现代生物显微技术的现状与发展趋势.pdf

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1、_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 1)_ _ 2)_ _ _ 1)( 1) 安 徽 省 立 医 院 口 腔 科, 合 肥230001; 2) 安 徽 大 学 生 命 科 学 学 院) _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ , _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ , _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ , _ _ _ _ _ _ _ _

2、 _ _ _ _ _ _ _ _ 。 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ , _ _ _ _ _ _ _ _ , _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。 _ _ _ _ _ _ _ ; _ _ ; _ _ ; _ _ _ _ _ _ _ _ Q 336 _ _ _ _ _ A _ _ _ _ 051 7- 6611(2 003)02- 02 43- 03 1 _ _ _ _ _ _ 1 .1 _ _ _ _ _ _ _ (T ra n sp a

3、r en t Ele ctro n M icro s c o p e , T EM ) 1926 年H Bu sc h 发 表 了 关 于 运 动 电 子 在 轴 对 称 磁 场 中 的 运 动 轨 迹 的 实 验 结 果 。 实 验 结 果 表 明, 轴 对 称 磁 场 可 会 聚 电 子 束, 且 这 种 电 子 光 学 系 统 服 从 于 几 何 光 学 定 律 。 在 此 基 础 上,R u s k a 等 人 根 据 电 子 光 学 与 光 学 的 相 似 性 和 光 学 显 微 镜 的 结 构 研 制 出 了 世 界 上 第1 台 电 子 显 微 镜 。 其 与 普 通 光 学 显

4、 微 镜 的 主 要 区 别 是: 用 电 子 束 代 替 光 束, 用 电 磁 透 镜 代 替 玻 璃 透 镜 。 由 于 使 用 了 波 长 极 短 的 电 子 波, 故 能 获 得 极 高 的 分 辨 率 1 。 目 前 透 射 电 镜 的 分 辨 率 已 经 达 到 了0.2n m 的 水 平 。 高 压 高 分 辨 率 透 射 电 镜 已 接 近0.1n m 2 。 半 个 世 纪 以 来, 电 镜 在 生 物 学 、 医 学 、 材 料 学 及 其 他 学 科 方 面 有 着 广 泛 应 用, 尤 其 在 纳 米 材 料 的 微 结 构 分 析 及 与 其 他 微 束 分 析 相

5、配 合 的 技 术 方 面 占 有 重 要 的 地 位, 促 进 了 科 学 的 发 展 。 其 发 明 者R u sk a 因 此 获 得1986 年N o b e l 物 理 学 奖 。 虽 然 透 射 电 镜 极 大 地 提 高 了 人 们 对 微 观 世 界 的 观 察 能 力, 但 由 于 高 速 电 子 对 样 品 的 穿 透 能 力 有 限, 故 必 须 制 备 超 薄( 几 百 ! 到 几 十 ! ) 的 电 镜 样 品, 且 难 以 从 电 镜 上 直 接 得 出 样 品 的 三 维 结 构 。 样 品 制 备 过 程 有 时 还 会 带 来 一 些 人 为 的 效 应, 使

6、 观 察 图 像 失 真 。 特 别 是 生 物 样 品 大 部 分 是 以 碳 氢 氧 为 主 的 轻 元 素, 对 电 子 的 散 射 能 力 很 弱, 而 经 重 金 属 染 色 等 技 术 增 加 衬 度 对 比 度 后, 样 品 组 织 表 现 得 比 较 粗 糙, 难 以 分 出 分 辨 率 优 于20 ! 的 电 镜 图 像 。 1 .2 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 生 物 体 的 功 能 与 分 子 的 三 维 结 构 及 其 排 列 情 况 密 切 相 关 。 一 张 显 微 像 只 是 一 个 二 维 投 影, 用 几 张 对 应 样 品 不 同 角 度

