缓冲液的配制(8页).doc

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1、-缓冲液的配制-第 8 页Elisa 相关试剂的配制 1、 抗体或免疫球蛋白稀释液0.01mol/L pH7.2PBS NaH2PO42H2O 0.39克；Na2HPO41.27克； NaCl0.85克； NaN3200 mg； H2O（蒸馏水） 至 1000ml 2、ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液PH7.4，PBST NaCl2.0克； KH2PO40.2克； Na2HPO412H2O 2.9克； KCl0.2克； NaN30.2克； H2O至 1000ml 吐温（Tween）20 0.5ml； 4C保存备用 3、 包被液（简称CB）pH9.6 Na2CO31.59克； NaHCO32

2、.93克； NaN30.2克 ；H2O至1000ml 密封盖好，4C存放备用 4、ELISA底物液（可溶性底物）磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.0 0.1mol/L柠檬酸（21.014克/100ML）24.3ml；0.2mol/LNa2HPO4（28.4克/L)25.7ml；H2O50ml；4C存放备用5、DAB底物液（不溶性底物，组化病理等） 0.05mol/L pH7.6 tris-HCL Tris 6.05克；HCL(36%) 3.15克（约2.7ml浓HCL）； H2O 至1000ml DAB为3，3二氧基联苯胺，不溶性底物，呈棕红色 ELISA试剂配制及实验流程 是酶联接免疫吸附剂测定(E

3、nzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的简称。以双抗体夹心法举例说明。 试剂配制：(1)包被缓冲液(PH9.6+0.20.05M碳酸盐缓冲液)：Na2CO31.59g;NaHCO32.93g； 加蒸馏水至1000ml。（用时稀释成1x，加0.1%BSA）(2)洗涤缓冲液(PH7.40.15MPBST)：0.05%Tween-200.5ml；加在PBS缓冲液1000ml中。PBS缓冲液：KH2PO40.2g；Na2PO412H2O2.9g；NaCl8g；KCl0.2g；加蒸馏水至1000ml。(3)封闭缓冲液：牛血清白蛋白(BSA)2%2g；（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲

4、液100ml。(4）稀释液：牛血清白蛋白0.1%0.1g；加PBS缓冲液100ml。(5）底物缓冲液（PH5.0）：0.2MNa2HPO4(无水28.4g/L，带12结晶水71.7g/L)取25.7ml0.1M柠檬酸(无水19.2g/L，带1结晶水21.01g/L)取24.3ml；加蒸馏水至100ml。(或Na2HPO412H2O1.84g；柠檬酸H2O0.51g加蒸馏水至100ml) (6)TMB(四甲基联苯胺)显色液（显蓝色）：TMB(2mg/ml水)0.05ml；底物缓冲液0.95ml；30%H2O2 0.001ml；总体积1ml。 (7)或配OPD(邻苯二胺)显色液（显黄棕色）（现配避

5、光）：OPD（干粉）0.004g；底物缓冲液10ml；30%H2O20.015ml；总体积10ml。(8)终止液(2MH2SO4)：在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约98%)21.7ml，边加边摇。操作步骤： 1.包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为110g/ml。在每板的反应孔中加0.1ml，4过夜（或37温育23小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。(简称洗涤，下同)。 2.封闭：加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中，置37温育2小时。然后洗涤3次 3.加样：加待检样品0.1ml于反应孔中，置37温育12小时。然后洗涤。(同时做空白孔（不加样品

6、），阴性对照孔（野生型）及阳性对照孔)。4.加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。置37温育12小时。然后洗涤。 5.加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。37温育45分钟1小时，洗涤5次。6.加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD显色液），37暗处温育520分钟，或室温暗处1040分钟充分变色。7.终止反应：各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）8.结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、“-”号表示测OD

7、值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。通常大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。4 间接法操作步骤： 1.包被：用包被液将样品稀释（梯度稀释，比例自己定）4过夜（或37温育23小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次（5至7次），中间振荡。(简称洗涤，下同)。 2.封闭：加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中，置37温育2小时。然后洗涤。3.加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。置37温育12小时。然后洗涤。4.加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。37温育45分钟1小时

8、，洗涤5次。5.加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD显色液），37暗处温育520分钟，或室温暗处1040分钟充分变色。6.终止反应：各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）7.结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、“-”号表示测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。通常大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。孕酮1包被缓冲液，（1）碳酸

