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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。fanwen-毕业论文开题报告外源花生四烯酸对杨树淹水胁迫响应的影响学生姓名：颜秋月学号：20070416学院：生命科学与技术学院专业：生物工程论文题目：油菜素内酯对番茄抗病性的影响指导教师：刘志祥2011年1月14日1结合毕业论文课题情况，根据所查阅的文献资料，每人撰写1500字左右的文献综述(包括研究进展，选题依据、目的、意义)文献综述自然环境中，植物与各种病原物如真菌、细菌、病毒等的接触无时无处不在，但在大多数情况下，植物并不患病而是正常生长。从这种意义上说，植物病害的发生率是很低的，这是因为植物

2、体内存在着多种抗病途径，大体分为固有抗病性和诱导抗病性1。固有抗病性指病原物侵染植物前，植物体已存在的一些抗病因素，包括组织解剖结构和抗菌化合物两类1。诱导抗病性是指植物受病原物侵染时被激活和诱导的抗病性。番茄(Solanumlycopersicum)，属茄科(Solanaceae)，以成熟多汁浆果为产品的草本植物。番茄有生津止渴、健胃消食、清热解毒、降低血压的功效，含有丰富的维生素和其他营养物质，如胡萝卜素、维生素B和C2，其中番茄红素不仅有抑制细菌的作用，还有独特的抗氧化能力，能清除自由基，保护细胞，使脱氧核酸及基因免遭破坏，从而阻止癌变进程3。番茄既可作为果品生吃，又可作为蔬菜或烹调作料

3、熟食，深受广大消费者的欢迎。现在虽然交通便捷，又有暖棚的提前、延后作用，但番茄表皮薄软，鲜嫩易腐，极易损伤给贮、运均带来许多不便。在北方市场上，依然存在着淡、旺季的明显差别4。因此，番茄保鲜贮藏技术发展和完善，具有很显著的经济效益和社会效益。越来越多的人开始把番茄的贮藏保鲜作为研究的重点。我国番茄种植及加工规模仅次于美国和欧盟国家，排行世界第三，但保鲜包装技术水平还比较落后5。1番茄的贮藏保鲜方法1.1传统保鲜贮藏方法包括筐贮法、架贮法、袋贮法及浸泡法等。这些方法操作简单，易学易用，资金投入少，对贮藏环境要求不高，适合于农户或小规模贮藏应用4。1.2现代保鲜方法近年来对果蔬保鲜技术的研究发展迅

4、速，物理、化学及生物方法被广泛用于其中。如减压贮藏保鲜法，辐射预处理法、气调法、乙烯控制法、复合涂膜法、基因工程手段等4。目前世界上广受关注的是可食膜涂膜保鲜法，这是一种新兴的果蔬保鲜法，可以有效阻止(或减少)水分、气体或溶质地迁移，对番茄表面起到机械保护的作用。涂膜保鲜法有很大的开发应用价值，主要是因为这种方法操作简便、易于推广，价格低廉，特别是采用天然成膜材料，而且没有毒性，且涂膜后的果蔬具有精美的外观。可食性膜的另一个作用是用来做抗菌剂的载体。通过在膜中添加抗菌剂，可抑制微生物的生长，从而延长水果和蔬菜的保存期6。本实验就是希望用油菜素内酯浸涂番茄，研究其保鲜机理。2番茄中的抗病因子2.

5、1番茄碱番茄碱在番茄(Lycopersicon)植株中的含量最高，是番茄根茎、叶、青果中产生的次生代谢物，其果实中番茄碱的含量随着果实成熟度的增加而逐渐降低。番茄碱能够保护番茄植株在生长过程中免受细菌、真菌、病毒和某些昆虫的侵害，有明显的抗菌、驱虫的作用7。据文献报道，番茄碱能够抑制某些对人和动物有危害的病原菌，具有显著的生物活性82.2活性氧(ROS)ROS在植物抗病反应中，活性氧主要包括：超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH)和过氧化氢。它的作用有：直接杀死入侵病原菌细胞壁的强度增强和氧化交联诱导植保素合成诱导系统获得抗性诱导过敏性反应诱导细胞程序性死亡诱导防卫基因表达激活其他信号分子或与

