实验大肠杆菌培养和分离.ppt

《实验大肠杆菌培养和分离.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验大肠杆菌培养和分离.ppt（78页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、关于实验大肠杆菌的培养和分离第一张，PPT共七十八页，创作于2022年6月微生物包括哪五类：微生物包括哪五类：病毒病毒细菌细菌放线菌放线菌真菌真菌原生生物原生生物特点：特点：结构简单结构简单,形体微小形体微小.通常要用光学显微镜或电子通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般且体内一般不含有叶绿素不含有叶绿素.不能进行光合作用不能进行光合作用.原核生物界原核生物界 原生生物界原生生物界真菌界真菌界病毒界病毒界一、基础知识：(一)微生物第二张，PPT共七十八页，创作于2022年6月大肠杆菌（E.coli）分布：人和哺乳动物肠道，此

2、外还广泛分布于水、分布：人和哺乳动物肠道，此外还广泛分布于水、污水、污水、土壤、谷类、乳制品等当中。土壤、谷类、乳制品等当中。大肠杆菌在人体的大肠杆菌在人体的_中一般对人体无害，但任何中一般对人体无害，但任何大肠杆菌如果进入大肠杆菌如果进入_都会对人体产生危害。都会对人体产生危害。大肠杆菌是大肠杆菌是_工程中被广泛采用的工具。工程中被广泛采用的工具。肠道肠道泌尿系统泌尿系统基因基因革兰氏革兰氏_（填阴或阳）性菌（填阴或阳）性菌阴阴代谢类型：代谢类型：异养，兼性厌氧型异养，兼性厌氧型生长适宜温度：生长适宜温度：质粒、质粒、EcoREcoR限制酶、限制酶、E.coli-DNAE.coli-DNA连

3、接酶、连接酶、受体细胞受体细胞3737左右左右第三张，PPT共七十八页，创作于2022年6月大肠杆菌大肠杆菌酵母菌酵母菌放线菌放线菌 霉菌霉菌菌落：菌落：单个或少数细菌单个或少数细菌在在固体培固体培养基养基上大量生长繁殖时，所形成上大量生长繁殖时，所形成的肉眼可见的具有一定形态结构的肉眼可见的具有一定形态结构的的子细胞群体子细胞群体。不同微生物形成的菌落具有不同不同微生物形成的菌落具有不同的特征，的特征，是鉴定菌种的重要依据是鉴定菌种的重要依据。如菌落的大小、形状、边缘、光泽度、颜色、透明度等。如菌落的大小、形状、边缘、光泽度、颜色、透明度等。菌落的概念菌落的概念白色或乳白色，光滑白色或乳白色

4、，光滑大肠杆菌菌落：大肠杆菌菌落：第五张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽芽孢孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸例如，有的细菌的芽孢，煮沸3 3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌

5、成一个细菌.第六张，PPT共七十八页，创作于2022年6月一、基础知识：一、基础知识：（二）培养基（二）培养基 培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。（1 1）按物理状态分：）按物理状态分：固体培养基固体培养基和和液体培养基、半液体培养基、半固体培养基固体培养基。（2 2）按功能分：）按功能分：选择培养基选择培养基和和鉴别培养基鉴别培养基。（3 3）按成分分：）按成分分：天然培养基天然培养基和和合成培养基合成培养基。1.1.培养基的类型和用途培养基的类型和用途第七张，PPT共七十八

6、页，创作于2022年6月液体培养基：液体培养基：表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长第八张，PPT共七十八页，创作于2022年6月固体培养基：菌落，菌苔固体培养基：菌落，菌苔第九张，PPT共七十八页，创作于2022年6月半固体培养基：半固体培养基：无动力无动力 有动力有动力(弥散弥散)(是否运动是否运动)第十张，PPT共七十八页，创作于2022年6月选择培养基加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌分

7、离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞分离导入了目的基因的受体细胞 加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养核苷的培养基基:分离杂交瘤细胞分离杂交瘤细胞第十一张，PPT共七十八页，创作于2022年6月天然培养基有血清、血浆、天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。牛胚浸液）。优点：优点：营养成分丰富，营养成分丰富，培养效果好培养效果好缺点：缺点：来源受限来源受限;成分复成分复杂，影

