味、变稠或稀、生产菌球体散开。菌丝变形、产酸不正常、而糖却大量消耗等。借助显微镜可以检出细菌、酵母菌、曲霉、青霉的菌体形态。现在学习的是第38页，共45页2、平板划线检查、平板划线检查 凡是认为染菌罐，或发酵不正常而未确准的染菌罐，都必须做平板划线检查，以便最终确认是否染菌，染什么菌，作为生产者采取抢救、补救以及消除隐患等措施的依据。如细菌污染可用肉汁琼脂平板或肉汤培养检出。酵母、曲霉、

20、青霉污染，可用米曲汁或麦芽汁琼脂平板划线检出。为了及时处理染菌事故，生产上以感官为主，平板划线则是指导制定防止染菌措施的主要依据。现在学习的是第39页，共45页3、无菌样和对照样、无菌样和对照样 培养基灭菌后的无菌取样，斜面菌种、麸曲菌种、二级菌种以及接种后的发酵液摇瓶对照样是发酵管理工作中一项必需的重要工作。发酵染菌有前期和后期之分，有操作不慎和菌种污染之别等。而无菌样和对照样是查找原因、分清责任、有的放矢、采取措施的重要依据之一。现在学习的是第40页，共45页（三）染菌的原因分析（三）染菌的原因分析1、染菌的一般规律、染菌的一般规律发酵染菌的一般规律发酵染菌的一般规律现在学习的是第41页，

21、共45页2、染菌的主要因素、染菌的主要因素 发酵工业染菌的主要原因不外乎环境恶化、空气净化系统失效、设备及管道阀门穿孔或渗漏、种子带菌、操作不当和管理不严等方面。可以从染菌期来判断染菌的原因：A.早期染菌：染菌因素可能是种子带菌、培养基灭菌不彻底、接种操作不当，发酵罐内有死角或严重渗漏、空气净化系统严重失效，即杂菌从发酵开始就进入或遗留在发酵培养基中。B.中、后期染菌：多数是由于空气净化不良、培养基灭菌时发生“瀑料”、培养时泡沫过多满至顶盖、轴封泄漏、设备渗漏、流量计安装部位不当、有污染物落进罐内、取样操作不当等。现在学习的是第42页，共45页（四）防、治染菌措施（四）防、治染菌措施防止染菌措

22、施防止染菌措施1、严格无菌操作制度严格无菌操作制度：所有从事发酵工作者，必须经过严格的无菌操作培训和始终贯彻无菌操作制度；2、加强环境卫生管理加强环境卫生管理：发酵车间和菌种培养室内外环境，必须保持整洁，要定期清扫和消毒。车间周围不得堆放废弃物。有异味或易飞扬的物料的贮存，应远离发酵车间和菌种室；3、重视设备管理，保持高的设备完好率重视设备管理，保持高的设备完好率:发酵工业由于设备系统引起染菌的概率较高，因此要定期检查，加强三级保护维修制度；现在学习的是第43页，共45页4、保证无菌空气质量保证无菌空气质量：应定期检查总过滤器的过滤效率。棉花的填装、灭菌和使用，应严格按标准执行。防止超负荷使用

23、空气过滤器，要科学地设计和配置空气净化系统。发酵用空气应无菌、干燥且压力稳定；5、严格保证菌种质量：严格保证菌种质量：各级菌种必须在经过严格无菌检查和摇瓶验证后供生产使用。无菌室必须定期消毒，消毒剂要细菌、霉菌兼顾。摇瓶间不能堆放杂物。斜面、培养皿、麸曲三角瓶等工器具的灭菌要彻底。按规定使用超净工作台，做移种、分纯、选育、检测等无菌操作。现在学习的是第44页，共45页抢救染菌的措施抢救染菌的措施1、细菌污染醪的处理、细菌污染醪的处理 发酵前期污染细菌，可加大通风量使发酵转入产酸阶段，当pH下降至3.0一下时，细菌可被抑止或自溶死亡（含米曲霉菌）。发现较迟，染菌较重，立即加柠檬酸母液或硫酸等将发酵液pH调节到3.0再加大通风量。如细菌占绝对优势，本菌较少，先调节pH到4.0-4.5后，重新按常规消毒。再一级接种，或与正常发酵罐相互混合继续发酵。现在学习的是第45页，共45页