酶分子的修饰.ppt

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1、酶分子的修饰现在学习的是第1页，共39页1、什么是酶分子修饰2、酶分子的修饰方法3、酶修饰后的性质变化GoGoGo4、酶分子修饰应用Go现在学习的是第2页，共39页 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团(物质物质)，特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。的结构和性质。一、一、什么

2、是酶分子修饰什么是酶分子修饰现在学习的是第3页，共39页天然酶的缺陷天然酶的缺陷细胞外稳定性差细胞外稳定性差:易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；容易受产物和抑制剂的抑制容易受产物和抑制剂的抑制酶活性不够高酶活性不够高工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的最适酸度工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的最适酸度和温度范围内和温度范围内具有抗原性具有抗原性酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用现在学习的是第4页，共39页提高酶的提高酶的活力活力增强酶的增强酶的稳定性稳定性（热稳定性、体

3、内半衰期）（热稳定性、体内半衰期）降低或消除酶的降低或消除酶的抗原性抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）（针对特异性反应降低生物识别能力）产生新的催化能力产生新的催化能力研究酶的结构与功能的关系研究酶的结构与功能的关系(研究和了解酶分子中主链、侧链、研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响)酶分子修饰的目的酶分子修饰的目的现在学习的是第5页，共39页1 金属离子置换修饰金属离子置换修饰2 大分子结合修饰大分子结合修饰(共价共价/非共价非共价)3 侧链基团修饰侧链基团修饰4 肽链有限水解修饰肽链

4、有限水解修饰5 氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰6 酶分子的物理修饰酶分子的物理修饰 二、酶分子的修饰方法二、酶分子的修饰方法现在学习的是第6页，共39页 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。-淀粉酶中的钙离子（淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（离子（Zn2+），超氧化物歧

5、化酶分子中的铜、锌离子），超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+，Zn2+)1、酶酶的金属离子置的金属离子置换换修修饰饰现在学习的是第7页，共39页酶的分离纯化酶的分离纯化 首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。液。除去原有的金属离子除去原有的金属离子 在经过纯化的酶液中加入一定量的在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，）等，使酶分子中的金属离子与使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方等形成螯合物。通

6、过透析、超滤、分子筛层析等方法，将法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。金属离子置换修饰的过程金属离子置换修饰的过程加入置换离子加入置换离子 于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。酶。现在学习的是第8页，共39页 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含

7、有金属离子的酶。含有金属离子的酶。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。子。现在学习的是第9页，共39页阐明金属离子对酶催化作用的影响阐明金属离子对酶催化作用的影响提高酶的催化效率提高酶的催化效率增强酶的稳定性增强酶的稳定性(如如SOD)改变酶的动力学特性改变酶的动力学特性 金属离子置换修饰的作用金属离子置换修饰的作用现在学习的是第10页，共39页目前应用最广的酶分子修饰方法。水溶性大分子通过共价键目前应用最广的酶分子修饰方法。水溶性大分子通过共价键与酶的侧链基团共价结合，使酶分子空间构想发生改变，从与酶的侧链基团共价结合，使酶

8、分子空间构想发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。而改变酶的催化特性的方法。修饰剂：修饰剂：聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、肝素、蔗糖聚合物等。、右旋糖酐、肝素、蔗糖聚合物等。如：如：PEG超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SOD）、）、PEG溶血类蛋白质（链激溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）、酶、尿激酶等）、PEG天门冬酰胺酶。天门冬酰胺酶。根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式，可分为根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式，可分为非共价修饰非共价修饰和和共价修饰共价修饰两类两类2、酶酶的大分子修的大分子修饰饰现在学习的是第11页，共39页 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保

9、护酶的一些添加使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键氢键固定在酶分子表面，也固定在酶分子表面，也能通过能通过氢键氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。一一 些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。保护酶的活力。另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子

10、，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。非共价修饰非共价修饰现在学习的是第12页，共39页 共价修饰共价修饰 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键共价键连接于酶分子连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。的表面，形成一层覆盖层。现在学习的是第13页，共39页修饰剂的选择修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、）、右旋