8、响对某些实验杂，影响对某些实验产物的提取和实验结产物的提取和实验结果的分析果的分析;易发生支原体易发生支原体污染污染;根据细胞生存所需物质的种类根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。和数量，用人工方法模拟合成的。合成培养基主要成分是氨基合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。盐和其它一些辅助物质。优点：优点：标准化生产，组分标准化生产，组分和含量相对固定和含量相对固定;成本低成本低 缺点：缺点：缺少某些成分，不能缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。完全满足体外细胞生长需要。合成培养基合成培养基:天然培养基：

9、天然培养基：第十二张，PPT共七十八页，创作于2022年6月血清中含有：血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）蛋白等）多种金属离子；多种金属离子；激素；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。球蛋白、胶原等。各种生长因子各种生长因子转移蛋白转移蛋白不明成分不明成分 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。第十三张，PPT共七十八页，创作于2022年6月培养基的用途培养基的用

10、途液体培养基：增菌，液体培养基：增菌，常用于发酵工业常用于发酵工业固体培养基：固体培养基：增菌，菌种保存及分离纯化、鉴定菌增菌，菌种保存及分离纯化、鉴定菌落、活菌计数等落、活菌计数等半固体培养基：动力检测，保种半固体培养基：动力检测，保种第十四张，PPT共七十八页，创作于2022年6月不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方调节调节pHpH2 2、成分、成分水、碳源、氮源、水、碳源、氮源、无机盐、生长因子无机盐、生长因子(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶如维生素

11、、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)真菌：真菌：5 56 6 细菌：细菌：6.5 6.5 7.5 7.5 有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压第十五张，PPT共七十八页，创作于2022年6月1.1.无菌操作的概念无菌操作的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止_污染的方法。污染的方法。四、无菌操作四、无菌操作_必须无菌、必须无菌、_也必须要无菌、也必须要无菌、_时不能带入其他杂菌时不能带入其他杂菌主要包括：主要包括：杂菌杂菌2.2.消毒与灭菌消毒与灭菌的概念及两者的区别的概念及两者的区别 消毒：消毒：使用使用

12、较温和理化因素较温和理化因素，仅杀死物体表面或内，仅杀死物体表面或内部的部的一部分一部分对人体有害的微生物的过程。对人体有害的微生物的过程。不能杀死不能杀死芽孢和孢子。芽孢和孢子。灭菌：灭菌：使用使用强烈的理化因素强烈的理化因素消灭物体内外消灭物体内外所有所有微生微生物，包括芽孢和孢子。物，包括芽孢和孢子。各种器具各种器具培养基培养基转移菌种转移菌种第十六张，PPT共七十八页，创作于2022年6月比较消毒与灭菌较为温和较为温和部分生活状态部分生活状态的微生物的微生物不能不能能能全部微生物全部微生物强烈强烈第十七张，PPT共七十八页，创作于2022年6月高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）（湿热

13、灭菌）洒精灯灼烧灭菌洒精灯灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌（1 1）灭菌方法：）灭菌方法：3 3、常用的灭菌和消毒的方法、常用的灭菌和消毒的方法培养基、无菌水、培养基、无菌水、各种耐高温的玻璃金属器具各种耐高温的玻璃金属器具100kPa100kPa、121 121 下维持下维持15-30min15-30min需要保持干燥需要保持干燥耐高温的玻璃金属器皿耐高温的玻璃金属器皿160-170 160-170 下加热下加热1-2h1-2h接种环等金属器具接种环等金属器具第十八张，PPT共七十八页，创作于2022年6月第十九张，PPT共七十八页，创作于2022年6月1 1、煮沸消毒法煮沸消毒法:100100煮沸

14、煮沸5-6min5-6min2 2、巴氏消毒法：、巴氏消毒法：70-75 70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min3 3、化学药剂消毒法、化学药剂消毒法:用用75%75%酒精、新洁尔灭等酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒进行皮肤消毒;氯气消毒水源氯气消毒水源4 4、紫外线消毒、紫外线消毒(2)消毒的方法：消毒的方法：3.3.常用的消毒与灭菌的方法常用的消毒与灭菌的方法第二十张，PPT共七十八页，创作于2022年6月请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。如果需要，请选择合适的方法。（

