basicbiologyofplasmidandphagevectors教学文案.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。basicbiologyofplasmidandphagevectors-Basicbiologyofplasmidandphagevectors一、目的基因进入原核或真核细胞并高效复制和表达蛋白质，需要装入载体才能实现。作为基因工程载体所需具备的基本条件：1.能自我复制，并具一定的拷贝数。2.带有便于检测的遗传标记，便于筛选和鉴定。3.在适当的位置有单酶切位点，便于重组操作。4.带有强启动子，驱动目的基因在宿主细胞内高效表达。5、具有较高的遗传稳定性。二、依据基本组成元件的来源分:1.细菌质粒：最常用

2、的用于目的基因克隆或表达的载体。2.酵母质粒：用于在酵母中表达目的蛋白。3.l噬菌体：主要用于构建基因组DNA或cDNA文库4.粘粒：用于克隆大片段DNA。5.M13噬菌体:专用于Sanger双脱氧DNA测序6.病毒：包括人或哺乳动物病毒、昆虫病毒及植物病毒。用于在真核细胞中表达目的蛋白7、 人工染色体载体依据功能分：1、克隆载体：用于在宿主细胞中克隆和扩增外源片段2、表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因的表达产物。质粒载体的一般特征发现：细菌，偶见于链霉菌和酵母独立于染色体之外进行复制和遗传,又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖

3、。一、结构特征：1、大多数质粒是以双链环状DNA分子的形式存在的(1)共价闭环DNA(cccDNA)：可分为超螺旋的和松弛的两种(2)开环DNA（ocDNA）2、分子量：小于1106到大于200106都有3、质粒与染色体的不同（1）离心:密度不同（2）agarose电泳:分子量大小（3）电镜观察:1mdsDNA=3000bp（4）再转化二、表型效应1、致育性（1）F因子（fertilityfactor）：是在某些大肠杆菌中发现的一种最有代表性的接合型质粒。是雄性决定因子。有三种存在方式：F+、F、线性形式（2）接合作用（conjugation）:在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，由

4、于性须的作用，形成雌雄细胞配对的过程叫细菌的接合作用。质粒分为接合型（conjugativeplasmid）和非接合型(non-conjugativeplasmid)2、 产生抗菌物质和毒素（1）col（大肠杆菌素因子）：大肠杆菌素-蛋白质性质的抗菌物质；大肠杆菌、索氏志贺氏菌、葡萄球菌（2）pGKL1和pGKL2：线型DNA质粒，致死效应乳酸克鲁维酵母（3）scp1：产生抗生素编码毒素：产毒素大肠杆菌（人类和动物腹泻）；金黄色葡萄球菌（烫伤皮肤综合症）；3、对药物和重金属离子抗性（1）R因子R1质粒(94kb)使宿主对氯霉素(Cm)、链霉素(Sm)、磺胺(Su)、氨苄(Ap)和卡那霉素(Km

5、)抗性（2）对金属离子抗性碲(Te+6)、砷(As3+)、汞(Hg2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)、银(Ag+)、镉(Cd2+)等3、 利用异常营养物Pseudomonas、克氏杆菌、短黄杆菌等将许多化学毒物降解。降解酶由降解性质粒编码特殊有机物：樟脑、水杨酸、二甲苯、辛烷4、 对植物的致病性Ti、Ri5、 其他共生质粒：豆科植物共生固氮的根瘤菌结(nod)和固氮(fix)基因EcoRI:大肠杆菌Ry13质粒乳糖的利用等特性也与质粒有关6、 隐秘质粒(crypticplasmid):不显示任何表型效应的质粒三、质粒的复制类型和拷贝数1、复制类型严密型（stringentplasmid）松

6、弛型（relaxedplasmid2、 拷贝数质粒拷贝数一般与其分子量成反比关系，质粒拷贝数=质粒DNA量/染色体DNA量MWc/MWp调控：反义RNA或关键蛋白与重复区结合四、构建质粒载体（1）分子量尽量小。15kb时转化效率低。小质粒优点:容易提取；较为抵抗机械(超声波)切割；多拷贝，给克隆基因提供了剂量效应；对内切酶提供多切点的机会大为减少。（2）了解载体上基因位置/限制酶作用位点。（3）包含可供选择的标记性状(基因)（4）最大限度地具有MCS的单切点（5）改造或增加表达基因的调控序列（6）安全性能改造五、常用质粒pBR3224361bpAmprTetrpUC18/192686bpAmp

7、rLacZpUC118/1193162bpAmprLacZpGEM-3Z2743bpAmprLacZ六、穿梭质粒载体shuttleplasmidvector是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以携带外源DNA序列在不同物种的细胞间，特别是在原核和真核细胞之间往返穿梭，因此在基因工程的研究中是十分有用的。七、质粒载体多种用途转录、测序、亚克隆、表达转化E.coli容易，重复性高容易大量分离提纯八、质粒载体筛选方法插入失活互补：IPTG,X-GAL直接筛选：抗生素表达筛选（抗体筛选）Probe筛选九、质粒载体缺点C

8、aCl2转化效率低克隆片段小于10kb大量筛选时需要细胞裂解噬菌体(phage)克隆载体一、噬菌体克隆载体1、噬菌体的生物学特性：（1）噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体（2）噬菌体由外壳包装蛋白和-DNA组成（3）-DNA全长48502个核苷酸（4）-DNA上至少有61个基因2、cos位点（cohesiveendsite):在DNA两端各有12nt的5单链突出，彼此序列互补。它是包装时的切割信号。3、溶原状态（1）噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。（2）整合主要由-DNA上的cI和int两基因的产

9、物所激活而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态.（3）DNA重组技术一般需要噬菌体进入溶菌状态4、-DNA载体的构建：缩短长度野生型-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将-DNA分成两大类载体：l 插入型载体l 取代型载体5、构建琥珀密码子的突变体琥珀型突变（sup)是指由

10、CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株6、-DNA载体的主要类型插入灭活型载体:Charon2、Charon6、gt11取代型载体:EMBL4、gtc、NM762、Charon40正选择型载体:EMBL1、L47、1059野生型的噬菌体不

11、能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），这种生长抑制表型受-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑7、-DNA重组分子的体外包装-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞用于体外包装的蛋白质可直接从感染了噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当这两部分包装蛋白与重组-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组-DNA污染后，均不能被

12、包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的8、用途：a.用作一般的克隆载体。b.用于构建基因组或cDNA文库。c.用于抗体库或随机肽库的构建。二、大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA1、M13噬菌体的生物学特性：生物结构l M13噬菌体的外型呈丝状l M13噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成l M13DNA全长6407个核苷酸l M13DNA上至少有10个基因2、M13噬菌体几个重要特点：（1）M13噬菌体不裂解宿主细胞，只是降低宿主细胞的生长速度。（2）M13噬菌体能以单链和双链两种方式存在，因此可以用感染(经包装的单链DNA)和转化(双链DNA)。（3）但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb3、M13噬菌体用途：（1）DNA序列测定；（2）制备单链DNA探针（3）用于定点突变的研究-