TLC法(69页).doc

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1、-TLC法-第 67 页TLC第二部分 色谱分析第一章薄层色谱法（TLC）一 薄层色谱法概述薄层色谱法是一种基于混合物组分在固定相和流动相之间的不均匀分配或保留而将其分离的方法。与HPLC不同，TLC将固定相涂铺在栽板上，使之形成均匀的薄层。被分离的样品溶液点加在薄层板下沿的位置，再把下沿向下放入盛有流动相（深度约5mm）的密闭缸中，进行色谱展开，实现混合组分分离。被展开的组分斑点即色谱谱带，通过适当技术对色谱谱带进行处理可得到定性和定量的检测结果。薄层色谱法具有技术比较简单，操作容易，分析速度快，高分辨能力，结果直观，不需昂贵仪器设备就可以分离较复杂混合物等特点。二 薄层色谱法中的薄层板、薄

2、层板的涂铺、点样和展开（一）薄层板TLC分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质。可通过改变涂层材料的化学组成或对材料表面进行化学改性来实现改变薄层色谱分离的选择性。此外，固定相的物理性质，如比表面积、比空容、平均孔径等也对其色谱行为产生影响。（1）载体 对TLC载体的基本要求为：机械强度好、化学惰性好（对溶剂、显色剂等）、耐一定温度、表面平整、厚度均匀、价格适宜。（2）固定相 TLC固定相包括改性固定相和未改性固定相两类。硅胶和氧化铝是最常用的两种未改性固定相。（3）粘合剂 在制备薄层板时，一般需在吸附剂中加入适量粘合剂，其目的是使吸附剂颗粒之间相互粘附并使吸附剂薄层紧密的附

3、着在载板上。常用的粘合剂可分为无机粘合剂和有机粘合剂两类。（4）荧光指示剂 荧光指示剂是便于在薄层色谱图上对一些基本化合物斑点（无颜色斑点、无特征紫外吸收斑点）定位的试剂。加入荧光指示剂后，可以使这些化合物斑点在激发光波照射下显出清晰的荧光，便于检测。（二）薄层板的涂铺涂板方法可以分为涂布法、倾注法、喷洒法及浸渍法四类，其中涂布法是应用最广泛的涂板方法。TLC固定相薄层涂铺大多采用湿法匀浆，要求薄层均匀、平整、无气泡、不易造成凹坑和龟裂。薄层板活化处理可以获得适宜活性，提高色谱分离效率和选择性。（三）点样点样是TLC分离和精确定量的关键。不同种类的样品常需选用不同的配样溶剂，一般采用易挥发的非

4、极性或弱极性溶剂配样。离子型化合物样品，常需先衍生化成在挥发性强、极性小的溶剂中易溶解的样品衍生物。最适合点样的样品浓度应为（15）gL-1，点样体积视点样技术不同而异。TLC定量分析时，样品量的适宜范围为最小检出量的几倍至几十倍。样品原点一般在1mm左右为佳，原点过大或样品量过大，会导致分离变坏。点样步骤一般占TLC全部分析时间的三分之一左右，所以使点样仪器化、自动化，既快又准，获得好的重复性，是TLC工作者所期盼的。（四）展开TLC展开就是流动相沿薄层（固定相）运动，以实现样品混合组分分离的过程。这一过程需在具有一定形状的展开室中进行。薄层展开有三种形式，直线式展开方式为实际应用中使用最普

5、遍的展开方式。三 薄层色谱流动相与展开机制（一）对流动相溶剂选择的基本考虑薄层色谱溶剂的选择对分离的影响很大。与HPLC同理，对复杂样品的分离能否得到理想的结果，流动相的选择是最重要的因素之一，不同溶质与流动相分子、固定相分子间的作用力不同，因此其移动速度也不同，最终导致样品中各组分的分离。对流动相的选择不仅需考虑极性、选择性等因素，更基本的应注意以下因素的影响：(1)溶剂纯度，含有杂质影响分离。(2)溶剂吸收环境水分，会使极性等性质改变。(3)存放条件不适宜或贮存时间过长，溶剂会变性。(4)混合流动相之间发生作用会使溶剂性质改变。溶剂极易挥发，流动相组成随时改变。（二）几种常用薄层色谱分离模

6、式的展开机制在TLC分离中，液固展开是一种最经典的展开方式。液固展开常用极性吸附硅胶、氧化铝作固定相。流动相依其极性可在吸附剂表面形成单分子或双分子溶剂吸附层，展开过程中，组分的保留及分离选择性主要有以下三种因素决定：a. 溶剂对样品的溶解能力；b. 溶质和流动相分子对固定相表面活性吸附位点的竞争；c. 溶质分子与吸附剂表面上吸附中心间的特殊作用力。与液液分配柱色谱分配机理相同，组分在互不相溶的两液相中的溶解度不同，因此迁移速率存在差异，在迁移过程中得到分离。除以上两种展开机制外，还有化学键合相展开和离子交换展开。四 薄层色谱吸附剂与载体的选择1.薄层色谱对吸附剂的要求为：1.具有大的表面积与