6、其协同作用11。2.3植保素在植物抗病反应中，植保素的主要作用是抑制病菌生长和阻碍病菌侵染1。2.4其它如有机酸、丙二醛脯氨酸与番茄的抗病性也有相关性，与植物抗病性相关的关键酶有过氧化物酶(POD)过氧化氢酶(CAT)多酚氧化物酶(PPO)苯丙氨酸解氨酶(PAL)超氧化物歧化酶(SOD)3油菜素内酯油菜素内酯(Brassinolide，BR)是一种新型植物激素，在植物体内含量极低，但生理活性却极高，植物经低浓度处理便能表现出明显的生理效应BR可促进种子萌发和延迟器官衰老，减少叶片和果实脱落，提高作物对高温、干旱、冷害、除草剂、盐害等逆境的抗性10-14近年来一些研究表明，BR可诱导多种植物对真

7、菌、细菌及病毒产生抗性，用BR处理烟草可以增强烟草对TMV细菌和真菌抗性，可以增强水稻对真菌和细菌的系统抗性15；BR增强了黄瓜对灰霉病的抗性16；表油菜素内酯提高南瓜对病毒病和疫霉菌的抗性17-18及BR诱导大白菜对软腐病抗性19。油菜素内酯在水果，蔬菜和农作物中的应用具有很多优点：处理成本低、用量少、使用安全方便，可在生长的各个时期施用，适应绿色无公害农业发展要求。4黄曲霉菌黄曲霉是温暖地区常见的占优势的霉菌，其生长温度范围在4-50之间，最适生长温度为25-40。黄曲霉毒素形成的最低温度为5-12，最高为45，最适温度为20-30(28)。黄曲霉和寄生曲霉广泛存在于土壤、灰尘、植物及其果

8、实上。特别是在热带和亚热带的核果类和谷类上更为常见。黄曲霉菌菌落生长较快，10-14天直径3-4或6-7cm。菌落正面色泽也随其生长由白色变为黄色及黄绿色，呈半绒毛状。孢子成熟后颜色变为褐色。表面平坦或有放射状沟纹，反面无色或带褐色。在低倍显微镜下观察可见分生孢子头呈疏松放射状，继而为疏松柱状。制片镜检观察，可见分生孢子梗很粗糙。顶囊呈烧瓶形或近球形。分生孢子在小梗上呈链状着生，分生孢子的周围有小突起、球形、粗糙。5课题研究的目的、意义目前国内用油菜素内酯对果蔬的抗性的研究很多，但很少看到有关油菜素内酯对果蔬的保鲜的报道。究竟是因其诱导了果蔬的抗性或它本身对微生物有抑制作用还是二者皆有目前还不

9、是很清楚。黄曲霉是环境中常见的菌，给食物果蔬的保鲜带来极大的困扰，具有代表性。通过接种黄曲霉，观察油菜素内酯处理后番茄在贮藏过程中的感染情况，测定处理前后番茄各种生理生化指标的变化情况，同时用含有不同浓度的油菜素内酯的培养基培养黄曲霉，观察其生长情况，初步解释油菜素内酯的抗病作用机理。本课题研究油菜素内酯对番茄抗病性的影响，为油菜素内酯应用于番茄采后保鲜奠定基础。参考文献：1 戈家英，阮芸玮.植物的抗病机理探讨J.湖北植保，2000，(5)：32-34.2 徐伟，刁复强.番茄红素对人体的潜在作用J.国外医学卫生学分册，1998，25(2)：81-844.3 闫春兰，刘子贻.番茄红素保健功能的研

10、究现状J.浙江大学学报：医学版，2002，31(2)：139-142.4 宝音图.对番茄保鲜贮藏方法的探讨J.内蒙古科技与经济，2004，(16)：96-97.5 王晓琴.可食膜在樱桃番茄保鲜中的应用研究D.福建农林大学，2009，1-60.6 BlaiseO.RonaldEInhibitionofsurfacespoilagebacteriainprocessedmeatsbyapplicationofantimicrobialfilmspreparedwithchitosanJ.InternationalJournalofFoodMicrobiology，2000，(9)：139-148.

