免疫分析技术 (2)精选PPT.ppt
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1、关于免疫分析技术(2)第1页,讲稿共40张,创作于星期日第一节第一节 免疫检测技术概述免疫检测技术概述v免疫检测技术起源免疫检测技术起源:检测病原微生物抗原及抗体的血清学诊断。:检测病原微生物抗原及抗体的血清学诊断。1896年年G.Widal和和A.Sicard利用伤寒病人的血清与伤寒杆利用伤寒病人的血清与伤寒杆菌发生特异性凝集的现象,有效准确地诊断伤寒。菌发生特异性凝集的现象,有效准确地诊断伤寒。v免疫分析法(免疫分析法(immunoassay,IA)是利用抗原抗体反应产生是利用抗原抗体反应产生免疫复合物的原理分析微量或超微量待测物质的一种分析手免疫复合物的原理分析微量或超微量待测物质的一种
2、分析手段,往往需要借助一种段,往往需要借助一种信号放大系统信号放大系统把抗原抗体结合的反应把抗原抗体结合的反应信息予以展现和放大。信息予以展现和放大。免疫分析技术是以抗原与抗体在体外特异性、可逆性结免疫分析技术是以抗原与抗体在体外特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。合反应为基础的分析技术。免疫分析法是将免疫反应与现代测试手段相结合而建立的超免疫分析法是将免疫反应与现代测试手段相结合而建立的超微量测定技术。微量测定技术。第2页,讲稿共40张,创作于星期日免疫分析技术的特点免疫分析技术的特点v高度的灵敏性高度的灵敏性:可检测:可检测10-1810-6级别的物质;(免级别的物质;(免疫聚合酶链反
3、应,免疫沉淀反应)疫聚合酶链反应,免疫沉淀反应)v高度的特异性高度的特异性:可区别物质间细微的差异,这是其:可区别物质间细微的差异,这是其他技术无法比拟的。他技术无法比拟的。第3页,讲稿共40张,创作于星期日样品前处理复杂样品前处理复杂操作繁琐操作繁琐需要昂贵的仪器设备需要昂贵的仪器设备检测时间长检测时间长可大大简化甚至省去复杂的可大大简化甚至省去复杂的样品前处理过程样品前处理过程操作简便操作简便无需昂贵的仪器设备无需昂贵的仪器设备快速、灵敏、特异,可短快速、灵敏、特异,可短时间检测大量样品时间检测大量样品 与目前农药残留的主要检测方法气相色谱分析法和高与目前农药残留的主要检测方法气相色谱分析
4、法和高效液相色谱法等相比,免疫分析方法具有明显优势。效液相色谱法等相比,免疫分析方法具有明显优势。GC/HPLC法法 IA分析法分析法第4页,讲稿共40张,创作于星期日免疫分析技术的分类免疫分析技术的分类v根据免疫反应的动力学类型分为:根据免疫反应的动力学类型分为:竞争反应竞争反应:标记抗原(:标记抗原(Ag*)和非标记抗原)和非标记抗原(Ag)共同竞争与抗体的反应。)共同竞争与抗体的反应。Ag(样品)(样品)+Ab AgAb Ag*(定量加入)(定量加入)+Ab *AgAb夹心反应夹心反应:将抗体、抗原和第二抗体结合在一起,:将抗体、抗原和第二抗体结合在一起,形成夹心式结合物。最终,检测夹心
5、结合物上标形成夹心式结合物。最终,检测夹心结合物上标记物,计算样品中抗原含量。记物,计算样品中抗原含量。Ab1+Ag+Ab2*Ab1-Ag-Ab1*第5页,讲稿共40张,创作于星期日免疫分析技术的分类免疫分析技术的分类v根据抗原和抗体在反应中存在方式不同分为:根据抗原和抗体在反应中存在方式不同分为:均相分析(液相免疫分析)均相分析(液相免疫分析):不需要将游离抗原:不需要将游离抗原与结合物分离,直接进行测定。与结合物分离,直接进行测定。特点特点:简单省时,:简单省时,适合于测定小分子化合物,灵敏度适合于测定小分子化合物,灵敏度10-9 g/ml;异相分析(固相免疫分析)异相分析(固相免疫分析)
6、:抗原抗体反应后,:抗原抗体反应后,将结合物与游离抗原(或抗体)及样品用常规物将结合物与游离抗原(或抗体)及样品用常规物理方法分离,然后对分离出的结合物进行检测。理方法分离,然后对分离出的结合物进行检测。特点特点:有较高灵敏度灵敏度:有较高灵敏度灵敏度10-12 g/ml,干扰少。,干扰少。第6页,讲稿共40张,创作于星期日免疫分析技术的分类免疫分析技术的分类v根据标记方法的不同分为:根据标记方法的不同分为:荧光免疫分析技术荧光免疫分析技术放射免疫分析技术放射免疫分析技术酶联免疫分析技术酶联免疫分析技术发光免疫分析技术发光免疫分析技术v免疫标记技术免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋
7、白、指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学、生物发光剂等作为追踪物,标记抗体或抗胶体金及化学、生物发光剂等作为追踪物,标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应,并借助荧光显微镜、射线测量仪、原进行的抗原抗体反应,并借助荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器,酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器,对实验结果直接进行观察或进行自动化测定。对实验结果直接进行观察或进行自动化测定。第7页,讲稿共40张,创作于星期日第二节第二节 四种常见免疫分析技术四种常见免疫分析技术第8页,讲稿共40张,创作于星期日(1)荧光免疫分析技术)荧光免疫分析技术v荧光免疫分