7、 的 二 维 投 影 像 组 合 成 该 样 品 的 一 个 三 维 模 型 的 技 术 称 为 物 体 的 三 维 重 建 。 电 镜 中 的 此 项 工 作 要 求 有 一 个 很 好 的 同 心 倾 动 样 品 台 。 对 于 待 分 析 的 样 品, 从 不 同 倾 度 拍 摄 若 干 张 显 微 像, 再 借 助 电 子 计 算 机, 用 数 值 计 算 法 处 理(Fo u rie r 变 换 等) 这 些 强 度 值, 就 能 给 出 一 个 重 建 的 三 维 结 构 3 。 _ _ _ _ : _ _ _ (1963- ), _ , _ _ _ _ _ _ _ , _ _ ,

8、 _ _ _ _ , _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 。 _ _ _ _ :2002 2 12 2 11 1 .3 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 3 在 电 镜(T EM ) 中, 利 用 特 殊 的 电 子 束 点 源 照 射 有 一 定 厚 度 分 布 的 样 品, 并 使 直 接 入 射 波( 参 数 波) 和 样 品 的 散 射 波 相 互 干 涉 形 成 一 种 图 像, 这 就 是 全 息 像(h o lo g ra m ) 。 把 这 种 显 影 后 的 全 息 底 片 放 到 一 个 光 学 装 置 中 重 现, 即 可 呈

9、 现 一 幅 逼 真 的 立 体 图 像 。 其 显 微 全 息 成 像 的 原 理 是 根 据F.N .L e ith 和 J.U p a tn iek s 1965 年 描 述 的 一 种 技 术 4 , 即 使 干 涉 光 的 球 形 波 前 的 半 径 在 再 现 时 增 大, 这 样 再 现 时 的 像 就 放 大 了 。 一 般 记 录 时 用 短 波 长 的 光, 再 现 时 用 长 波 长 的 光, 则 可 放 大s 倍(s 等 于 再 现 光 与 记 录 光 波 长 之 比) 。 假 如 记 录 时 用X 线, 重 建 时 用 红 外 线, 则 放 大 可 达600 倍; 如

10、 记 录 时 用 电 子 束 源, 而 电 子 显 微 镜 的 电 子 束 波 长 比 可 见 光 波 短 十 数 万 倍, 则 分 辨 率 可 达 到5n m (2 5n m ) 以 下 。 由 于 其 方 法 比 较 复 杂, 故 目 前 未 能 广 泛 应 用 。 2 _ _ _ _ (S c a n n in g Ele c tro n M icro so o p e ,S EM ) 1935 年K n o ll 就 提 出 利 用 一 个 扫 描 电 子 束 从 固 定 表 面 获 得 图 像 的 原 理 。1965 年 实 用 性 的 扫 描 电 镜 才 被 推 出 。 它 是 利

11、 用 经 磁 透 镜 会 聚 成 的 极 狭 窄 的 电 子 束( 称 为: 电 子 探 针e le c tro n p ro b e ) 去 扫 描 样 品, 即 电 子 束 在 样 品 上 作 光 栅 运 动, 电 子 束 与 样 品 交 互 作 用 后 会 发 出 各 种 信 号, 利 用 从 样 品 表 面 收 集 到 的 信 号 形 成 图 像 。 因 此 相 当 于 一 个 反 射 式 的 显 微 镜 。 扫 描 电 镜 的 特 点: 景 深 长, 图 像 富 有 立 体 感, 因 而 对 于 复 杂 而 粗 糙 的 样 品 表 面, 仍 然 可 得 到 清 晰 像 集 的 图 像

12、, 使 易 于 分 析 。 图 像 放 大 倍 率 连 续 可 变 范 围 大, 可 从 几 倍 连 续 变 化 到 几 十 万 倍,2 次 电 子 像 的 分 辨 率 可 达 到50 n m , 甚 至 更 佳 。 样 品 制 备 技 术 简 单, 不 必 做 超 薄 处 理 。 由 电 子 辐 射 引 起 的 样 品 损 伤 和 污 染 也 较 小 。 样 品 能 做 得 很 大, 如 直 径 可 达10cm 以 上, 可 扩 展 性 较 强 。 在 扫 描 电 镜 装 配 上 各 种 附 件 后, 还 可 获 得 高 分 辨 率 的 样 品 表 面 形 貌, 提 供 通 道 图 样( 确