11、7 陶永霞，刘洪海，王忠民，于志涛，李岷.番茄碱的研究现状及应用前景J.现代食品科技，2006，22(2)：253-256.8 Arneson，P.A.；DUrbin，R.D.HydrolysisoftomatinebySeptorialycopersici.DetoxificationmechanismJ.Phytopatho-logy，1967，57：1358-1360.9 刘志文，沙爱华，王英.活性氧物质在植物抗病中的作用J.安徽农业科学，2005，33(9)：17051707.10 ClouseSD，SasseJM.Brassinosteroids：essentialregulator

12、sofplantgrowthanddevelopmentJ.AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol，1998，49：427-451.11 BishopGJ，KonczC.BrassinosteroidsandplantsteroidhormonesignalingJ.ThePlantCellSupplement，2002，(2)：97-110.12 杨芳，李启任.表油菜素内酯对月季切花衰老的影响J.植物生理学讯，2006，42(5)：891-893.13 高红明，温爽，张小丽，等.表油菜素内酯浸种对干旱胁迫下玉米种子萌发及苗生长的影响J.安徽农业科学，2006，34(2

13、0)：5208-5209.14 曹云英，赵华.高温胁迫下油菜素内酯对水稻幼苗的保护作用J.中国水稻科学，2007，21(5)：525-529.15 NakashitaH，YasudaM，NittaT，etal.BrassinosteroidfunctioninabroadrangeofdiseaseresistanceintobaccoandriceJ.Plant，2003，33：887-898.16 尚庆茂，张志刚，董涛，等.油菜素内酯诱导黄瓜幼苗抗灰霉病研究J.应用与环境生物学报，2007，13(5)：630-634.17 陶媛.表油菜素内酯提高西葫芦病毒病抗性的生理机制研究D.杭州：浙江

14、大学，2005，1-71.18 屈淑平，王力莉，崔崇士.表油菜素内酯诱导南瓜幼苗抗疫病研究J.中国蔬菜，2008，(5)：13-16.19 屈淑平，张灵宇，崔崇士.表油菜素内酯诱导大白菜抗软腐病研究J.东北农业大学学报，2009，40(10)：27-31.20 李家庆.果蔬保鲜手册M.中国轻工业出版社，2003，2：384-385.21 冯双庆.番茄保鲜技术J.农村新技术，2002，(3)：38-39.22 杜传来，郁志芳.壳聚糖涂膜包装对鲜切莴苣保鲜效果的研究J.包装与食品机械，2005，23(2)：11-14.23 ZhuZhua，ZhanquanZhanga，GuozhengQin，Sh

15、ipingTian.EffectsofbrassinosteroidsonpostharvestdiseaseandsenescenceofjujubefruitInstorageJ.PostharvestBiologyandTechnology.2010，56：50-5524 寇莉萍，刘兴华，任亚梅，罗安伟.采后热处理技术在果蔬贮藏保鲜上的应用J.食品科学，2005，(26)：162-165.25 郭婕，刘中华，赵锦慧.碘量法测定茶叶与红枣中维生素C的含量J.生物学教学，2011，36(2)：139-142.26 安红梅，崔源清，关文强，刘兴华，阎瑞香，于莉.红地球葡萄采后生理变化与发病率的

16、相关性J.食品科技，2008(6)：231-234.27 郝建军，康宗利，于洋.植物生理学实验技术M.化学工业出版社，2007，1：175-176.28 王晶英，敖红，张杰，曲桂琴.植物生理生化试验技术与原理M.东北林业大学出版社，2003，1：3-7.29 吾尔尼沙卡得尔，车凤斌，张婷，李萍，胡柏.不同贮藏温度对红提葡萄贮期品质及生理指标变化的影响J.新疆农业科学，2010，47(1)：82-86.30 王德良，周小慧.基础生物学实验教程M.中国科学技术出版社，2006，1：226-228.2本课题要研究或解决的问题和拟采用的研究手段(途径)：一、待研究和解决的问题：本课题主要研究油菜素内酯