7、足够的吸附能力；2.对不同的组分有不同的吸附性，因而能较好的分离不同的化学组分；3.在所用的溶剂和展开剂中不溶解；4.不与试样中各组分、溶剂和展开剂起化学反应或破坏、分解作用5.颗粒均匀、在使用过程中不会碎裂6.具有可逆的吸附性，既能吸附样品组分，又易于解吸；7.为便于观察分离结果，最好是白色固体。2.分配色谱对所用载体的要求为：a.表面积大；b.在展开剂中不溶解，与展开剂和样品组成不起化学反应或分解作用；c.对样品组分无吸附性或吸附性极弱；d.对固体液是惰性的。五 薄层色谱扫描仪（一）仪器结构 TLC扫描仪结构主要包括光学元件组合系统、电子元件组合系统及机械元件组合系统。（二）主要功能薄层色

8、谱扫描仪主要用于TLC图被分离斑点和薄层空白的光学相应信号测量。要求仪器光源稳定，光波单色性能好，光波长在（200800nm）检测器灵敏度高。六 薄层色谱定性定量方法（一）斑点定位斑点定位必须采用非破坏性方法。当斑点紫外光显示时，可采用长波长和短波长紫外灯，使用方便、灵活。采用化学试剂显色时，通过手动或电动喷雾器向展开好的薄层板喷洒显色试剂。（二）定性方法在特定的色谱系统中，化合物的Rf值一定，比较未知物和标准物的Rf值，能够作为鉴定未知物的依据。Rf值的准确测定受多方面因素影响，为了增加Rf值定性的可靠性，必须通过改变色谱系统的选择性，重复测定同一化合物的Rf值。如果在分离机理不同的色谱体系

9、中，比较Rf值仍能得到肯定的结果，那么其可靠性将更大。板上化学反应定性主要有以下两种方式：a. 反应后生成特征颜色的化合物，借以鉴定反应物；b. 反应后生成复杂的、无法鉴定组分的混和物，但可根据生成物的“指纹”特征加以鉴定；c. 除以上两种定性反方法外，还有板上光谱定性、TLC与其他联用技术间接联用定性、薄层色谱傅里叶变换红外光谱联用定性以及薄层色谱质谱联用定性。（三） 定量方法间接定量法就是将TLC已分离的物质斑点洗脱下来，再采用其他方法对该洗脱液进行定量分析。TLC间接定量的关键是斑点组分的定量洗脱。选用怎样的洗脱方法，取决于，组分和薄层吸附剂的性质。用来洗脱组分斑点的溶剂，对下一步定量方

10、法应无影响。a. 分光光度法 将下来的洗脱液配制成标准体积，再同样条件下对样品和标准液进行吸光值测量。b. HPLC法 以TLC法斑点洗脱液直接作HPLC分离和定量c. GC法 以TLC法斑点洗脱液直接作GC分离和定量。d. 质谱法 采用组分质谱图中的特征离子峰可进行定量。a. 斑点面积测量法 以半透明纸扫下TLC图上的斑点界限，然后测量其面积。将斑点面积同平行操作的标准样面积相比较进行定量。b. 目测法 将被测样品和系列溶液点在同一薄层板上，展开后用适当方法显色，可以得到系列斑点，将被测样品的斑点面积大小和颜色与标准系列的斑点相比较，可推测出样品的含量范围。这种定量法非常适用于对常规大量样品

11、的重复分析。七 应用实例TLC测定黄曲霉毒素B1 （一）、原理根据黄曲霉毒素B1能在波长365毫微米紫外光下产生蓝紫色荧光的特性，采取薄层层析法，将样品经提取、浓缩、薄层分离后，利用其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定其含量。（二）、试剂1.石油醚：沸程 30607.无水乙醚：如不是无水乙醚，则应脱水后再用。10.硅胶G：薄层层析用11.苯乙腈混合液：取苯98毫升，乙腈2毫升，混匀冰箱存放备用。13.黄曲霉毒素消毒剂：5次氯酸钠溶液，取100克漂粉精，加入500毫升水，搅匀，另溶解70克碳酸钠（Na2Co3、H2O）于500毫升温水中，溶后，倒入上述溶液中搅匀、澄清、过滤、备用。标准储备液（1

12、.02微克/毫升）：GBW(E)090015严格控制、应加锁于冰箱中避光存放。（每次记录用量、余量，以备复查）。稀释液（0.2微克/毫升）取储备液加苯乙腈混合液稀释。稀释液（0.04微克/毫升）取稀释液1毫升以苯乙腈混合液稀释。（三）、仪器5.薄层板涂布器（可以自制）6.玻璃板：520厘米7.展开槽：（层析）内长25厘米，宽6厘米，高4厘米8.110毫升刻度吸管9.紫外光灯：365nm，220v，125w，启动电流10.微量进样器：20微升，10微升11.分液漏斗：125毫升12.蒸发器：60毫升14.样液瓶：具塞2毫升15.脱脂棉：在索氏脂肪提取器以氯仿提取2小时挥干备用（四）、操作方法适用