15、1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手答：（答：（1 1）、（）、（2 2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3 3）需要消毒。）需要消毒。第二十一张，PPT共七十八页，创作于2022年6月（一）制备（一）制备LBLB培养基（通用的细菌培养基）培养基（通用的细菌培养基）1 1、配方：蛋白胨、配方：蛋白胨0.50.5克，酵母提取物克，酵母提取物0.250.25克，克，氯化钠氯化钠0.50.5克，水克，水50ml50ml（配固体培养基再加琼脂（配固体培养基再加琼脂1 1克）克）溶解溶解计算

16、称量计算称量调调pHpH分装分装加塞，包扎加塞，包扎2 2、流程、流程二二 操作步骤操作步骤灭菌灭菌倒平板倒平板第二十二张，PPT共七十八页，创作于2022年6月分装：分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用基转移到三角瓶或试管中时必须用_。加塞加塞：试管用塑料盖或：试管用塑料盖或_；三角瓶口用；三角瓶口用_或或_封口封口,再用再用_或报纸封口。或报纸封口。包扎：包扎：用用_或报纸或报纸三角漏斗三角漏斗棉花塞棉花塞封口膜封口膜6 6层纱布层纱布牛皮纸牛皮纸牛皮纸牛皮纸高压蒸气灭菌法高压蒸气灭菌法灭菌灭菌1

17、1）加水：）加水：2 2）装锅：）装锅：向外层锅内加入适量的水，加水的要求是向外层锅内加入适量的水，加水的要求是_._.物品放置的要求物品放置的要求_：加盖：将盖上的加盖：将盖上的排气软管排气软管插入内层灭菌桶的插入内层灭菌桶的_内。内。再以再以_方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。栓松紧一致，勿使漏气。不触及内胆不触及内胆整齐、稳定、留出空隙整齐、稳定、留出空隙排气槽排气槽两两对称两两对称第二十三张，PPT共七十八页，创作于2022年6月3 3）加热排气：）加热排气：4 4）保温保压：）保温保压：5 5）出锅：）出锅：打开排气阀，使水沸腾以排

18、除锅内的打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的_。_后，关上排气阀。后，关上排气阀。当锅内压力升到当锅内压力升到_kg/cm_kg/cm2 2时，控制时，控制热源，维持压力至热源，维持压力至_min_min。切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至力降至_时，打开时，打开_，旋松螺栓，打开，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。盖子，取出灭菌物品。冷空气冷空气待冷空气完全排尽待冷空气完全排尽0 01 11515排气阀排气阀否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而可能使容器

19、内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。发生污染，甚至使容器爆炸。灭菌后，通常将实验用具放入灭菌后，通常将实验用具放入6080 _6080 _中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起_。烘箱烘箱污染污染第二十四张，PPT共七十八页，创作于2022年6月倒平板倒平板：待培养基冷却至：待培养基冷却至_ _ 时，将时，将每只培养皿每只培养皿倒入倒入_ml_ml未凝固的固体培养基，置于未凝固的固体培养基，置于_位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部，待凝，位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。使之形成平面。_备用。备用。制斜面制斜面

20、：将未凝固的固体培养：将未凝固的固体培养基的试管基的试管_放，冷却待凝使即放，冷却待凝使即成为斜面。成为斜面。10101212水平水平倒置倒置斜斜倒平板、制斜面倒平板、制斜面操作平台操作平台：灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开_和和_，灭菌，灭菌30min.30min.过滤风过滤风紫外线紫外线超净台超净台第二十五张，PPT共七十八页，创作于2022年6月思考题：思考题：A A、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？1 1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打开超净台的紫外

21、灯和过滤风，灭菌开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌3030分钟。分钟。2 2、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。3 3、整个操作在酒精灯火焰旁进行、整个操作在酒精灯火焰旁进行4 4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。B B、培养基灭菌后，需要冷却到、培养基灭菌后，需要冷却到6060后才倒平板，你后才倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度呢？用什么办法来估计培养基的温度呢？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。温