17、对采后番茄抗病性的影响，确定它对番茄的保鲜是由于改变了番茄的生理特点，还是它对微生物本身有抑制作用。须在实验3-5天前将菌种进行活化。二、课题研究方法及研究途径：2.1实验材料2.1.1原料与试剂葡萄糖，琼脂粉，石英砂，可溶性淀粉，浓盐酸，碘酸钾，碘化钾，氢氧化钠，三氯乙酸(分析纯)，95%乙醇，邻苯二甲酸氢钾(分析纯)，硫代巴比妥酸(分析纯)，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，愈创木酚，30%过氧化氢(分析纯)，磷酸，冰醋酸，酚酞，L-脯氨酸，茚三酮，甲苯，磺基水杨酸，高锰酸钾(分析纯)，硫酸，草酸钠(分析纯)，油菜素内酯(化学纯)，乙醛(分析纯)，土豆，圣女果。2.1.2主要仪器与设备锥形瓶(50m

18、L、250mL)，移液管(0.5mL、1mL、2mL、5mL、10mL)，棕色瓶(1000mL)，容量瓶(25mL、50mL、100mL、1000mL)，酸式滴定管(25mL)，碱式滴定管(25mL)，滴定管架，研钵，精密酸度计，分析天平，生化培养箱，塑料筐，漏斗，灭菌锅，电子万用炉、电热鼓风干燥器，恒温水浴锅，冷冻离心机，分光光度计，手持折光仪(测糖仪)，烧杯，移液枪，试管。2.2番茄的前处理番茄的成熟阶段分为：绿熟期(外部放白，内部稍转红)、微熟期(表面开始转色，顶部微红)、半熟期(半红).坚熟期(红而硬)和软熟期(红而软)20。鲜食番茄多为半熟期至坚熟期采摘，但不能进行长期贮截。绿熟至顶

19、红期的果实具有一定的耐贮性和抗病性，在贮藏中能后熟转红。长期贮藏的番茄应在绿熟期采收21。但因本实验的目的是延长番茄的货架期，所以选择半熟期的番茄，果实应为无烂果、无虫害果、无病斑果、无损伤果、无裂果，且果实无萎蔫现象、大小相当、果梗剪截平整。因为果实采后带有大量的田间热，果品温度较高，呼吸旺盛，因此要预冷抑制水果的呼吸作用，减缓水果后熟、衰老带来的品质和颜色变化，减轻失水造成的萎蔫现象22。本实验是将采后的番茄立即摊开放置到阴凉通风处，使其充分散发田间热，降低果品温度。实验前用干净的自来水洗净番茄的泥土和污垢，将清洗干净的番茄用2.0%的乙醛溶液浸泡23min，放置于塑料筐中沥干，乙醛是一种

20、安全易挥发的材料，对微生物细菌、酵母等比较敏感，有一定的抑菌作用。2.3油菜素内酯保鲜液的配制实验分三个组进行，一个无处理空白对照，两个用油菜素内酯(浓度分别为2.5，5ppm)。由于番茄果皮含有一层蜡质，采用喷和刷的方法时容易造成膜液分布不均匀，而影响贮藏保鲜效果，因此本实验采用浸涂法。将果随机分成3组，分别用上述制备的3组保鲜液浸果1min，要求浸膜均匀一致。为加快膜的干燥，减少由于干燥时间过长引起微生物污染，本实验采用鼓风干燥的方法，工艺条件是风速3ms-1、温度40，每隔15min观察一次番茄表面膜的干燥情况，待番茄表面不粘手无水渍状时，记下完全干燥的时间。将上述按照不同浓度浸涂干燥好

21、的番茄分类放置于塑料筐中，贴标签并做记录。然后将其放置在室温通风的条件下保存。2.4、PDA培养基配置及菌种活化2.4.1PDA培养基配置PDA培养基是人们对马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，依次对应马铃薯、葡萄糖、琼脂的英文。它是一种常用的培养基，宜培养酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌。配方：马铃薯100克，葡萄糖10克，琼脂710克，自来水500毫升，PH自然配制步骤：其做法是称取100g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水煮烂(煮沸2030分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用四层纱布过滤，再据实际实验需要加葡萄糖和琼脂，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至500毫升，装于三角瓶中，加塞、包扎，(121)灭菌2