9、盐缓冲液（PH9.6 +0.2 0.05M） Na2CO31.59g；NaHCO32.93g；加蒸馏水至1000ml。（2）tris缓冲液（0.05mol/L）50ml 0.1mol/L（Tris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml 各种pH值的Tris缓冲液的配制所需pH值（25）0.1mol/L HCl的体积714577244773434744207540376385773667834579320802928. 126.28.222.98.319.98.417.28.514.78.612.48.710.38.88.58.97.0某一特定pH值的0.05mol

10、/L Tris缓冲液的配制：将50ml 0.1mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水将体积调至100ml0.1mol/L盐酸的配置： 买来的浓盐酸是 12 mol/L的，以配制1L 0.1mol/L的盐酸为例：先用量筒量取8.3 mL的浓盐酸倒入容量瓶，然后将溶液加蒸馏水稀释至体积为1 L，此时的溶液就是0.1mol/L的盐酸。0.1mol/Ltris的配置：0.1 mol/L溶液为12.114 g/L则 配制600mlTris缓冲液的方法： 三羟甲基氨基甲烷： 3.6g 浓盐酸： 2.09ml3）0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4

11、)磷酸二氢钾 0.2g ；磷酸氢二钠2.90g；氯化钠 8g；加去离子水定容到1000ml。2洗涤缓冲液（pH7.4 0.15mol/L） 0.05%Tween-200.5ml；加在PBS缓冲液1000ml中。PBS缓冲液：KH2PO4 0.2g；Na2HPO412H2O2.9g；NaCl8.0g；KCl0.2g加蒸馏水至1000ml。3测定缓冲液(Ph7.0 含0.87NaCl 和0.1BSA的0.1M磷酸缓冲液)用于标准孕酮，孕酮酶标物及奶样的稀释。 Na2HPO412H2O 21.85g；NaH2PO42H2O6.08g；NaCl8.70g；BSA1.00g溶于1000mL蒸馏水中4封闭

12、缓冲液 牛血清白蛋白(BSA) 2%2g；（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100 ml。0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)+2.0%BSA2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml5底物缓冲液（pH5.4）磷酸盐-柠檬酸缓冲液 0.2M Na2HPO4(无水28.4g/L，带12结晶水71.7g/L) 取25.7ml 0.1M 柠檬酸(无水19.2g/L，带1结晶水21.01g/L) 取24.3ml加蒸馏水至100ml。或 柠檬酸（C6H8O7H2O）0.47g；Na2HPO412H2O2.00g；6（1） TMB(四甲基联苯胺)显色液（蓝色）A液(3，3

13、，5，5-四甲基联苯胺，TMB):称取TMB20mg溶于10ml无水乙醇中，完全溶解后，加双蒸水至100ml。B液(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4):称取Na2HPO412H2O14.34g，柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水，加0.75%过氧化氢尿素1.28ml，定容至200ml，调pH至5.0-5.4。将A液和B液按1：l混合后即成TMB-过氧化氢尿素应用液或TMB(2mg/ml水) 0.05ml： 底物缓冲液 0.95ml； 30% H2O20.001ml；总体积1ml。（2）OPD(邻苯二胺)显色液（黄棕色）（现配避光） OPD（干粉）0

14、.004g；底物缓冲液10ml；30%H2O2 0.015ml；总体积10ml。 （3）TMBS底物液（用于显色）10mg四甲基联苯胺硫酸盐（TMBS）的二甲基亚砜溶液，用底物缓冲液配成0.2mg/ml的TMBS底物液。用前加H2O2溶液30左右。7 终止液 2mol/L H2SO4 用于终止反应在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约98%)21.7ml，边加边摇。（浓H2SO4：蒸馏水=1:9）抗原修复液：根据待检测的抗原，选择适当的方法附：抗原修复液（10mM pH6.0 枸橼酸钠缓冲液）的配制 （1）储备液的配制：A：枸橼酸三钠-2H2O 29.41g+1000mlB:枸橼酸2

15、1g+蒸馏水 1000ml工作液的配置：A液82ml+B液18ml+蒸馏水900ml抗原修复方法：高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM,PH6.0）,淹没切片，盖上高压锅，高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）微波处理技术：用塑料切片架，置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中或高档，5分钟；取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中或高档，5分钟（最佳温度9295）抗原修复注意事项：组织不能干，选择抗原修复方法要因抗体而异。该方法主要用于10%福尔马林固定，石蜡包埋组织。抗原修复后至DAB显色的过程中，均要用PBS缓冲液。DAB的配制：储备