13、于大米、玉米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等。称取经过粉碎（20目筛）的样品20克于250毫升具塞三角烧瓶中，加正已烷30毫升，甲醇水（5545）100毫升，加塞后加水少许，盖严防漏，振荡30分钟，静置片刻，以脱脂棉过滤于分液漏斗中，待分层，放出下层的甲醇水溶液20毫升（相当于样品4克）于另一分漏斗中，加氯仿20毫升，振摇二分钟，静止分层。另备一漏斗底部铺脱脂棉少许，再加无水硫酸钠10克，下接60毫升蒸发皿，漏斗中的无水硫酸钠先用氯仿湿润。将分层后的氯仿放入已备好的具有无水硫酸钠的漏斗中，过滤，再加5毫升氯仿于分液漏斗中，分层后一并滤于同一蒸发皿中，最后用少量氯仿洗涤滤器，洗液并入以上

14、蒸发皿中。将蒸发皿放入通风橱内于65水浴上通风挥干，然后放在水浴上冷却23分钟，准确加入苯乙腈1毫升。用带橡皮头的滴管的尖端将残渣充分混合，若有结晶析出（苯），将蒸发皿从水浴上取下，继续溶解，混合，晶体消失，再用此管吸取上清液，转移于2毫升样液瓶中，若溶液不够澄清，应离心，或放置等候澄清，取上清液供薄层点板用。注加入氯仿振摇2分钟如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层或用电吹风机吹热风促使分层。含油脂较多的样品如花生等也可采用脱油提取，即称取粉碎样品20克移于滤纸筒内，筒内塞以少量脱脂棉，置于250毫升脂肪提取器内，在7585水浴上以石油醚提取脱油8小时，然后将滤纸筒挥干。将脱油后的样品移于250

15、毫升具塞三角烧瓶内，进行检验。如样品是玉米、大米、小麦时亦可采用下法提取：称取粉碎过筛样品20克于250毫升具塞三角烧瓶内，用滴管滴加6毫升水，使样品湿润，并准确加入氯仿60毫升，振荡30分，加无水硫酸钠12克，振摇静止30分；以脱脂棉过滤取滤液12毫升（相当于样品4克）于蒸发皿，以下步骤与同。适用于花生油、香油、芽籽油等。称取样品4克于小烧杯中，用正已烷20毫升转移于125毫升分液漏斗中，再用甲醇水（55+45）20毫升分数次洗涤小烧杯，洗液一并移入分液漏斗中，振摇2分钟，静止分层后，将下层甲醇水溶液移于第二个分液漏斗中，原分液漏斗中再加甲醇水5毫升，振荡提取一次，甲醇水溶液一并移入第二个分

16、液漏斗中，在第二个分液漏斗中加入氯仿20毫升，振摇二分静止分层以后按操作。适用于酱油、醋，方法有二：第一法：称取样品10克于小烧杯中，为防止提取时乳化，加氯化钠4克，移于分液漏斗中，烧杯用氯仿15毫升分次洗涤，洗液一并移于分液漏斗中，以下自振摇2分钟，静止分层后按第操作。最后加入2.5毫升苯乙腈溶解，此液每毫升相当于样品4克。第二法：称取样品10克移于分液漏斗中，加甲醇12毫升（以酱油代替水，故甲醇与水体积比仍约为55+45）加氯仿20毫升提取，以下自振摇2分钟起，按操作，最后加苯乙腈2.5毫升，每毫升相当于样品4克。适用于酱类（包括豆乳制品）称取样品20克于250毫升具塞三角烧瓶中，加正已烷

17、20毫升与甲醇水50毫升，振荡30分钟，静止片刻，以脱脂棉过滤，滤液静止分层后，取甲醇水24毫升于分液漏斗中加入氯仿20毫升振荡2分静止分层下以按操作，最后加入苯乙腈2毫升，每毫升相当于样品4克。注：以上检品极易乳化，实在分不开层时，可采用离心分层的办法。适用于发酵酒类称取样品10克于小烧杯中，以氯仿15毫升分次洗于分液漏斗中，振摇2分钟，静置分层后按操作，最后加入苯乙腈2.5毫升，此溶液每毫升相当于样品4克。适用发酵用曲种及菌株称取样品10克于具塞三角烧瓶中，加入正已烷30毫升与甲醇水（55+45）80毫升，振荡半小时，用脱脂棉过滤于分液漏斗中，取出甲醇水溶液32毫升（相当于样品4克）于另一