22、0分钟。其他事项.培养基经灭菌后，必须放在37C恒温箱培养24h，无菌生长者方可使用。.PDA培养基一般不需要调pH。对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时，可用lmolLNaOH或lmolLHCL溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。.培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基，用于菌类的震荡培养。.培养基也可以加入氯霉素或土霉素，加入量为0.1g/L培养基，主要是为了抑制细菌的生长，减少干扰性。2.4.2菌种活化用接种环将黄曲霉菌孢子刮取适量至10.0mL无菌水中，打散制成菌悬液。吸取5mL菌悬液至无菌培养

23、皿中，再倒入约10mL、45C的PDA培养基，混匀制成平板于25-30C恒温箱中倒置培养3-5d至长满菌。2.5操作步骤参照参考文献23：1) 将番茄分成abc三个组，每组60个番茄。a、b两组分别用油菜素内酯浓度分别为2.5，5ppm)处理，c组为空白对照组。在番茄的赤道半径处切出4mm深3mm宽的伤口，分别用移液枪移取5𝜇L菌悬液对三个组接种。每隔3天记录并计算各组的腐烂率及各组的病斑直径同时测定相应的抗病理化指标2) 刮取适量黄曲霉孢子至100.0mL无菌水中制成菌悬液，吸取5mL至培养皿中，再分别在培养皿中分别加入5mL的浓度分别为0，2.5，5ppm油菜素内酯，倒入4

24、5约10mL的PDA培养基制成平板，置于30恒温箱中倒置培养18-24h，每个浓度做3个重复。2.7测定项目及方法2.7.1腐烂率腐烂率=腐烂果粒数/果粒总数100%2.7.2病斑直径用毫米尺测量2.7.3有机酸采用氢氧化钠滴定法24。取10g番茄果肉，置研钵中研磨成匀浆，倒入100mL量筒内，用蒸馏水洗数次，至总体积约50mL，读出总体积，用玻璃棒搅拌均匀，用棉花过滤入干燥的烧杯中，滤液作测定用。取滤液10mL放入250mL锥形瓶，加水100mL，加酚酞指示剂23滴，用0.02mol/LNaOH标准液滴定至微红色，摇1min不褪色为终点。取三次平均值。若得到的提取液有颜色时，可以在提取液中投

25、入一块石蕊试纸，从它的颜色变化来确定终点。记下所用体积，根据苹果酸换算系数计算有机酸含量。有机酸含量(%)=V稀释倍数C0.067/W100。式中V为NaOH消耗体积数；C表示NaOH的浓度(mol/L)；0.067为苹果酸换算系数；W为样品重量。2.7.4维生素C含量测定碘量法测定25洗净新鲜果实，吸干，称取15g果肉组织放入研钵内，加5mL1%的盐酸研磨成匀浆，倒入100mL量筒内，用1%的盐酸洗数次，至总体积约50mL，读出总体积，用玻璃棒搅拌均匀，用棉花过滤入干燥的烧杯中，滤液作测定用。在150mL的锥形瓶中，用移液管注入1%的KI0.5mL，0.5%淀粉液2mL，以及上述制得的试液1

26、0mL。用0.001NKIO3液滴定，要一滴一滴加入，并时时摇动烧杯，至微蓝色不褪为终点(一分钟不褪为止)。记录所用KIO3液毫升数。重复测定3次。用各次测定的平均值，计算维生素C含量。计算公式：W=V0.088b100/(Ba)式中W=100克样品含的抗坏血酸毫克数。V=滴定样品所用的KIO3毫升数。0.088=1毫升0.001N碘酸钾溶液相当的抗坏血酸的量(mg/mL)。B=滴定时所用样品溶液毫升数。b=制成样品液的总毫升数。a=样品的克数。2.7.5POD采用愈创木酚氧化法26称取5g果肉，加入10mLpH6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，于4下10000r/min离心20min，上