16、液（DAB 25mg/ml）的配置：DAB250mg+pbs10ml，待完全溶解后分装成1ml,100ul。50ul，20ul，等20冻存。工作液：DAB储存液20ul+PBS1000ul+3%H2O2 5ul;20.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。 30.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0, 加水至1000ml. 4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl

17、调至pH8.0, 加水1000ml。 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6. 3%甲醇H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制 7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.09.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制 8TBS/PBS PH9.09.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本 二抗稀释剂: 0.05% 叠氮钠; 0.01M 磷酸缓冲液(PBS) pH7.2 (注: 1升) 注备: 1) 二抗稀释剂可以储存在4 C , 6 个月. 2)

18、不要用含有牛血清白蛋白或其它血清的稀释剂来稀释二抗,因为二抗可能会与牛血清白蛋白或其它血清反应. 3)用TBS稀释二抗会降低染色, 因此TBS用于有强背景的抗体活碱性磷酸酶标记得二抗,因为磷酸盐可以抑制碱性磷酸酶的活性. 辣根过氧化酶-链霉亲和素(HRP-Streptavidin Dilution Buffer) 稀释剂: 0.01M 磷酸缓冲液(PBS) pH7.2 (注: 1升) 0.05% 硫柳汞 注备:此稀释剂可以储存在4 C , 6 个月. 碱性磷酸酶-链霉亲和素(AP-Streptavidin Dilution Buffer) 稀释剂:0.05M Tris缓冲液 (TBS), pH

19、 7.6 ;0.05% 硫柳汞 注备: 1) 此稀释剂可以储存在4 C , 6 个月. 2) 磷酸缓冲液不能用来稀释碱性磷酸酶-链霉亲和素,因为磷酸盐回抑制碱性磷酸酶活性. 荧光染料 (Avidin-FITC, Avidin-Texas Red, Avidin-AMCA) 稀释剂: 0.01M 磷酸缓冲液(PBS) pH7.2 (注: 1升) 0.05% 硫柳汞荧光封片剂荧光染色封片剂有几种：1缓冲甘油封片介质(常用)0.5molL碳酸盐缓冲液(pH8.5)，lOml；无荧光甘油(AR级)，90ml,混合后在搅拌器上充分混匀。2聚乙烯醇缓冲甘油混合介质0.5molL碳酸盐缓冲液(pH8.5)，

20、40ml；1聚乙烯醇，lOml；分析纯甘油，lOml。三液混合后，不断搅拌6h，72000g离心1h，吸取上清4保存备用。3荧光信号增强封片剂聚乙烯醇40-88，4.8g；分析纯甘油，12ml；蒸馏水，12ml；0.2molLTris盐酸缓冲液(pH85)，24ml；l，4重氮双环2，2，2辛烷，L25g(终浓度约25)。另外有供应抗荧光衰减封片剂，以高纯度甘油为介质，内含抗荧光淬灭剂，有强烈的抗荧光衰减作用，用于对荧光组织和细胞样品的封片。样品封片后4oC或20oC避光保存2-3周，可最大限度延长荧光持续时间和维持荧光发光强度，同时封片剂中的其它成分有助于保持组织抗原抗体处于结合状态。适用于

21、所有光谱范围的荧光如FITC，Cy2,Cy3,Rhodamine,TexasRed,Cy5,Cy7，DAPI,AMCA,R6G,Hoechst33258and33342。|荧光封片剂配制：称取NaHC033.7克，无水Na2C030.6克溶于100m1三蒸水中，然后与甘油1:1混合，4保存。200微升的甘油和800微升的0.01M的PBS 伊红（1）伊红（水溶性）配方：伊红 （水溶性） 2.5-5 g 蒸馏水 500 ml将水溶性伊红溶于蒸馏水中，然后加浓盐酸10毫升，充分搅拌，静置过夜后过滤。过滤后的沉淀用蒸馏水冲洗二次，再过滤；将沉淀物连同滤纸一起放入温箱内干燥，加95%酒精1000毫升，

22、配成饱和液。使用前再用95%的酒精 1:12倍稀释，加入12%冰醋酸。此方法具有染色时间快，颜色鲜艳，不容易褪色，使用寿命长等特点。 （2）伊红（醇溶性）配方：伊红 （醇溶性） 2.5-5g 75%酒精 1000 ml，加几滴冰醋酸至半透明状TAE缓冲液TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过