18、分液漏斗中，加入30毫升氯仿提取。振摇2分静止分层。以下按操作。（1）单向展开法a.薄层板的制备：一般现在用成品硅胶板。如需自己制板，方法如下：称取硅胶G约3克（或称取硅胶85克与石膏粉15克，充分混合均匀后称取3克）加相当于硅胶23倍的水在玻璃乳钵中研磨12分钟，至成均匀的糊状后立即倒入涂布器内，推成512厘米，厚约的薄层板3块。在空气中干燥15分钟后，放入烘箱内100活化2小时取出放入干燥器内保存，一般在干燥器内可保存23天，若放置时间较长，则应重新活化。b.点样将薄层板边缘上附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3厘米的基线上，用进样器滴加样液，一块可以滴加四个点，点距边缘和点间距离约为1厘米

19、，点直径应掌握在3毫米以内为好，在同一板上滴加的点应大小一致，在滴加样液的时候，可以吹风机吹冷风边吹边点。滴加试样如下：第一点：黄曲霉毒素标准液（0.04微克/毫升）10微升。第二点：样液20微升（如样液8克/毫升）时也可点10微升。第三点：样液20微升加黄曲霉毒素B1标准液（0.04微克/毫升）10微升。第四点：样液20微升加黄曲霉毒素B1标准液（0.2微克/毫升）10微升。在展开槽（层析槽）内加无水乙醚10毫升，予展12厘米，取出挥干，再于另一展开槽内加丙酮氯仿液（8+92）展开1012厘米取出在紫外光（365毫微米）下观察，结果如下：样液点上加黄曲霉毒素B1标准溶液，可使黄曲霉毒素B1标

20、准点与样液中的黄曲霉毒素B1萤光点重叠。如样液为阴性，薄层板上的第三点黄曲霉毒素B1为0.0004微克，可用作检查在样液内黄曲霉毒素B1最低检出量是否正常出现；如为阳性，则起定位作用，薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B1为0.002微克，主要起定位作用，若第二点在与黄曲霉毒素B1标准点的相应位置上，无蓝色荧光点，表示样品中黄曲霉毒素B1含量在5微克/公斤以下，如在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需要确证试验。为了证实薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的，滴加三氟乙酸产生黄曲霉毒素B1的衍生物，展开后，这种衍生物的比移值，约在0.1左右。其方法是：在薄层板左边依次滴加两个点：第一点：样液20微升。第

21、二点：黄曲霉毒素B1标准溶液（0.2微克/毫升）10微升，以上两点各加三氟醋酸一小滴盖于样点上，反应五分钟后，用吹风机吹热风2分钟，使热风吹到薄层板上的温度不高于40，再于薄层板上滴加2个点。第三点：样液20微升。第四点：黄曲霉毒素B1标准溶液（0.2微克/毫升）10微升。再展开同前，在紫外灯光下，观察样液是否产生与黄曲霉毒素B1相同的衍生物，未加三氟乙酸与3、4两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。样液中的黄曲霉毒素B1荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素B1标准点的最低检出量（0.0004微克）的荧光强度一致，则样品中的黄曲霉毒素定量即为5微克/公斤，如样品中的荧光强度比最低检量强，则根据

22、强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后，再滴加不同的微升数，如10微升、15微升，直至样液点的荧光强度与最低检出量点的荧光强度一致为止。滴加试样如下：第一点：黄曲霉毒素标准液（0.04微克/毫升）第二点第三点 根据情况滴加样液第四点（五）、结果计算黄曲霉毒素B1（微克/公斤）式中：V1加入苯乙腈混合液的毫升数，毫升；V2出现最低荧光时滴加样液的毫升数，毫升；D1样液的总稀释倍数；W1苯乙腈溶解时相当试样重量克数，克；黄曲霉毒素B1的最低检出量，微克。如用单向展开法展开后，薄层板上由于杂质的干扰，掩盖了黄曲霉毒素B1的荧光强度时，需采用双向展开法。薄层板先用无水乙醚作横向展开，把干扰的杂质推到样液

23、点的旁边，而黄曲霉毒素B1不动，然后再用丙酮氯仿混合液进行纵展，这样试样里在黄曲霉毒素B1相应处的杂质的颜色将大量减少，因而就提高了方法的灵敏度，如用双向展开法中的滴加两点法展开后仍有杂质时则可改用滴加一点法，现将两种方法分别介绍于后面。首先是滴样，取薄层板三块，在距下端三厘米基线上滴加黄曲霉毒素B1标准溶液与样液，其具体作法是：在三块板距左边缘处各滴加黄曲霉毒素B1标准溶液（0.04微克/毫升）10微升，在距左边缘各滴加样液20微升；然后在第二块板的样液点上加黄曲霉毒素B1标准溶液（0.04微克/毫升）10微升。在第三块板的样液点上加滴黄曲霉毒素B1标准溶液（0.2微克/毫升）10微升。第二

