血红蛋白的提取和分离优质课 (2)讲稿.ppt
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1、关于血红蛋白的提取和分离优质课(2)第一页,讲稿共四十页哦1.1.分离生物大分子的基本思路:分离生物大分子的基本思路:选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有不同物理的方法分离具有不同物理或化学性质的或化学性质的生物大分子生物大分子。2.2.蛋白质分离和提取的原理:蛋白质分离和提取的原理:根据蛋白质根据蛋白质各种特性各种特性的差异,如的差异,如分子的形状和大小、分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力子的亲和力等等,可以用来分离等等,可以用来分离不同种类不同种类的蛋白质。的蛋白质。基础知识基础知识
2、3 3、提取分离方法、提取分离方法凝胶色谱法凝胶色谱法凝胶电泳法凝胶电泳法第二页,讲稿共四十页哦基础知识基础知识2.凝胶:大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物(如(如葡聚糖或葡聚糖或琼脂糖琼脂糖)构成的)构成的多孔多孔小球体,小球体,内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道通道。根据被分离的蛋白质根据被分离的蛋白质相对分子质量相对分子质量的大小,利用的大小,利用具有具有网状结构网状结构的凝胶的的凝胶的分子筛分子筛作用,来进行分离。作用,来进行分离。1.概念:(一)(一)凝胶色谱法(分配色谱法)凝胶色谱法(分配色谱法)第三页,讲稿共四十页哦基础知识基础知识(一)(一)凝胶色谱法(分配
3、色谱法)凝胶色谱法(分配色谱法)3.凝胶色谱法的原理 当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢移动速度较慢;而相对而相对分子量较大分子量较大的蛋白质无法进入的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶内部的通道,只能在凝胶外部凝胶外部移动,路程移动,路程较短较短,移动速度移动速度较快较快。相对分子质量不同相对分子质量不同的蛋白质分子因此的蛋白质分子因此得以分离。得以分离。依据的特性是:依据的特性是:蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。第四
4、页,讲稿共四十页哦4.4.凝胶色谱法分离蛋白质分离蛋白质的原理和具体过程具体过程第五页,讲稿共四十页哦凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示第六页,讲稿共四十页哦(二)缓冲溶液(二)缓冲溶液 1.1.概念概念:在一定的范围内,凡是能够抵制在一定的范围内,凡是能够抵制外加少量强酸外加少量强酸或强碱或强碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不变的混不变的混合溶液。合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PHPH值的影响,值的影响,维持维持PHPH基本不变基本不变。2.2.作用作用:基础知识基础知识第七页,讲稿共四十页哦(二)
5、缓冲溶液(二)缓冲溶液基础知识基础知识3.3.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制:通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。调溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不同不同PHPH范围内范围内使使用的缓冲液。用的缓冲液。4.4.提问:在本课题中使用的缓冲液是提问:在本课题中使用的缓冲液是:_:_,其目的是其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的PHPH环境,保证血红蛋环境,保证血红蛋白的白的正常结构和功能正常结构和功能,便于观察,便于观察(红色红色)和科学研究和科学研究(活性活性)磷酸缓冲液磷酸缓冲液第八页,讲稿共四十页哦
6、 (三)(三)电泳:电泳:1.1.概念:概念:带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.2.原理:原理:许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解离的基团,在一定的都具有可解离的基团,在一定的PHPH下,这些基团会下,这些基团会带上正电或负电。带上正电或负电。在电场的作用下,这些带电分在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳电泳利用了待分离样品中各种分子利用了待分离样品中各种分子带电性质带电性质的差异以及的差异以及分子本身的大小,形状分子本身的大小,形状的不同
7、,使带电分子产生不同的不同,使带电分子产生不同的的迁移速度迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离,从而实现样品中各种分子的分离。基础知识基础知识第九页,讲稿共四十页哦影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素3.3.类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。第十页,讲稿共四十页哦 在在电场电场的作用下,的作用下,这这些些带电带电分子分子会会向着向着与与其所其所带带电电荷相反的荷相反的电电极极移移动动琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图第十一页,讲稿共四十页哦 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 1、测定蛋白质分子量、测定蛋白质分子
8、量:常用常用十二烷基硫酸钠(十二烷基硫酸钠(SDSSDS)聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺单体丙烯酰胺和和交联剂交联剂N,N-N,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺在在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N-亚甲基双丙烯酰胺(形成交联)亚甲基双丙烯酰胺(形成交联)丙烯酰胺和交联剂丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应第十二页,讲稿共四十页哦 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取于
