选修三基因工程操作程序鬻.ppt

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1、选修三基因工程操作程序鬻现在学习的是第1页，共37页真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用：有调控作用,上游有上游有RNARNA聚合聚合 酶结合位点酶结合位点(启动子启动子)。与与RNARNA聚合酶结聚合酶结合位点合位点基基因因结结构构现在学习的是第2页，共37页原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同

2、点不同点编码区是编码区是_的，边的，边_边边_编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的，先的，先_后后_相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具有调和具有调控作用的控作用的_区组成的区组成的连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码转录转录翻译翻译转录转录翻译翻译现在学习的是第3页，共37页 目的基因的获取目的基因的获取 基因表达载体的构建（基因表达载体的构建（核心核心）将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定四四 个个 步步 骤骤现在学习的是第4页，共37页一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、目的基因主要是指、目的基因主要

3、是指_编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的常用方法、获取目的基因的常用方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成现在学习的是第5页，共37页1)1)基因文库？基因文库？1.1.从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因将含有将含有某种生物某种生物不同基因的许多不同基因的许多DNADNA片断，导片断，导入到入到受体菌受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库生物的不同基因，称为基因文库2)

4、2)基因文库的种类基因文库的种类:种种类类基因组基因组DNA文库：文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNA文库文库现在学习的是第6页，共37页基因文库的构建方法 基因组文库的构建基因组文库的构建提取某种生物的提取某种生物的全部全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接重组载体重组载体基因组文库基因组文库导入受体菌中储存导入受体菌中储存现在学习的是第7页，共37页 cDNA文库的构建文库的构建-

5、逆转录法：逆转录法：提取某种生物的某器官或提取某种生物的某器官或特定特定发育时期的发育时期的mRNAmRNA单链单链DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段重组载体重组载体与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶导入受体菌中储存导入受体菌中储存现在学习的是第8页，共37页思考？思考？真核生物的基因用逆转录法得到的真核生物的基因用逆转录法得到的cDNAcDNA与原基因相同吗？与原基因相同吗？现在学习的是第9页，共37页真核细胞的cDNA的获取编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区DNA聚

6、合酶聚合酶剪接有关的酶剪接有关的酶RNA聚合酶聚合酶mRNA前体前体mRNA单链单链DNAcDNA逆转录酶逆转录酶转录转录剪接剪接逆转录逆转录复制复制启动子启动子启动子启动子终止子终止子基因基因不含不含非编码非编码序列序列。即不。即不含含非编码区非编码区和和内含子内含子现在学习的是第10页，共37页基因组DNA文库与cDNA文库的比较 文库类型文库类型 cDNA文库文库 基因组文库基因组文库 文库大小文库大小基因中启动子（具有启基因中启动子（具有启动作用的动作用的DNA片段）片段）基因中内含子基因中内含子(位于编码位于编码蛋白质序列的非编码蛋白质序列的非编码DNA片段）片段）基因多少基因多少

7、物种间的基因交流物种间的基因交流小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以现在学习的是第11页，共37页2.利用PCR技术扩增目的基因1 1概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。2 2原理：原理：DNADNA复制复制原料：原料：模板模板DNADNA；DNADNA引物；四种脱氧核苷引物；四种脱氧核苷酸；热稳定酸；热稳定DNADNA聚合酶聚合酶多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段3 3前提：前提：已知目的基因的一

8、段核苷酸序列已知目的基因的一段核苷酸序列现在学习的是第12页，共37页1.1.变性变性（9595）双链双链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_氢键氢键单链单链DNADNA2.2.复性复性 (55)(55)温度降温度降低，低，与与DNADNA模板模板结合，形成局部结合，形成局部_。双链双链引物引物3.3.延伸延伸（7272）在在 的作用下，从的作用下，从引物的引物的 连接连接 ，合，合 成与模板互补的成与模板互补的DNADNA链。链。33端端脱氧核苷酸脱氧核苷酸TaqTaq酶酶现在学习的是第13页，共37页PCR技术的操作过程a a、DNADNA变性变性（90-9

9、590-95）：双）：双链链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6555-65）：）：系统温度降低，系统温度降低，引物引物与与DNADNA模板模板结合，形成局部结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，合成与模板互补的作用下，合成与模板互补的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d.重复重复a.b.ca.b.c步骤：每重复一步骤：每重复一次，目的基因增加次，目的基因增加_倍倍一一现在学习的是第14页，共37页PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的

10、比较DNA复制复制PCR技术技术场所场所原理原理条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、四种脱氧核苷酸、模板、酶、酶、ATP四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、模板、酶、模板、酶、引物引物DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、半保留复制、边边解旋边复制解旋边复制半保留复制、半保留复制、全全解旋再复制解旋再复制体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶、

11、聚合酶、解旋酶等解旋酶等现在学习的是第15页，共37页3.人工合成法 在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用用DNADNA合成仪人工合成合成仪人工合成蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测思考：思考：化学法合成化学法合成的目的基因含的目的基因含内含子、内含子、启动子和终止子启动子和终止子吗？吗？现在学习的是第16页，共37页反转录法：反转录法：杂交双链杂交双链(单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA双

12、链双链DNADNA(cDNAcDNA)目的基因目的基因的的mRNAmRNA某种酶某种酶DNADNA聚合酶聚合酶反转录酶反转录酶人工合成法（真核生物真核生物）现在学习的是第17页，共37页课堂小结目的基因的获取目的基因的获取1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成种种类类基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNA文库文库现在学习的是第18页，共37页二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核