22、度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。第二十六张，PPT共七十八页，创作于2022年6月思考题思考题C C、为何要将平板倒置？、为何要将平板倒置？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠基面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落培养基，造成污染。落培养基，造成污染。DD、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微皿盖与皿底之间

23、的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？生物吗？为什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。E E、如何检查培养基是否受杂菌的污染？、如何检查培养基是否受杂菌的污染？将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生则未受杂菌污染。则未受杂菌污染。第二十七张，PPT共七十八页，创作于2022年6月（二）液体培养基接种培养（二）液体培养基接种培养主要器具：主要器具：操作方法：操作方法：先将接种环进行先将接种环进行_灭菌

24、灭菌,_,_后后的接种环挑取少量菌种，放入三角瓶的液体培养基的接种环挑取少量菌种，放入三角瓶的液体培养基中，加塞。置于中，加塞。置于_摇床振荡培养小时。摇床振荡培养小时。无菌操作：无菌操作：略略摇床摇床思考：如何冷却接种环？思考：如何冷却接种环？可通过接触试管内壁或未可通过接触试管内壁或未长菌的培养基达到冷却的长菌的培养基达到冷却的目的。目的。接种环、摇床等接种环、摇床等灼烧灼烧冷却冷却第二十八张，PPT共七十八页，创作于2022年6月（三）平板划线分离法（三）平板划线分离法主要器具：主要器具：操作过程：操作过程：注意：注意：无菌操作方法：同前。无菌操作方法：同前。将培养皿将培养皿_（盖在下）

25、，放于（盖在下），放于_恒温培养恒温培养箱中培养箱中培养_小时。小时。在作第二次以及其后的划线操作时，要从在作第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的开始上一次划线的开始_划线。划线。接种环、接种环、思考：若如上图所示进行划线分离，则接种环总思考：若如上图所示进行划线分离，则接种环总共进行几次灼烧灭菌？共进行几次灼烧灭菌？恒温培养箱。恒温培养箱。每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。末端末端倒置倒置第二十九张，PPT共七十八页，创作于2022年6月第三十张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 平板划线的操作方法平板划线的操作方法交叉划线法交叉划线法

26、连续划线法连续划线法 第三十一张，PPT共七十八页，创作于2022年6月 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？环？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的

27、增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。菌落。2 2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？为什么？划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。避免细菌污染环境和感染操作者。第三十二张，PPT共七十八页，创作于2022年6月3.3.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。4.4

28、.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。5 5、如何判断接种操作是否符合无菌要求？、如何判断接种操作是否符合无菌要求？如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一如果培养基上生长的菌落的颜色、

29、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。接种过程中，无菌操作还未达到要求。第三十三张，PPT共七十八页，创作于2022年6月（四）（四）稀释涂布平板法稀释涂布平板法主要器具：主要器具：玻璃三角刮刀、移液管或吸管玻璃三角刮刀、移液管或吸管操作过程：操作过程：先将培养菌液先将培养菌液稀释稀释（1010-5-51010-7-7倍）倍）用移液管或吸管取用移液管或吸管取0.1ml0.1ml稀释度不同的菌液，加稀释

30、度不同的菌液，加在平板上，用无菌玻璃三角刮刀均匀涂布在培养在平板上，用无菌玻璃三角刮刀均匀涂布在培养基平面上。基平面上。在适当稀释度下在适当稀释度下，可培养得到相互分，可培养得到相互分开的的菌落。开的的菌落。将培养皿倒置（盖在下），放于将培养皿倒置（盖在下），放于 恒温培养恒温培养箱中培养小时。箱中培养小时。划线分离方法简单；涂布分离，易形成单菌落，划线分离方法简单；涂布分离，易形成单菌落，但操作复杂些。但操作复杂些。第三十四张，PPT共七十八页，创作于2022年6月10g10g土样土样从土壤中分离微生物从土壤中分离微生物稀释涂布法稀释涂布法第三十五张，PPT共七十八页，创作于2022年6月（