9、它所取于它所带带净电荷的多少净电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。2.2.原理:原理:SDSSDS能使能使蛋白质发生完全变性。解聚成单条肽蛋白质发生完全变性。解聚成单条肽链链,因此测定的结果只是,因此测定的结果只是单条肽链的分子量单条肽链的分子量。SDSSDS能与各种蛋白质形成能与各种蛋白质形成蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物,SDSSDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有原有的电荷量的电荷量。因而。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别,差别,使使电泳迁移率完全取决于分子的大小电泳迁移率完全取决于分子的大小。3
10、.SDS3.SDS作用机理作用机理:第十三页,讲稿共四十页哦用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白测定蛋白质的分子量时,可选用一组质的分子量时,可选用一组已知分子量的标已知分子量的标准蛋白准蛋白同时进行电泳,根据已知分子量的标准同时进行电泳,根据已知分子量的标准蛋白的蛋白的电泳区带位置电泳区带位置,可以测定,可以测定未知蛋白质未知蛋白质的的分子量。分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。分子量的标准蛋白试剂出售。第十四页,讲稿共四十页哦电泳检测结果电
11、泳检测结果琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳第十五页,讲稿共四十页哦 实验操作实验操作样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定1.1.样品处理:样品处理:(一)蛋白质提取和分离步骤(一)蛋白质提取和分离步骤(二)操作过程(二)操作过程 可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。来分离血红蛋白。第十六页,讲稿共四十页哦血血液液血浆血浆水水 分分固体物质:固体物质:血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞(最多)(最多)血红蛋白血红蛋白(9090)两个两个肽链肽链两个两个一肽
12、链一肽链四个亚铁血红素基团四个亚铁血红素基团2.提问:提问:血液有哪些成分?血液有哪些成分?1.1.提问:提问:用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNA,用猪、牛、羊的红细,用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么?胞提取血红蛋白的原因是什么?鸡的红细胞具有细胞核,含有鸡的红细胞具有细胞核,含有DNADNA,便于进行,便于进行DNADNA的的提取;人的红细胞无细胞核,结构简单,血红蛋白含量提取;人的红细胞无细胞核,结构简单,血红蛋白含量丰富,便于提取血红蛋白。丰富,便于提取血红蛋白。第十七页,讲稿共四十页哦血红蛋白血红蛋白两个两个肽链肽链两个两个一肽链一肽链四个亚铁四个亚铁血血红素基团
13、红素基团每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团,亚铁血红素基团,此此基团可携带基团可携带一分子一分子O2或一分子或一分子CO2,血血红蛋白因含有红蛋白因含有血红素血红素而呈而呈红色红色。血红蛋白的特点:血红蛋白的特点:第十八页,讲稿共四十页哦(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤:去除杂质蛋白,利于后续血红蛋白的分离纯化去除杂质蛋白,利于后续血红蛋白的分离纯化.1 1、采集血样、采集血样2 2、低速短时间离心、低速短时间离心(速度越高和时间越长,会使白细(速度越高和时间越长,会使白细 胞等一同沉淀,达不到分离的效果)胞等一同沉淀,达不到分离的效果)3 3、吸取血浆:、吸取血浆:上层透明的
14、黄色血浆。上层透明的黄色血浆。4 4、盐水洗涤:、盐水洗涤:下层暗红色的红细胞下层暗红色的红细胞+五倍体积的五倍体积的0.90.9 的的NaClNaCl溶液洗涤,搅拌溶液洗涤,搅拌10min10min5 5、低速、低速短时间短时间离心:离心:6 6、重复、重复3 3、4 4、5 5步骤三次步骤三次 上清液中已没有黄色:红细胞洗涤干净。上清液中已没有黄色:红细胞洗涤干净。目的目的:操作:操作:洗涤次数过少洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白。无法除去血浆蛋白。第十九页,讲稿共四十页哦(2)(2)血红蛋白的释放:血红蛋白的释放:加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积,加加40体积的甲苯体积的甲苯(溶解
15、细胞膜)(溶解细胞膜)置于置于磁力搅拌器磁力搅拌器搅拌搅拌10min(加速细胞破裂)(加速细胞破裂)红细胞破裂,释放出血红蛋白红细胞破裂,释放出血红蛋白第二十页,讲稿共四十页哦(3)(3)分离血红蛋白溶液:分离血红蛋白溶液:过程过程:将搅拌好混合液转移到离心管内,以将搅拌好混合液转移到离心管内,以2000r/min2000r/min的速度的速度离离心心10 min10 min。试管中溶液层次:试管中溶液层次:第第1层(最上层):层(最上层):甲苯层甲苯层(无色透明);(无色透明);第第2层(中上层):层(中上层):脂溶性物质沉淀层脂溶性物质沉淀层(白色薄层固体);(白色薄层固体);第第3层(中
16、下层):层(中下层):血红蛋白的水溶液层血红蛋白的水溶液层(红色透明液体);(红色透明液体);第第4层(最下层):层(最下层):杂质沉淀层杂质沉淀层(暗红色)。(暗红色)。分离分离:滤纸过滤:除去脂溶性沉淀层,滤纸过滤:除去脂溶性沉淀层,分液漏斗中静置:分出下层的分液漏斗中静置:分出下层的红色透明液体红色透明液体。第二十一页,讲稿共四十页哦甲苯层甲苯层(无色透明)无色透明)白色薄层固体白色薄层固体 红色透明液体红色透明液体杂质沉淀层杂质沉淀层(暗红色暗红色)试管中溶液层次试管中溶液层次第二十二页,讲稿共四十页哦(4)(4)透透 析:析:过程:过程:取取1ml1ml的血红蛋白溶液的血红蛋白溶液装
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