13、 定 晶 体 取 向) 任 何 部 位 的 元 素 分 析 和 元 素 分 布 图, 样 品 反 射 及 透 射 式 的 荧 光 图 像 等 功 能 。 作 用 的 信 号 主 要 有:2 次 电 子, 背 散 射 电 子, 特 征 X 线, 阴 极 荧 光 和 俄 歇 电 子 。 现 今S EM 正 朝 着 探 头 的 多 样 化( 如 环 境2 次 电 子 探 头, 气 体2 次 电 子 探 头 等) , 样 品 环 境 的 要 求 更 低( 所 谓 环 境 扫 描 电 子 显 微 镜En v irn o m e n 2 _ _ _ _ _ _ ,2003,31(2):243- 245 J

14、 ou rn a l o f An h u i Ag ricu ltu ral S c ien ce sta l,S EM ), 信 噪 比 及 图 像 质 量 进 一 步 提 高 的 方 向 发 展 5,6 。 3 _ _ _ _ _ _ _ 亦 称 扫 描 近 场 光 学 显 微 镜(S c a n n in g n e a r2 fie ld o p tic a l m icro s c o p e ,S N O M ) 和 近 场 扫 描 光 学 显 微 镜(N e ar2 fie ld s c a n 2 n in g o p tic a l m ic ro sc o p e ,N

15、S O M ) 。1928 年 英 国 的E.H .S y n g e 提 出 了 一 个 新 型 光 学 显 微 镜 的 构 想 。 这 是 人 类 历 史 上 第 1 次 突 破 分 辨 率 极 限 的 新 型 显 微 镜 的 构 想; 但 由 于 受 当 时 技 术 条 件 的 限 制, 且 随 着 时 间 的 推 移, 他 的 构 想 未 变 成 现 实, 并 被 遗 忘 。 直 到1981 年 扫 描 隧 道 显 微 镜 发 明2 年 后 的1984 年, 发 明 扫 描 隧 道 显 微 镜 的IBM 苏 黎 世 研 究 室 P o h l D.W 等 在 设 法 解 决 了 申 奇

16、 提 出 的 技 术 困 难 后, 终 于 研 制 成 了 被 他 称 为/ 光 学 听 诊 器0 (O p tic a l steth o s c o p e ) 的 扫 描 近 场 光 学 显 微 镜 。 它 的 分 辨 极 限 达1/20 波 长, 且 随 着 光 学 探 针 和 探 针 与 样 品 的 距 离 探 测 技 术 的 改 进, 其 分 辨 率 已 达 到 了18n m , 并 继 续 向 更 高 的 分 辨 率 发 展 。 在 非 光 学 显 微 镜 的 分 辨 率 达 到 原 子 级(0.1n m ) 的 水 平 时, 提 高 光 学 显 微 镜 的 分 辨 率 以 及S

17、 N O M 的 出 现 仍 有 十 分 重 大 的 意 义 。 首 先, 与 用 电 子 束 进 行 成 像 的 扫 描 电 子 显 微 镜 和 扫 描 隧 道 显 微 镜 不 同, 近 场 光 学 显 微 镜 用 光 束( 光 子) 成 像 。 光 子 与 电 子 不 同, 它 是 波 色 子, 没 有 质 量, 电 中 性, 因 而 容 易 聚 焦 和 改 变 偏 振, 可 以 在 空 气 和 介 质 中 传 播 。 除 因 光 致 效 应( 如 漂 白 效 应) 和 光 吸 收 产 出 的 热 损 伤 外, 对 材 料 即 使 是 生 物 样 品 一 般 也 不 易 产 生 直 接 的

18、 损 伤, 这 是 其 一 大 特 点 和 优 点 。 其 次, 光 学 显 微 镜 对 样 品 限 制 极 少, 它 可 以 是 非 导 体 或 液 体, 可 以 是 有 生 命 的 或 无 生 命 的, 可 以 是 透 明 的 也 可 以 是 不 透 明 的, 可 以 是 静 态 亦 可 以 是 动 态 观 察 样 品 。 第3, 对 样 品 环 境 亦 无 特 殊 要 求, 可 以 是 常 温 常 压, 也 可 以 是 非 常 温 常 压 的 环 境 。 而 非 光 学 显 微 镜 或 多 或 少 地 存 在 以 下 一 些 弱 点: 对 观 察 样 品 限 制 较 多, 例 如 样 品