8、析技术是标记免疫技术中发展荧光免疫分析技术是标记免疫技术中发展最早最早的一种,的一种,是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种方法。直观性结合起来的一种方法。1941年,年,Coons首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术。术。v基本原理基本原理:荧光免疫分析法是将不影响抗原抗体活性的荧光:荧光免疫分析法是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上,与其相应的抗原(或
9、抗体)色素标记在抗体(或抗原)上,与其相应的抗原(或抗体)结合后,在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。结合后,在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。第9页,讲稿共40张,创作于星期日(1)荧光免疫分析技术)荧光免疫分析技术v荧光现象与荧光物质荧光现象与荧光物质 荧光素荧光素(fluorescein):在蓝光或紫外线照射下,发出绿色在蓝光或紫外线照射下,发出绿色荧光的一种黄色染料。用于荧光抗体技术中的荧光染料。荧光的一种黄色染料。用于荧光抗体技术中的荧光染料。常用的荧光素常用的荧光素:异硫氰酸荧光素(:异硫氰酸荧光素(FITC),四乙基罗丹明),四乙基罗丹明(RB200),四甲基异硫氰酸罗丹明
10、(),四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC),酶作用),酶作用后产生荧光的物质。后产生荧光的物质。第10页,讲稿共40张,创作于星期日(1)荧光免疫分析技术)荧光免疫分析技术v抗体的荧光素标记抗体的荧光素标记 用于标记的抗体要求:高特异性和高亲和力;不应含有针对标本中用于标记的抗体要求:高特异性和高亲和力;不应含有针对标本中正常组织的抗体;一般需经纯化提取后再作标记。正常组织的抗体;一般需经纯化提取后再作标记。作为标记的荧光素要求:具有能与作为标记的荧光素要求:具有能与Ab分子形成共价健的化学基团;分子形成共价健的化学基团;与蛋白质结合后,仍能保持较高的荧光效率;荧光色泽与背景组织与蛋白质结合后,
11、仍能保持较高的荧光效率;荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明;与的色泽对比鲜明;与Ab结合后不影响结合后不影响Ab的生化与免疫性质;标记的生化与免疫性质;标记方法简单、安全无毒;与蛋白质的结合物稳定,不易解离,易于保方法简单、安全无毒;与蛋白质的结合物稳定,不易解离,易于保存。存。第11页,讲稿共40张,创作于星期日(1)荧光免疫分析技术)荧光免疫分析技术v直接法直接法v优点优点:操作简便、特异性高、非特异:操作简便、特异性高、非特异 荧光染色因素少,荧光染色因素少,v缺点缺点:灵敏度偏低,每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体:灵敏度偏低,每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体第12页,讲稿共4
12、0张,创作于星期日(1)荧光免疫分析技术)荧光免疫分析技术v间接法间接法v优点优点:灵敏度高,在不同抗原的检测中只需应用一:灵敏度高,在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。既可检测抗原,也可检测抗体。种荧光抗体。既可检测抗原,也可检测抗体。v应用应用:常用于微生物检测,例如:沙门氏菌。:常用于微生物检测,例如:沙门氏菌。第13页,讲稿共40张,创作于星期日在医学检验中的应用在医学检验中的应用:荧光抗体技术在临床检验上已广泛用于细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的诊断等 第14页,讲稿共40张,创作于星期日荧光显微镜荧光显微镜第15页,讲稿共40张,创作于星期日(2)放射免疫分析技术)放射免
13、疫分析技术1.放射免疫分析技术(放射免疫分析技术(Radioimmunoassay,RIA)v定义:是以放射性核素为标记物的标记免疫分析方定义:是以放射性核素为标记物的标记免疫分析方法,用于定量测定受检标本中抗原。法,用于定量测定受检标本中抗原。v1959年,年,Yalow和和Berson创建的分析方法。创建的分析方法。v基本原理基本原理:第16页,讲稿共40张,创作于星期日(2)放射免疫分析技术)放射免疫分析技术2.常用标记核素:常用标记核素:125I:射线,半衰期射线,半衰期 60 天天3H:射线,半衰期射线,半衰期 12.3 年年3.测量仪器测量仪器 计数仪计数仪 液闪仪液闪仪4.优点优
14、点:检测灵敏度高,高达检测灵敏度高,高达ngpg水平水平;测定的准确性好,数量级的回收率接近测定的准确性好,数量级的回收率接近100%.5.缺点缺点:操作相对复杂,操作相对复杂,同位素半衰期短,保存及操作相对复杂。同位素半衰期短,保存及操作相对复杂。第17页,讲稿共40张,创作于星期日液闪仪液闪仪计数器计数器 第18页,讲稿共40张,创作于星期日(3)酶联免疫分析技术)酶联免疫分析技术v继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的标记免疫技术,这一技术的诞生被誉为免一大新型的标记免疫技术,这一技术的诞生被誉为免疫血清学技术的一场革命,是
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