24、步展开。先进行横展，在展开槽内的长边置一玻璃支架，加无水乙醚10毫升，将点好的板靠标准点的长边置于层析槽内展开，展至板端后继续展开1分钟，取出挥干再进行纵展。挥干的薄层板以丙酮氯仿（8+92）展开至12厘米为止（丙酮、氯仿比例也可根据不同条件自行调节）。然后进行观察和评定结果。在紫外灯光下，观察第一、二板，若第二板的第二点在B1标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在第二板的相同位置上未出现荧光点，则试样中黄曲霉毒素B1含量在5微克/公斤以下。若第一板与第二板的相同位置上出现荧光点，则将第一板与第三板比较，看第三板上第二点与第一板上第二点的相同位置的荧光点是与B1的标准重叠，如果重叠，再进行以

25、下衍生物确证试验。在具体测定中第一、二、三板可以同时作，亦可按照顺序作，当第一板出现阴性时第三板可以省略。如第一板为阳性，第二板可省略，直接作第三板。如果需要作确证试验，于第四、五两板距边缘处各滴加B1标准液（0.2微克/毫升）10微升，再于其上滴加三氟醋酸一小滴，距左边缘处，第四板滴加样液20微升，三氟醋酸一小滴，第五板滴加样液20微升，黄曲霉毒素标准溶液（0.2微克/毫升）10微升，三氟乙醋一小滴，产生衍生物的步骤同单相展开法。再用双向展开法，展开后，观察样液点是否产生与B1标准点重叠的产物，观察时可将第一板作为样液的衍生物后的板。如样液黄曲霉毒素B1含量高时，则将样液稀释后，按单向展开法

26、D项作确证试验。并按照单向展开法进行稀释定量，如含毒素低稀释倍数小，在定量的纵板上仍有干扰，并影响结果判断，可将板上需要判断的样液点再分别作双向展开观察，以确定含量，结果计算，同单向展开法。B.滴加一点法（多用于杂质干扰严重的样液）滴样：取薄层板三块，在距下缘3厘米的基线上滴加黄曲霉毒素B1标准液与样液。作法是在三块板的左边缘处各滴加样液20微升。第二板的点上滴加黄曲霉毒素B1标准液（0.04微克/毫升）10微升，在第三板的点上滴加黄曲霉毒素B1标准溶液（0.2微克/毫升）10微升。展开：同滴加两点中的横展和纵向展开。观察与评定结果：在紫外光灯下，观察一、二板，如第二板出现最低检出量的B1标准

27、点，而第一板与其相同位置未出现荧光点，样品中黄曲霉毒素B1含量在5微克/公斤以下，如第一板在与第二板B1标点相同位置出现荧光点，则应将第一板与第二板比较，看第三板上与第一板相同位置的荧光点，是否与B1标准点重叠，如果重叠，再进行确证试验。滴加以下二板，距左边缘处第四板滴加样液20微升，三氟醋酸一小滴，第五板滴加样液20微升，黄曲霉毒素B1标准液（0.2微克/毫升）10微升及三氟醋酸一小滴，产生衍生物的步骤同单向展开法，再用双向展开法展开后，将以上两板在此外光灯下观察，以确定样液是否产生与黄曲霉毒素B1标准点重叠的衍生物，观察时可将第一板作为样液的衍生物空白板。经过以上确证试验定为阳性后，再进行

28、稀释定量。如含黄曲霉毒素B1低不需稀释或稀释倍数小，杂质仍有严重干扰，可根据样液中黄曲霉毒素B1荧光的强弱，直接用双向展开法定量。或者与单向展开法结合使用，方法同上。其计算同单向展开法。注意事项：（1）黄曲霉菌所产生的代谢产物，具有较强毒性，自然界中易被污染的有玉米、花生等，其中以黄曲霉毒素B1最多，B2、G1、G2较少。故我们一般仅作黄曲霉毒素B1测定。在测定中黄曲霉毒素高的霉粒，一粒就可以左右测定结果，而有毒霉粒在整个检品中占比例是小的，而分布又不均匀，为避免采样带来的误差，取样量应尽量多一些，（1000克）并将取样充分均合尽多的粉碎，使尽量取得相对可靠一些的结果，因而在取样时应注意：根据

29、规定检取有代表性样品。对局部霉变样，应单独取样检验。每份分析测定用样品，应将大样经粗碎后连续多次用四分法分样至12斤再全部粉碎粮食样品，通过20目筛，花生不易过筛。但应磨到一定程度并充分混合均匀。（2）据以上实验条件黄曲霉毒素B1的最低检出量是0.0004微克，方法的灵敏度为5微克/公斤，回收率约为75以上。（3）展开剂丙酮与氯仿比例可随比移值大小，与分离情况而调节，如果比移值太大，可减少丙酮体积反之则增加。（4）对杂质少含毒量又高的样品可不予展，直接用丙氯液（8+92）展开。（5）在气候潮湿的条件下，薄层板的活性容易降低，影响检出量，因此在使用薄层板时，当日活化为好，滴加样液和标准液时，可将