19、 必 须 是 导 体, 不 能 是 非 导 体 和 溶 液 等; 对 样 品 环 境 要 求 严 格, 有 的 要 求 高 真 空 甚 至 超 高 真 空; 而 且, 它 们 都 会 或 多 或 少 地 损 害 观 察 的 对 象 。 由 于S N O S 具 有 许 多 其 他 非 光 学 显 微 镜 所 不 具 有 的 独 特 性 质, 在 被 单 纯 成 像 这 种 所 谓 的 被 动 性 应 用 方 面, 受 微 结 构 材 料 尤 其 是 生 物 和 医 学 工 作 者 的 重 视, 如 单 分 子 成 像, 单 分 子 膜 成 像, 生 物 样 品 的 成 像 等 。 而 且 近

20、场 光 学 显 微 镜 可 以 开 展 扫 描 电 镜 和 扫 描 隧 道 显 微 镜 所 没 有 的 许 多 主 动 性 应 用, 如 利 用 近 场 光 学 显 微 镜, 对 来 自 样 品 的 光 吸 收 、 光 发 射 、 光 散 射 以 及 包 括 谱 线 成 像 在 内 的 近 场 光 谱 学 研 究 等 2,7,8 。 4 X _ _ _ _ _ _ 用X 射 线 进 行 显 微 摄 像 的 原 理 就 是 利 用 了 光 学 显 微 镜 的 优 势 以 及X 射 线 较 短 的 波 长 。 此 在 纳 米 尺 寸 范 围 内 具 有 很 高 的 横 向 分 辨 率, 目 前 已

21、 达 到30n m , 且 正 在 向 样 品 更 高 的 分 辨 率(20 、 10n m ) , 以 及 降 低X 射 线 束 对 目 标 的 损 坏 程 度 方 向 努 力 。X 射 线 显 微 技 术 现 在 主 要 用 于 生 物 细 胞 成 像 以 及 工 业 产 品 的 纳 米 测 量 2 。 5 _ _ _ _ _ _ ( S c a n n in g P r o b e M i c r o s c o p ic T e c h 2 n o lo s y ) 5 . 1 _ _ _ _ _ _ _ ( S c a n n in g T u n n e lin g M ic r

22、o s c o p e , S T M ) 1982 年IBM 公 司 位 于 苏 黎 世 的 实 验 室 的G erd Bin n ig 和H e in ric h R o h re r 及 其 同 事 在 研 究 真 空 超 导 隧 道 效 应 后 受 到 物 理 学 家 关 于/ 形 貌 仪0 文 章 的 启 发, 利 用 驱 动 探 针 在 样 品 表 面 扫 描 的 原 理 方 法 研 制 成 功 了 世 界 上 第1 台 扫 描 隧 道 显 微 镜 。 它 的 出 现, 使 人 类 第1 次 能 够 实 时 地 观 察 并 且 可 以 操 纵 单 个 原 子 在 物 质 表 面 的

23、 排 列 状 态 和 与 表 面 电 子 行 为 有 关 的 物 理 、 化 学 性 质, 在 表 面 科 学 、 材 料 科 学 、 生 命 科 学 等 领 域 的 研 究 中 有 着 十 分 重 大 的 意 义 和 广 阔 的 应 用 前 景, 被 公 认 为20 世 纪80 年 代 世 界 十 大 科 技 成 就 之 一,G e rd Bin n ig 和H e in r ic h R o h r er 也 因 此 获 得 了 1986 年 的N ob e l 物 理 学 奖 。S T M 具 有 惊 人 的 分 辨 本 领, 其 水 平 分 辨 率 小 于0.1n m , 垂 直 分