31、五）斜面接种及菌种保存（五）斜面接种及菌种保存主要器具主要器具：操作过程操作过程：在无菌操作下，用接种环挑取：在无菌操作下，用接种环挑取_菌落，菌落，再用划线法再用划线法（自斜面底部向上轻轻划直线）接种接种在在_上，上，_恒温培养箱中培养恒温培养箱中培养_小时小时后，后，_ _ 冰箱保存。冰箱保存。无菌操作无菌操作：同前：同前试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多,不容易不容易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。思考：菌种保存为何采思考：菌种保存为何采用斜面而不是平板？用斜面而不是平板？接种环、恒温箱、冰箱接种环、恒

32、温箱、冰箱单单斜面斜面第三十六张，PPT共七十八页，创作于2022年6月菌种的保存菌种的保存菌种的保存菌种的保存 1 1、临时保藏：接、临时保藏：接种到固体斜面培养基，种到固体斜面培养基，菌落长成后置于菌落长成后置于44冰箱保存。冰箱保存。2 2、长期保存：甘、长期保存：甘油冷冻管藏法油冷冻管藏法第三十七张，PPT共七十八页，创作于2022年6月实验一实验一 大肠杆菌的培养和分离大肠杆菌的培养和分离实验步骤：实验步骤：一一 配制配制LBLB培养基培养基溶解溶解计算称量计算称量调调pHpH分装分装加塞，包扎加塞，包扎灭菌灭菌二二倒平板、制斜面倒平板、制斜面三三 大肠杆菌的培养大肠杆菌的培养三三

33、大肠杆菌的分离大肠杆菌的分离平板划线分离法（或稀释涂布平板法）平板划线分离法（或稀释涂布平板法）使所需细菌大量繁殖使所需细菌大量繁殖获得单菌落，纯化菌株获得单菌落，纯化菌株四四 斜面接种培养斜面接种培养目的菌株的纯培养和菌种保存目的菌株的纯培养和菌种保存第三十八张，PPT共七十八页，创作于2022年6月类型一类型一 培养基及无菌技培养基及无菌技术术【典例【典例1 1】(2015(2015绍兴绍兴模模拟拟)请请回答下列与大回答下列与大肠肠杆菌有关的杆菌有关的问题问题。(1)(1)从生从生态态系系统统的成分上看，的成分上看，大大肠肠杆菌属于杆菌属于。第三十九张，PPT共七十八页，创作于2022年6

34、月(2)(2)下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方。下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方。第四十张，PPT共七十八页，创作于2022年6月根据物理状根据物理状态态划分，划分，该该培养基属于培养基属于(固体、液体固体、液体)培养基。培养基。该该培养基中的碳源是培养基中的碳源是。(3)(3)在微生物培养操作在微生物培养操作过过程中，程中，为为防止防止杂杂菌菌污污染，需染，需对对培培养基和培养皿养基和培养皿进进行行(填填“消毒消毒”或或“灭灭菌菌”)；操；操作者的双手需要作者的双手需要进进行清洗和行清洗和。空气中的。空气中的细细菌可菌可用紫外用紫外线杀灭线杀灭，其原因是紫

35、外，其原因是紫外线线能使蛋白能使蛋白质变质变性，性，还还能能 。第四十一张，PPT共七十八页，创作于2022年6月(4)(4)将配制好的培养基分装到将配制好的培养基分装到试试管中，加棉塞后若干支管中，加棉塞后若干支试试管一捆，包上管一捆，包上牛皮牛皮纸纸并用皮筋勒并用皮筋勒紧紧放入放入中中灭灭菌，温度菌，温度为为，时间为时间为。灭灭菌完菌完毕毕拔掉拔掉电电源，待源，待锅锅内内压压力自然降到大气力自然降到大气压时压时，将，将试试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试试管管应应。(5)(5)使用高使用高压压蒸汽蒸汽灭灭菌菌锅时锅时注意，先向注意，先向锅锅内倒入内倒入。把