30、板放在盛有干燥剂（硅胶）的层析槽内进行。（6）玉米、大米、小麦、面粉、花生等试样按方法提取后，用上述单向展开法测定，薯干用双向展开法测定。（7）在具体测定条件下，有时用无水乙醚作薄层板的横展后，标准B1点仍有稍微移动，这并不影响测定结果。（8）在80200目硅胶中加热盐酸水溶液（1+4）浸没硅胶，搅拌15分钟后，倾去上液，再用水洗至无氯离子为止，于100干燥，磨碎，过250目筛，此种硅胶的性能较为满意。于空白样液点上滴加黄曲霉毒素B1最低检出量时，经展开后，能使黄曲霉毒素B1点与杂质分离，没有拖尾现象，而且在暗的条件下，其点形十几小时内不消失。第二章气相色谱法一 气相色谱法概述色谱或层析是一种

31、分离技术，色谱法是利用色谱技术进行分离分析的方法。最早色谱法是由俄国植物学家茨维特于1906年首先提出来的。他把植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙吸附剂的直立玻璃管内，再加入石油醚使其自由流出，结果不同色素组分相互分离而形成不同颜色的谱带，由此得名为“色谱“。该法后来虽广泛用于无色物质的分离，但“色谱“一词却被沿袭使用.流动相为气体的色谱方法称为气相色谱法。二 气相色谱法的基本原理和气相色谱术语1色谱过程气相色谱对多组分的分离依赖于核心装置色谱柱。色谱柱主要分为两种类型，填充柱与毛细管柱，其内均填充具有一定特性的固定相物质。色谱分离过程实际上是不同组分与固定相和流动想（载气）发生相互作用的结

32、果。现以填充柱中的两类固定相为例说明气-固色谱分离的原理。其固定相是一种具有较大面积的多孔性的颗粒吸附剂。试样被载气带进柱子里。立即被这种颗粒吸附剂所吸附。载气不断流过颗粒时，被吸附的组分又被洗脱下来。洗脱的组分随着载气继续前进时，又可被前面的吸附颗粒所吸附。随着载气的流动，被测组分在吸附剂表面进行反复的吸附洗脱。由于被测物质中各个组分的性质不同，他们在吸附剂上的吸附能力就不一样，较难被吸附的组分就容易被洗脱，较快地移向前面。容易被吸附的组分就不易被洗脱，向前移动地慢些。经过一定时间，试样中的各个组分就彼此分离而先后流出色谱柱。2气相色谱术语试样中各组分经色谱柱分离后，经检测、记录仪得到反映组

33、分浓度信号与流出时间关系流出曲线色谱图。色谱法的测定结果是通过对色谱图的分析完成的。1关于基线a基线当色谱过程没有组分进入检测器，在实验操作条件下，反映检测器系统噪声随时间变化的记录线称为基线。稳定的基线是一条直线。b基线漂移指基线随时间定向的缓慢变化。c基线噪声指由各种因素所引起的基线起伏。2保留值表示各组分在色谱柱中的滞留时间的数值。通常用时间来表示。a死时间（tM）指不被固定相吸附或溶解的气体，从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需要的时间。b保留时间（tR）指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需要的时间。c调整保留时间（tR）指扣除死时间后的保留时间。tR=tR-tMd相对保留时

34、间（r12）指某组分1的调整保留时间与另一组分2的调整保留时间之比。r12= tR2/tR13色谱峰区域宽度色谱流出曲线中一个重要参数.从色谱分离角度看,希望区域宽度越窄越好.通常度量色谱峰区域宽度有两种方法：a半峰宽度(Wh/2)又称半宽度或区域宽度,即峰高一半处的宽度。b峰底宽度(W)自色谱峰两侧的转折点所作的切线在基线上的截距。三 气相色谱仪器结构气相色谱法是采用惰性气体（或称载气）作为流动相的色谱方法。色谱过程是通过气相色谱仪来完成的。气相色谱仪一般有5个基本部分组成：1 气路系统 包括载气、燃烧气、助燃气、气体净化器流速控制和测量器2 进样系统 进样器、气化室；温度控制装置3 分离系

35、统 色谱柱和柱箱、柱温控制装置4 检测系统 检测器、检测器的电源及控温装置5 记录系统 放大器、记录仪以及数据处理装置四 气相色谱法的特点和适用范围（一）气相色谱法的特点气相色谱法具有人们公认的优点、特点：1分离效率高，分析速度快2选择性能好3样品用量少和检测灵敏度高4操作简单，费用低少，应用广泛（二）气相色谱法的适用范围气相色谱分析操作简单，分析快速，选择性好，柱效能高，可以应用于分析气体试样，也可以分析易挥发或可转化为易挥发的液体和固体，不仅可分析有机物，也可分析部分无机物。一般，只要沸点在500oC以下，热稳定性良好，相对分子质量在400以下的物质，原则上都可采用气相色谱法。目前气相色谱