11、糖酐、蔗糖聚合物葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。选择适宜的水溶性大分子。修饰剂的活化修饰剂的活化：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。行反应。大分子修饰大分子修饰(共价共价)的过程的过程现在学习的是第14页，共39页修饰修饰：将带有活化基团的大分子

12、修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。分离分离：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。现在学习的是第15页，共39页增强酶的稳定性增强酶的稳定性降

13、低或消除酶蛋白的抗原性降低或消除酶蛋白的抗原性提高酶的催化效率提高酶的催化效率 每分子核糖核酸酶与每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的活力的2.25倍；倍；每分子胰凝乳蛋白酶与每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍倍 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以，不仅可以降低或消除酶的抗原性降低或消除酶的抗原性，而，而且提高了且提高了抗蛋白酶的能力抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的，延长了酶在体内的半衰期半衰期从

14、而提高了酶药效。从而提高了酶药效。大分子修饰的作用大分子修饰的作用现在学习的是第16页，共39页酶 半衰期相对稳定性 天然SOD 6 min 1 右旋糖酐-SOD 7 h 70 Ficoll(低分子量)SOD 14 h 140 Ficoll(高分子量)SOD 24 h 240 聚乙二醇-SOD 35 h 350聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。酶产

15、生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。现在学习的是第17页，共39页 采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响。如研究酶的活性中心中的必需基团。构、特性和功能的影响。如研究酶的活性中心中的必需基团。3、酶酶分子的分子的侧链侧链基基团团修修饰饰现在学习的是第18页，共39页 酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能酶蛋白的侧

16、链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。变酶的特性和功能。能进行化学修饰的氨基酸侧链基团能进行化学修饰的氨基酸侧链基团现在学习的是第19页，共39页非极性非极性R基氨基酸基氨基酸（共（共8种）：种）：丙氨酸（丙氨酸（Ala，A）亮氨酸（亮氨酸（Leu，L）缬氨酸

17、（缬氨酸（Val，V）异亮氨酸（异亮氨酸（Ile，I）苯丙氨酸（苯丙氨酸（Phe，F）色氨酸（色氨酸（Trp，W）甲硫氨酸（甲硫氨酸（Met，M）脯氨酸（脯氨酸（Pro，P）无电荷的极性无电荷的极性R基氨基酸基氨基酸（共（共7种）：种）：丝氨酸（丝氨酸（Ser，S）苏氨酸（苏氨酸（Thr，T）酪氨酸（酪氨酸（Tyr，Y）半胱氨酸（半胱氨酸（Cys，C）天冬酰胺（天冬酰胺（Asn，N）甘氨酸（甘氨酸（Gly，G）谷氨酰胺（谷氨酰胺（Gln，Q）带正电荷的极性带正电荷的极性R基氨基酸基氨基酸（共（共3种）：种）：赖氨酸（赖氨酸（Lys，K）精氨酸（精氨酸（Arg，R）组氨酸（组氨酸（His，H）2

18、0种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。修饰，它们一般具有亲核性。带负电荷的极性带负电荷的极性R基氨基酸基氨基酸（共（共2种）种）：天冬氨酸（天冬氨酸（Asp，D）谷氨酸（谷氨酸（Glu，E）现在学习的是第20页，共39页侧链基团：侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。包括氨基、组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。包括氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基和吲哚基。羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基和吲哚基。现在学习的是第21页，共39页化学修饰反应的类型化学修饰反应的类型主要反应：主要反应：烷基化反应、酰化反应、氧

19、化还原反应、芳香环取代烷基化反应、酰化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应反应现在学习的是第22页，共39页 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶原激活法。酶原激活法。4、酶蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）、酶蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）现在学习的是第23页，共39页胃蛋白酶原的激活胃蛋白酶原的激活 现在学习的是第24页，共39页现在学习的是第25页，共39页 胰蛋白酶原