36、。把锅锅内水加内水加热热煮沸并将其中原有冷空气煮沸并将其中原有冷空气彻彻底排出后，将底排出后，将锅锅密密闭闭。若在。若在灭灭菌前，菌前，没有排尽没有排尽锅锅内的冷空气会内的冷空气会导导致致 。第四十二张，PPT共七十八页，创作于2022年6月(6)(6)从一支从一支试试管向另一支管向另一支试试管接种管接种时时注意，接种注意，接种环环要在酒精灯要在酒精灯(选选填填“内焰内焰”或或“外焰外焰”)灭灭菌，并且待接种菌，并且待接种环环后后蘸取菌种，蘸取菌种，试试管口不能离开酒精灯火焰附近，将接种的管口不能离开酒精灯火焰附近，将接种的试试管在管在适宜温适宜温度下培养，度下培养，长长成菌落后放入成菌落后放

37、入冰箱中保存。冰箱中保存。第四十三张，PPT共七十八页，创作于2022年6月【解题指南】【解题指南】解答本题需明确以下两点：解答本题需明确以下两点：(1)(1)根据表中提供的信息分析培养基的类型。根据表中提供的信息分析培养基的类型。(2)(2)根据题干信息总结无菌操作应注意的问题。根据题干信息总结无菌操作应注意的问题。第四十四张，PPT共七十八页，创作于2022年6月【解析】【解析】(1)(1)大肠杆菌营腐生生活，从生态系统的成分来看，大肠杆菌属于分解大肠杆菌营腐生生活，从生态系统的成分来看，大肠杆菌属于分解者。者。(2)(2)表中的培养基配方中含有琼脂，是固体培养基，其中能为大肠杆菌提表中的

38、培养基配方中含有琼脂，是固体培养基，其中能为大肠杆菌提供碳元素的物质有蛋白胨、乳糖和蔗糖。供碳元素的物质有蛋白胨、乳糖和蔗糖。(3)(3)微生物培养过程中，培养基和培养皿要进行灭菌，操作者的双手要进行消毒；微生物培养过程中，培养基和培养皿要进行灭菌，操作者的双手要进行消毒；紫外线杀菌的原理是紫外线不仅能使蛋白质变性，还能损伤紫外线杀菌的原理是紫外线不仅能使蛋白质变性，还能损伤DNADNA的结构。的结构。第四十五张，PPT共七十八页，创作于2022年6月(4)(4)培养基的灭菌应用高压蒸汽灭菌锅，在压力为培养基的灭菌应用高压蒸汽灭菌锅，在压力为1 kg/cm1 kg/cm2 2、温度为、温度为1

39、21121条件条件下，灭菌下，灭菌15 min15 min。若棉塞上沾有培养基，易被杂菌污染，应废弃。若棉塞上沾有培养基，易被杂菌污染，应废弃。(5)(5)使用高压蒸汽灭菌锅时要先加入适量水，否则没有高压蒸汽，还有可能损坏设使用高压蒸汽灭菌锅时要先加入适量水，否则没有高压蒸汽，还有可能损坏设备。备。(6)(6)酒精灯外焰温度高，灭菌效果好。灼烧后待冷却后再蘸取菌种，否则会杀死酒精灯外焰温度高，灭菌效果好。灼烧后待冷却后再蘸取菌种，否则会杀死菌种造成实验失败。菌种造成实验失败。第四十六张，PPT共七十八页，创作于2022年6月答案：答案：(1)(1)分解者分解者(2)(2)固体乳糖、蔗糖、蛋白胨

40、固体乳糖、蔗糖、蛋白胨(3)(3)灭菌消毒损伤灭菌消毒损伤DNADNA的结构的结构(4)(4)高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅12112115 min15 min废弃废弃(5)(5)适量水锅内温度上升不到应有度数，使灭菌不彻底适量水锅内温度上升不到应有度数，使灭菌不彻底(6)(6)外焰冷却外焰冷却44第四十七张，PPT共七十八页，创作于2022年6月【互【互动动探究】探究】(1)(1)培养大培养大肠肠杆菌除用杆菌除用题题中所中所给给培养基外，培养基外，还还可用何种培养基？可用何种培养基？提示：提示：LBLB液体培养基。液体培养基。(2)(2)表中的培养基在配制表中的培养基在配制时应时应如何操作？如