36、法所能分析的有机物，约占全部有机物的15%20%，而这些有机物都是目前应用很广的那一部分，因而气相色谱法的应用是十分广泛的。五 气相色谱条件的选择（一）一般选择载气的依据及气相色谱常用的载气作为气相色谱载气的气体，要求要化学稳定性好；纯度高；价格便宜并易取得；能适合于所用的检测器。常用的载气有氢气、氮气、氩气、氦气、二氧化碳气等等。（二）载气的净化所谓净化，就是除去载气中的一些有机物、微量氧，水分等杂质，以提高载气的纯度。不纯净的气体作载气，可导致柱失效，样品变化，氢焰色谱可导致基流噪音增大，热导色谱可导致鉴定器线性变劣等，所以载气必须经过净化。一般均采用化学处理的方法除氧，如用活性铜除氧；采

37、用分子筛、活性碳等吸附剂除有机杂质；采用矽胶，分子筛等吸附剂除水分。（三）试样的进样方法色谱分离要求在最短的时间内，以“塞子”形式打进一定量的试样，进样方法可分为：、气体试样：大致进样方法有四种：（）注射器进样，（）量管进样，（）定体积进样，（）气体自动进样。一般常用注射器进样及气体自动进样。注射器进样的优点是使用灵活，方法简便，但进样量重复性较差。气体自动进样是用定量阀进样，重复性好，且可自动操作。、液体试样：一般用微量注射器进样，方法简便，进样迅速。也可采用定量自动进样，此法进行重复性良好。、固体试样：通常用溶剂将试样溶解，然后采用和液体进样同样方法进样。也有用固体进样器进样的。（四）在气

38、相色谱分析中柱长、柱内径、柱温、载气流速、固定相、进样等操作条件对分离的影响操作条件对于色谱分离有很大影响。、柱长，柱内径：一般讲，柱管增长，可改善分离能力，短则组分馏出的快些；柱内径小分离效果好，柱内径大处理量大，但柱内径过大，将导致担体不能均匀地分布在色谱柱中。分析用柱管一般内径为毫米，柱长为米。 、柱温：是一个重要的操作变数，直接影响分离效能和分析速度。选择柱温的根据是混合物的沸点范围，固定液的配比和鉴定器的灵敏度。提高柱温可缩短分析时间；降低柱温可使色谱柱选择性增大，有利于组分的分离和色谱柱稳定性提高，柱寿命延长。一般采用等于或高于数十度于样品的平均沸点的柱温为较合适，对易挥发样用低柱

39、温，不易挥发的样品采用高柱温。 、载气流速：载气流速是决定色谱分离的重要原因之一。一般讲流速高色谱峰狭，反之则宽些，但流速过高或过低对分离都有不利的影响。流速要求要平稳，常用的流速范围每分钟在亳升之间。 、固定相：固定相是由固体吸附剂或涂有固定液的担体构成。 （）固体吸附剂或担体粗细：一般采用目、目、目。当用同等长度的柱子，颗粒细的分离效率就要比粗的好些。 （）固定液含量：固定液含量对分离效率的影响很大，它与担体的重量比一般用。比例过大有损于分离，比例过小会使色谱峰拖尾。 、进样：一般讲进样快，进样量小，进样温度高其分离效果好。对进液体样，速度要快，汽化温度要高于样品中高沸点组分的沸点值，一次

40、汽化，保证色谱峰形不致展宽、使柱效高。当进样量在一定限度时，色谱峰的半峰宽是不变的。若进样量过多就会造成色谱柱超载。一般讲柱长增加四倍，样品的许可量增加一倍。对于常规分析，液体进样量为微升；气体进样量为.毫升。（五）色谱柱管材料选择原则及常用的柱管材质 对色谱柱管材质，应按如下要求选择： 、应与固定相、试样、载气不起化学反应。 、要易于加工成型。 、管内壁应光滑，横截面应均匀呈圆形。一般色谱柱管形状呈型或螺旋形，大多由铜、不锈钢，玻璃等材质制成。（六）新的色谱柱管（铜或不锈钢管）应处理后方能使用新柱管应先用稀酸或稀碱（：盐酸或氢氧化钠）洗涤，以除去油污等脏垢，而后用自来水冲洗,继而用蒸馏水冲洗

41、至中性，再用干净的空气吹洗并烘干后，即可使用了。（七）对担体的要求 担体是一种多孔性化学惰性固体，在气相色谱中用来支撑固定液。对担体有如下几点要求： 、表面积较大，一般应在.米2 克之间； 、具有化学惰性和热稳定性； 、有一定的机械强度，使涂渍和填充过程不引起粉碎； 、有适当的孔隙结构，利于两相间快速传质； 、能制成均匀的球状颗粒，利于气相渗透和填充均匀性好； 、有很好的浸润性，便于固定液的均匀分布。完全满足上述要求的担体是困难的，人们在实践中只能找出性能比较优良的担体。（八）担体分类及其特点 通常分为硅藻土和非硅藻土两大类，每一类又有种种小类。 、硅藻土类型： （）白色的：表面积小，疏松，质