13、心1 1目的：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2 2基因基因表达载体表达载体的组成：的组成：复制原点复制原点+目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因现在学习的是第19页，共37页表达载体启动子：启动子：位于基因的首端的一段特殊位于基因的首端的一段特殊的的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别聚合酶识别和结合的部位和结合的部位，有了它才能，有了它才能驱动驱动基因转录出基因转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白最终获得蛋白质质终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特位于基因的尾端的一段特殊的殊的DNA

14、DNA片断，片断，能终止能终止mRNAmRNA的转录的转录标记基因标记基因的作用是的作用是为了为了鉴别鉴别受体细受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来的基因的细胞筛选出来现在学习的是第20页，共37页基因表达载体的构建过程质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子分子 表达载体表达载体同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端现在学习的是第21页，共37页注意：载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原的区别：二者都有标记

15、基因和复制原点两部分点两部分DNADNA片段。表达载体在载体基础上增加了片段。表达载体在载体基础上增加了目的基目的基因、启动子、终止子因、启动子、终止子三部分结构三部分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到既用到限制酶切割载体，又用到DNADNA连连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式必需以表达载体的方式携带进去。携带进去。现在学习的是第2

16、2页，共37页 三、将目的基因导入受体细胞1 1转化：转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2 2常用的受体细胞：常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。和动植物细胞等。3 3目的基因导入受体细胞的原理：目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。现在学习的是第23页，共37页1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转）农杆菌转化法化法特点特点:能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对单子对单子叶植物无感染能力叶植物无

17、感染能力Ti质粒质粒的的TDNA可转移至受体细胞并可转移至受体细胞并整合到其染色体上整合到其染色体上转化过程转化过程:Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌现在学习的是第24页，共37页1、目的基因导入植物细胞的方法（2 2）基因枪法：）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞目的基因导入单子叶植物细胞 操作方法：利用压缩气体产生的动力操作方法：利用压缩气体产生的动力，将，将包裹在金属粒表面的表达载体包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的

18、方法胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um。适用：适用：单子叶植物单子叶植物现在学习的是第25页，共37页1、目的基因导入植物细胞的方法（3 3）花粉管通道法：）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞 操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞 特点特点:十分简便经济。十分简便经济。例：

19、转基因抗虫棉例：转基因抗虫棉现在学习的是第26页，共37页2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序程序目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵）显显微注射微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物现在学习的是第27页，共37页3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞过程：过程：Ca2+处理受体细胞处理受体细胞感受态细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNA分子分子思考：早期的基因工程用什么作受体细胞？为什么？思考：早期的基因工程用什么作受体细胞？为什么？常用原核生物

20、，因为原核生物繁殖快、多为单细胞、常用原核生物，因为原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。遗传物质相对较少等。方法方法CaCa2+2+处理法处理法用用CaCa2 2处理，处理，增加细菌细增加细菌细胞壁的通透胞壁的通透性性思考：思考：为什么为什么要用要用Ca2+处理受处理受体细胞？体细胞？现在学习的是第28页，共37页三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞转化转化 方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显

21、微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受受体细胞内维持体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达现在学习的是第29页，共37页 四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入入重组重组DNADNA分子吗？分子吗？1 1真正能摄入重组真正能摄入重组DNADNADNADNA分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。2 2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？持和表达？不一定，需要检测不一定，需要

22、检测现在学习的是第30页，共37页1、鉴定分子水平的鉴定转基因生转基因生物的物的DNA探针探针15N N15N N14N N14N N（1 1）检测转基因生物染色体的）检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了上是否插入了目的基因目的基因基因探针：基因探针：放射性同位素等标记的放射性同位素等标记的DNA分子分子方法方法DNA分子杂交技术分子杂交技术变性变性变性变性现在学习的是第31页，共37页现在学习的是第32页，共37页1、鉴定分子水平的鉴定变性变性变性变性方法方法分子杂交技术分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了）检测目的基因是否转录出了mRNA探针探针15N N15N N转基因生

23、物转基因生物的的mRNA14N N14N N现在学习的是第33页，共37页1、鉴定分子水平的鉴定提提取取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法抗原抗原-抗体杂交抗体杂交苏云金杆菌苏云金杆菌Bt毒素蛋白毒素蛋白将将Bt毒蛋白注射毒蛋白注射小鼠体内小鼠体内从小鼠血管抽出血从小鼠血管抽出血液分离出抗液分离出抗Bt毒素毒素的抗体的抗体抗体抗体蛋白质蛋白质 出现杂出现杂交带交带脱脱分分化化组组织织培培养养现在学习的是第34页，共37页2、鉴定个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉铃例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出

24、现中毒虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到明摄入了抗虫基因并得到表达。表达。现在学习的是第35页，共37页(四四)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检测检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法方法DNADNA分子杂交分子杂交表达检测表达检测转录检测转录检测分子杂交分子杂交翻译检测翻译检测抗原抗体抗原抗体杂交杂交分分子子检检测测法法鉴定鉴定抗虫鉴定抗虫鉴定抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等个体水平的鉴定个体水平的鉴定现在学习的是第36页，共37页2、基因表达载体的作用、基因表达载体的作用思考：思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？完成任务吗？为什么？现在学习的是第37页，共37页