41、何操作？提示：提示：表中的培养基中含有琼脂成分，配制时要不断搅拌，否则易引起琼脂糊底而表中的培养基中含有琼脂成分，配制时要不断搅拌，否则易引起琼脂糊底而使烧杯炸裂。使烧杯炸裂。第四十八张，PPT共七十八页，创作于2022年6月【加固【加固训练训练】(2015(2015嘉嘉兴兴模模拟拟)下面是肺炎双球菌离体下面是肺炎双球菌离体转转化化实验实验的主要步的主要步骤骤：第四十九张，PPT共七十八页，创作于2022年6月(1)(1)实验实验用的器皿必用的器皿必须须是无菌的，常用是无菌的，常用法法灭灭菌。用此法菌。用此法对对培养基培养基灭灭菌菌时时，常将培养基装在常将培养基装在(器皿器皿)中中进进行。行。

42、(2)(2)实验实验操作需在超操作需在超净净工作台上工作台上进进行。工作台上，行。工作台上，实验实验前一段前一段时间时间需打开，需打开，而而实验实验中需关中需关闭闭的是的是。A.A.酒精灯酒精灯 B.B.照明灯照明灯C.C.过滤风过滤风 D.D.紫外灯紫外灯(3)(3)平面培养基与平面培养基与悬悬浮培养所用的培养基相比，浮培养所用的培养基相比，应应增加的成分是增加的成分是。第五十张，PPT共七十八页，创作于2022年6月(4)(4)常用涂布法常用涂布法给给平面培养基接种。下列叙述平面培养基接种。下列叙述错误错误的是的是()A.A.接种的目的是使接种的目的是使细细菌相互分离菌相互分离B.B.接种

43、需接种需过滤过滤除去除去杂杂菌后菌后进进行行C.C.接种工具需灼接种工具需灼烧烧后使用后使用D.D.接种需在酒精灯火焰旁接种需在酒精灯火焰旁进进行行(5)(5)在在3737恒温箱中培养恒温箱中培养时时，培养皿需，培养皿需，主要目的是避免水，主要目的是避免水滴影响滴影响的形成。的形成。(6)(6)培养后，如果培养后，如果观观察到菌落重叠，察到菌落重叠，则则在涂布法接种之前需在涂布法接种之前需进进行行操作。操作。第五十一张，PPT共七十八页，创作于2022年6月【解析】【解析】(1)(1)微生物培养实验中的各种器皿常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，微生物培养实验中的各种器皿常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌

44、，培养基则装在三角瓶中再进行灭菌。培养基则装在三角瓶中再进行灭菌。(2)(2)在超净工作台上操作时应关闭紫在超净工作台上操作时应关闭紫外灯，避免对实验者造成伤害。外灯，避免对实验者造成伤害。(3)(3)平面培养基因含有琼脂而呈固体或半固体平面培养基因含有琼脂而呈固体或半固体状态。状态。(4)(4)接种的目的是为了得到所需要的细菌，在无菌条件下进行，杂菌接种的目的是为了得到所需要的细菌，在无菌条件下进行，杂菌和肺炎双球菌大小差不多，所以用过滤的方法是不能除去杂菌的。和肺炎双球菌大小差不多，所以用过滤的方法是不能除去杂菌的。(5)(5)培养培养皿在培养箱中应倒置，防止水滴滴落污染培养基，影响单菌落

45、的形成。皿在培养箱中应倒置，防止水滴滴落污染培养基，影响单菌落的形成。(6)(6)如果如果菌落重叠，说明菌液浓度过高，需要稀释。菌落重叠，说明菌液浓度过高，需要稀释。第五十二张，PPT共七十八页，创作于2022年6月答案：答案：(1)(1)高压蒸汽灭菌三角瓶高压蒸汽灭菌三角瓶(2)D(2)D(3)(3)琼脂琼脂(4)B(4)B(5)(5)倒置单菌落倒置单菌落(6)(6)稀释菌液稀释菌液第五十三张，PPT共七十八页，创作于2022年6月类类型二型二 大大肠肠杆菌的培养和分离杆菌的培养和分离【典例【典例2 2】大大肠肠杆菌是生存在人体杆菌是生存在人体肠肠道中的正常菌群，每克道中的正常菌群，每克粪粪