24、辨 率 小 于0.001n m , 具 有 原 子 级 的 分 辨 率 2 。 其 基 本 工 作 原 理 是 利 用 探 针 与 样 品 在 近 距 离( 小 于0.1n m ) 时, 由 于 二 者 存 在 电 位 差 而 产 生 相 互 作 用( 隧 道 电 流) , 隧 道 电 流 对 距 离 十 分 敏 感; 当 控 制 压 电 陶 瓷 探 针 在 样 品 表 面 时, 由 于 样 品 的 表 面 高 低 不 平 而 使 针 尖 与 样 品 之 间 的 距 离 发 生 变 化, 而 距 离 的 变 化 引 起 了 隧 道 电 流 的 变 化; 控 制 和 记 录 隧 道 电 流 的

25、变 化, 并 把 信 号 输 入 计 算 机 进 行 处 理, 就 可 得 到 样 品 表 面 高 分 辨 率 的 形 貌 图 像 。 S T M 作 为 新 型 的 显 微 工 具 与 前 述 的 各 种 显 微 镜 相 比 有 以 下 特 点 8 。 ST M 具 有 极 高 的 分 辨 率, 其 可 以 轻 易 地 看 到 原 子 。 S T M 可 以 得 到 实 时 的 、 真 实 的 样 品 表 面 的 高 分 辨 率 三 维 图 像 。 此 种 实 时 观 测 特 性 可 用 于 物 质 表 面 动 态 过 程 的 研 究 。 S T M 使 用 环 境 宽 松, 即 可 在 真

26、 空 工 作, 亦 可 在 大 气 、 常 温 甚 至 溶 液 中 使 用, 勿 需 特 殊 的 样 品 制 备 技 术, 且 在 探 测 过 程 中 对 样 品 无 损 伤 。 此 点 对 生 物 样 品 及 生 物 化 学 反 应 过 程 中 酶 的 催 化 机 理 的 研 究, 具 有 重 要 的 意 义 。 配 合 扫 描 隧 道 波 谱S T S (S c an n in g T u n e l2 in g S p e ctro sc o p y ) 可 以 得 到 有 关 样 品 表 面 结 构 的 信 息, 如 样 品 表 面 不 同 层 次 的 态 密 度, 表 面 电 子 阱

27、, 电 荷 密 度 波, 表 面 势 垒 的 变 化 和 能 隙 结 构 等 物 质 的 微 观 量 子 物 理 学 参 数 。 就 技 术 而 言, 扫 描 隧 道 显 微 镜, 同 其 他 后 继 发 展 起 来 的 扫 描 探 针 显 微 镜 一 样, 设 备 相 对 简 单, 价 格 亦 较 便 宜, 对 安 装 环 境 要 求 较 低, 对 样 品 无 特 殊 要 求(S T M 仅 要 求 样 品 必 须 为 导 体 或 半 导 体), 样 品 制 备 较 容 易, 探 测 快 速, 操 作 简 便, 日 常 维 护 和 运 行 费 用 低 廉 。 S T M 更 重 要 的 是

28、不 仅 能 够 得 到 物 质 表 面 的 原 子 图 像, 而 且 还 可 以 将 原 子 、 分 子 吸 住, 再 转 移 至 另 一 个 地 方 放 置, 即 对 原 子 和 分 子 进 行 操 纵 。 由 此 人 们 设 想 将 来 有 可 能 通 过 操 纵 原 子 、 分 子 来 随 心 所 欲 地 制 造 新 的 物 质 。 传 统 的 物 理 反 应 、 化 学 反 应 、 生 物 化 学 反 应 过 程 均 为 大 量 微 观 原 子 、 分 子 互 相 作 用 的 统 计 平 均 过 程 。 而S P M 的 产 生 为 探 测 单 个 原 子 交 互 作 用, 为 单 分 子 化 学 的 发 展 奠 定 了 基 础 。 以S T M 为 分 析 和 加 工 手 段 几 乎 贯 穿 着 全 部 纳 米 科 学, 其 在 当 今 方 兴 未 艾 的 纳 米 科 技 中 占 有 重 要 的 地 位 。 244 _ _ _ _ _ _ 2003 _