42、脆，吸附性能小，经适当处理，可分析强极性组分； （）红色的：有较大的表面积和较好的机械强度，但吸附性较大。 2、非硅藻土类型： （）氟担体：表面惰性好，可用来分析高极性和腐蚀性物质，但装柱不易，柱效率低些。 （）玻璃微球：表面积小，用它做担体柱温可以大大降低，而分离完全且快速。但涂渍困难，柱效低。 （）多孔性高聚物小球：机械强度高，热稳定性好，吸附性低，耐腐蚀，分离效率高，是一种性能优良的新型色谱固定相。 （）炭分子筛：中性，表面积大，强度高，祛寿命长，在微量分析上有无比的优越性。 （）活性炭：可以单独做为固定相。 （）沙：主要用于分离金属。（九）常用的担体担体：为白色硅藻土担体；担体：为白色

43、硅藻土担体；celite545：为白色硅藻土担体；担体：为红色硅藻土担体； 担体：为红色硅藻土担体；保温砖：为红色硅藻土担体；chromosorb：为红色硅藻土担体。（十）担体进行处理的一般方法常用的担体表面并非惰性，它具有不同程度的催化作用和吸附性（特别是固定液含量低时和分离极性物质时）造成峰拖尾和柱效下降，保留值改变等影响，因而需要预处理。现将一般处理方法简述如下： 、酸洗法：用浓盐酸加热处理担体分钟，然后用自来水冲洗至中性，再用甲醇漂洗，烘干备用。此法主要除去担体表面的铁等无机物杂质。 、碱洗法：用的氢氧化钠或的氢氧化钾甲醇溶液浸泡或回流担体，然后用水冲洗至中性，再用甲醇漂洗，烘干备用。

44、碱洗的目的是除去表面的三氧化二铝等酸性作用点，但往往在表面上残留微量的游离碱，它能分解或吸附一些非碱性物质，使用时要注意。 、硅烷化：用硅烷化试剂和担体表面的硅醇、硅醚基团起反应，除去表面的氢键结合能力，可以改进担体的性能。常用的硅烷化试剂有二甲基二氯硅烷和六甲基二硅胺。 、釉化：把欲处理的担体在、的碳酸钠碳酸钾（：）水溶液中浸泡一天，烘干后先在度下煅烧、小时，然后升温到度煅烧约分钟。经过这样处理，担体表面形成一层玻璃化的釉质，故称“釉化担体”。这种担体的吸附性能小，强度大，当固定液中加入少量的去尾剂后，能分析如醇、酸等极性较强的物质。但对非极性物质柱效能则稍有下降。此外甲醇和甲酸等物质在釉化

45、担体上有一定的不可逆化学吸附，在定量分析时应予以注意。、其他纯化方法：凡是用化学反应来除去活性作用点或用物理复盖以达到纯化担体表面性质的方法都可以使用。（十一）常用的担体目数常用的毫米内径的色谱柱：对于较长色谱柱，选用担体目数一般为目；对于较短色谱柱选用担体目数一般为目(每英寸内的筛孔数目为目)。（十二）常用担体的选择 各种担体，名目繁多。在常用硅藻土担体中: 红色担体（如、），可用于非极性或弱极性物质的分离。 白色担体（如）可用于极性物质或碱性物质。 釉化红色担体（如）可用于中等极性物质。 硅烷化白色担体可用于强极性氢键型物质如废水测定。 分离酸性物质，如酚类，要用酸洗处理的担体。 分离碱性

46、物质，如乙醇胺，要用碱洗处理的担体。 微量分析要用硅烷化的担体。 有些特殊的情况下要用特殊的担体，如氟担体分离异氰酸酯类。但是在普通的常量分析中，对担体可以不必过份讲究，甚至如耐火砖粉粒，玻璃珠砂和海沙也可以使用。（十三）固体固定相分类 指直接装填到色谱柱中作为固定相的具有活性的多孔性固体物质。固体固定相大体可分为三类： 第一类是吸附剂。如：分子筛、硅胶、活性炭、氧化铝等； 第二类是高分子聚合物。如国内的型高分子多孔微球，国外orapak系列等； 第三类是化学键合固定相。在气相色谱中，通常是将固定液涂敷在载体表面上。采用化学键合固定相分析极性或非极性物质通常都能够得到对称峰，柱效很高，固定相的热稳定性也有所改善。 （十四）对固定液有要求 一般是一种高沸点的有机物的液膜，通过对不同组份的不同分子间的作用，使组份在色谱柱中得到分离。对气相色谱用的固定液，一