20、（胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活）的激活 现在学习的是第26页，共39页 将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。通过两个途径实现：通过两个途径实现：化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。化学修饰法：由于可用试剂的限制，获得的种类少。蛋白质工程：利用基因操纵技术。蛋白质工程：利用基因操纵技术。5、氨基酸置、氨基酸置换换修修饰饰现在学习的是第27页，共39页 氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，氨基酸或

21、核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸丝氨酸转换为转换为半胱氨酸半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。行修饰，操作复杂，难以工业化生产。化学修饰法化学修饰法现在学习的是第28页，共39页 现在常用的氨基

22、酸置换修饰的方法是现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术定点突变技术。定点突变是定点突变是20世纪世纪80年代发展起来的一种基因操作技术。年代发展起来的一种基因操作技术。是指在是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。得突变基因的操作技术。定点突变技术为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、定点突变技术为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。可靠、行之有效的手段。定点突变定点突变现在学习的是第29页，共39页酶分子的定点突变技术酶分子的定点突变技术基因序列分析基因序列分析蛋白质结构分析蛋白质结构

23、分析酶活性中心分析酶活性中心分析引物设计进行基因定点突变引物设计进行基因定点突变酶基因克隆表达酶基因克隆表达变异特性分析变异特性分析现在学习的是第30页，共39页6、酶酶分子的物理修分子的物理修饰饰 通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的催化特性的方法。的催化特性的方法。高压修饰的纤维素酶比天然酶的活力提高高压修饰的纤维素酶比天然酶的活力提高10%。通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端（高温、高压、高盐、极端pHpH

24、值等）由于酶分子空间构象的改变值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。而引起酶的特性和功能的变化情况。特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。现在学习的是第31页，共39页四四 酶修饰后的性质变化酶修饰后的性质变化热稳定性热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。：一般来说，热稳定性有较大的提高。抗原性抗原性：比较公认的是：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原和人血清白蛋白在消除酶

25、的抗原性上效果比较明显。性上效果比较明显。各类失活因子的抵抗力各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。能力，从而提高其稳定性。现在学习的是第32页，共39页半衰期半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。最适最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最适：大部分酶经化学修饰后，酶的最适pH发生了变化，发生了变化，这种变化在应用研

26、究上有时具有重要意义。修饰酶最适这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适pH更更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。Km的变化的变化：大多数酶经修饰后，：大多数酶经修饰后，Vm没有明显变化，但有些酶没有明显变化，但有些酶经修饰后，经修饰后，Km值变大。值变大。现在学习的是第33页，共39页五五 酶化学修饰的应用酶化学修饰的应用 在酶学研究方面的应用在酶学研究方面的应用酶的活性中心研究酶的活性中心研究酶的空间结构研究：荧光修饰剂修饰酶，分析其荧光光谱，酶的空间结构研究：荧光修饰剂修饰酶，分析其荧光光谱，确定其空间结构确定其空间结构酶的作用机制研

27、究：亲和标记、差示标记、氨基酸置换酶的作用机制研究：亲和标记、差示标记、氨基酸置换和核酸置换法和核酸置换法现在学习的是第34页，共39页 在医药方面的应用在医药方面的应用化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰期。化学修饰可以提高医用酶的稳定性，延长它在体内半衰期。降低免疫原性和抗原性。降低免疫原性和抗原性。现在学习的是第35页，共39页现在学习的是第36页，共39页 在工业方面的应用在工业方面的应用提高工业酶的催化效率提高工业酶的催化效率增强工业用酶的稳定性增强工业用酶的稳定性改变酶的动力学特性：改变酶的动力学特性：最适最适pH和和Km改变改变现在学习的是第37页，共39页在抗体酶研

28、究开发方面的应用在抗体酶研究开发方面的应用抗体酶：又称催化抗体，是一类具有催化功能的抗体。抗体酶：又称催化抗体，是一类具有催化功能的抗体。是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。的属性。现在学习的是第38页，共39页抗体酶的制备抗体酶的制备诱导法诱导法 用设计好的半抗原，通过与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制用设计好的半抗原，通过与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞成抗原。然后对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。杂交，杂交细胞则分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。现在学习的是第39页，共39页