23、夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。 50TAE Buffer 配制方法： 1。称量Tris 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g 于1L烧杯中； 2。向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀； 3。加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解； 4。用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存。 使用时稀释50倍 即1TAE Buffer（5）TBE缓冲液1L名称：TBE（Tris硼酸），是一种PCR技术中用到的缓冲液。445 mmol/L Tris碱54g ;445 mmol/L 硼酸盐27.5g 硼酸； ；10 mmol/L EDTA20 ml的0.5

24、 mol/L EDTA（pH 8.0） ；水补足1LTRIS是一种最常用的生物缓冲液，常配成PH值为6.8，7.4，8.0，8.8。其PH值随温度变化很大。一般来说，温度每升高一度，PH值下降0.03。 1M TRIS-HCl 6.8和1.5M TRIS-HCl 8.8是SDS-PAGE最常用的试剂。 而由TRIS配成的TAE，TBE等是DNA电泳最常用的试剂，TE（PH8.0）主要用于溶解DNA。TE为 Tris加EDTA合称。 CAPS现在蛋白质的PVDF转膜已经不用Tris-gly、SDS、20%甲醇缓冲液:，因为缓冲液中有甘氨酸，所以测序的时候很难区分甘氨酸是BUFFER带进去还是蛋白

25、质本身的。现在测序用的转膜缓冲液是：10mM/l CAPS,10%的甲醇。CAPS电印迹缓冲液中的甲醇浓度范围是020%，一般甲醇浓度高的缓冲液对低分子量蛋白质的转移效果好，而甲醇浓度低甚至不含甲醇的缓冲液则有利于高分子量蛋白的转移。配制CAPS电印迹缓冲液。方法如下：10CAPS（100mmol/L）CAPS 22.3g；加去离子水至900ml；用2mol/L NaOH（约20ml）将pH值调至11.0，然后定容至1L，贮存于4。CAPS电印迹缓冲液（含10%甲醇的1CAPS）：10CAPS 200ml；甲醇 200ml；去离子水 1600mlstripping1、stripping buf

26、fer 含有适量的SDS，在低ph值或适当的温度下，可以使膜上的大多数抗原抗体复合物分开。使用stripping buffer 可以去除一抗和二抗，然后可以重新利用膜。2、完全可以用同一种抗体再杂交一次。我的经验是同一张膜stipping3次就差不多了，而且用同一种一抗，信号强度是一次比一次递减的。strip的配方有多种，不同的配方，strip的原理都不太相同。但是目的都只有一个，那就是使膜上的抗原抗体复合物分开。（洗脱一抗二抗）Stripping Buffer配方:-mercaptoethanol 342 l；20% SDS 5 ml；1M Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加

27、ddH2O至 50 ml。方法：将用过的膜浸入stripping buffer中，置50水浴箱中30min，间断振摇。之后用TTBS洗3*5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。CBS(ELISA抗原包被缓冲液)包被缓冲液(pH9.6， 0.05M碳酸盐缓冲液):NaHCO3 1.59克；NaHCO32.93克；加蒸馏水至1000mlTBSTBS即Tris缓冲盐水，是Tris-HCl缓冲盐溶液，为等渗盐溶液加Tris-HCl缓冲液 ，在做Western Blot时用到。配制方法如下： 1 mol/L TrisHCl（pH7.5）10ml ；NaCl8.8g ；蒸馏水至 100

28、0ml；TBST (TTBS)TBST中含有 Tris-Hcl， NaCl，tween20 这三种物质，是做WESTERN BLOT中常用的一种缓冲溶液。Tween是一种离子表面活性剂，它可加速抗体非特异性结合的分离。Tween20 含量0.05%。告诉大家一个免调pH值的10TBST配方，相信可以解决你的问题，同时也能让广大战友省力不少！体积1000ml包括：Tris:30.28g；NaCl:87.66g；HCl:17ml；Tween 20:5ml；使用之前稀释10倍即可！PBS磷酸盐缓冲液（简称PBS）的是常用的用于生物学研究的一个缓冲溶液。它是一种水基盐溶液中含有氯化钠，磷酸盐，以及（在某些配方） 氯化钾和磷酸钾。缓冲液有助于保持恒定的pH值。解决方案的渗透压和离子浓度通常与人体pH相近（等渗）。Elisa洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO40.2克； Na2HPO12H2O2.9克 ；NaCl 8.0克；KCl0.2克 ;Tween-200.050.5ml ;加蒸馏水至1000ml；