46、便中含有便中含有10109 9个，且能个，且能够够与致病菌混与致病菌混杂杂生生长长。如果食品和。如果食品和饮饮用水中出用水中出现现大大肠肠杆菌，就意杆菌，就意味着食物可能被味着食物可能被粪粪便便污污染而染而带带上致病菌，因而常将大上致病菌，因而常将大肠肠杆菌的数量作杆菌的数量作为为食品食品卫卫生的生的检测检测指指标标之一。之一。请请据此回答下列据此回答下列问题问题：第五十四张，PPT共七十八页，创作于2022年6月(1)(1)测测定街定街边边出售的奶茶中大出售的奶茶中大肠肠杆菌的数目，常用涂布分离法杆菌的数目，常用涂布分离法进进行行测测定。定。该该方法首先配制方法首先配制LBLB培养基，培养基

47、，进进行高行高压压蒸汽蒸汽灭灭菌后冷却至菌后冷却至6060，在，在旁倒在培养皿中形成平板；旁倒在培养皿中形成平板；对对奶茶奶茶样样品品进进行一行一定倍数的稀定倍数的稀释释，取，取0.1 mL0.1 mL奶茶稀奶茶稀释释液，加在培养皿的固体培养基上，液，加在培养皿的固体培养基上，用用涂布在培养基平面上，然后涂布在培养基平面上，然后进进行培养；行培养；观观察察统计统计培养皿中培养皿中数目；数目；该该数据比数据比实际实际数数值值要要 (填填“高高”或或“低低”)，原因是原因是 。实验实验完成后需要完成后需要对对培养基培养基进进行行处处理，然后理，然后才能倒掉。才能倒掉。第五十五张，PPT共七十八页，

48、创作于2022年6月(2)(2)若要若要对对上述培养基中的菌种上述培养基中的菌种进进行行扩扩大培养，大培养，则则需配制需配制LBLB 培养基，培养基，灭灭菌后，将菌后，将在酒精灯火焰上在酒精灯火焰上烧红烧红后冷却，然后蘸取后冷却，然后蘸取单单菌落中的菌落中的菌体接种到新的培养基中，在适宜菌体接种到新的培养基中，在适宜环环境中培养境中培养h h即可。即可。第五十六张，PPT共七十八页，创作于2022年6月【解析】【解析】(1)(1)微生物的分离通常用固体培养基。为防止杂菌污染，要在酒精微生物的分离通常用固体培养基。为防止杂菌污染，要在酒精灯火焰旁倒平板。在用涂布分离法分离细菌时，为了使细菌均匀涂

49、布在固体灯火焰旁倒平板。在用涂布分离法分离细菌时，为了使细菌均匀涂布在固体培养基上，常用玻璃刮刀把菌液涂布在培养基上。通过观察菌落数推算细菌培养基上，常用玻璃刮刀把菌液涂布在培养基上。通过观察菌落数推算细菌数目。培养基中可能有两个或多个细菌紧挨在一起，共同形成一个菌落，因数目。培养基中可能有两个或多个细菌紧挨在一起，共同形成一个菌落，因此观察到的菌落数可能比实际菌落数低。为了防止实验菌污染环境，实验完此观察到的菌落数可能比实际菌落数低。为了防止实验菌污染环境，实验完成后需要对培养基进行灭菌处理，然后才能倒掉。成后需要对培养基进行灭菌处理，然后才能倒掉。第五十七张，PPT共七十八页，创作于202

50、2年6月(2)(2)对微生物进行扩大培养，通常使用液体培养基。一般用接种环转移带菌对微生物进行扩大培养，通常使用液体培养基。一般用接种环转移带菌的培养物。接种时，先将接种环在明火上烧红后冷却，然后蘸取带菌的培养的培养物。接种时，先将接种环在明火上烧红后冷却，然后蘸取带菌的培养物，接种到新的培养基中。在液体培养基中，只要接种培养物，接种到新的培养基中。在液体培养基中，只要接种培养12 h12 h，每毫升培，每毫升培养基中就有几亿个细菌。养基中就有几亿个细菌。答案：答案：(1)(1)固体酒精灯火焰玻璃刮刀固体酒精灯火焰玻璃刮刀(涂布棒涂布棒)菌落低培养基中可能有两个或多个细菌紧挨在一起，共同形成一