27、清液为待测液。与PPO提取相同，向试管内加pH6.0的磷酸缓冲溶液2.9mL、0.1%愈创木酚1mL、酶液0.5mL于37水浴10min后加入1mLH2O2，摇匀后立即于470nm下测吸光度变化，30s读一次，持续3min。以煮沸5min的酶液为对照，重复3次。反应体系加入酶液后，立即于37C水浴中保温15min，然后迅速转入冰浴中，并加入20%三氯乙酸终止反应，5000g离心l0min，测定OD470。酶活性以每分钟内OD470变化0.01为一个POD酶活性单位(u/gmin)表示。POD酶活单位(u/g.min)=N/0.011/VtV0式中N=每分钟内OD470变化量。Vt=测定用提取液

28、体积。V0=提取液总体积。2.7.6脯氨酸采用茚三酮法27(1)绘制脯氨酸标准曲线称10mg脯氨酸溶于水少量乙醇中用蒸馏水定容至100mL，成100g/mL的母液。取母液0、0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0mL分别放于50mL容量瓶，定容。分别取上述溶液各2mL，加入已编号的7个试管中，在分别加2mL冰醋酸、4mL酸性印三酮试剂、2mL3%磺基水杨酸溶液。摇匀后，在沸水浴中加热显色60min，取出冷却至室温，向各管加入4mL甲苯充分振荡，以萃取红色产物。静置使红色物质全部转入甲苯层。用滴管轻轻吸取红色甲苯溶液与比色杯中，在分光光度计520nm波长处测吸光度，以脯氨酸含量和吸光

29、度绘制标准曲线。(2)脯氨酸的提取称取1g果肉于具塞试管中，加5mL3%磺基水杨酸溶液，加塞后沸水浴提取10min，过滤液待测。(3)脯氨酸的测定取提取液2mL与具塞试管中，加2mL水2mL冰醋酸、4mL酸性印三酮试剂，沸水浴显色60min，冷却至室温加4mL甲苯，充分摇匀，同样取红色甲苯层于520nm出侧吸光度。脯氨酸含量(g/g)=CV/aWC为标准曲线中查得脯氨酸含量，g；V为提取液总体积，mL；a为测定液体积，mL；W为样品质量，g.2.5.7可溶固形物(TSS)含量测定可溶固形物(TSS)含量测定采用糖度计测量28。2.7.8MDA采用硫代巴比妥酸法29称取果肉5g，加入10%三氯乙

30、酸(TCA)2mL和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mLTCA进一步研磨，匀浆以4000转离心15min，上清液为样品提取液。吸取离心的上清液2mL(对照加2mL蒸馏水)，加入2mL0.6%硫代巴比妥酸(TBA，用10%三氯乙酸配制)溶液，摇匀后于沸水浴上反应15min，读取体积，冷却后再离心。取上清液测定450、532和600nm波长下的吸光光度。MDA(𝜇mol/gFW)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450VTN/(VSW)式中VT为提取液总体积；VS为测定用提取液体积；W样品质量，N稀释倍数。2.7.9过氧化氢酶(cAT)采用高锰酸钾滴定法30。1)取果

31、肉5g加入pH7.8的磷酸缓冲液研磨成浆，转移至25mL容量瓶中，用该缓冲液洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，定容。6000r/min离心15min，上清液即为CAT粗提液。2)取50mL三角瓶4个(2个为测定，2个为对照)，测定瓶中加入酶液2.5mL，对照瓶中加煮死酶液2.5mL，再加入2.5mL0.05mol/LH2O2，同时计时，于30C恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5mL；3)用0.02mol/LKMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色(在30s内不消失)，为终点。记录KMnO4用量。酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数(mg/gmin)。酶活(mg/g.min)=(A-B)xVtx1.7/FwxV1xt式中A为对照KMnO4滴定毫升数，Vt为酶液总量(mL)；V1为反应所用酶液量(mL)；Fw为样品鲜重(g)；1.7为1mL的0.02mol/L的KMnO4相当于1.7mgH2O2指导教师意见：1对“文献综述”的评语：2对本课题的深度、广度及工作量的意见和对论文结果的预测：指导教师：年月日所在专业审查意见：负责人：年月日-