DNA和RNA提取方法及原理和提取方法及原理DNA提取专题DNA提取专题第一部分演示教学.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。DNA和RNA提取方法及原理和提取方法及原理DNA提取专题DNA提取专题第一部分-DNA和RNA提取方法及原理和提取方法及原理DNA提取专题DNA提取专题第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：第二部分：DNA提取常见问题分析及对策提取常见问题分析及对策前言DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物是遗传信息的载体，是遗传信息的载体信息分子，是分子生物学研究的主要对象。信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子了进行测序、杂交和基因的表达，量和高纯度

2、的DNA是非常重要的前提。是非常重要的前提。量和高纯度的是非常重要的前提DNA提取原则DNA提取原则保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染DNA提取的几种方法DNA提取的几种方法染色体DNA的提取染色体DNA的提取DNACTAB法法SDS法SDS法其它DNA提取的几种方法DNA提取的几种方法非染色体DNA的提取的提取非染色体质粒DNA的提取的提取质粒?碱裂解法?煮沸法线粒体、叶绿体线粒体、叶绿体DNA的提取的提取?差速离心结合差速离心结合SDS裂解法裂解法基因组DNACTAB法基因组DNACT

3、AB法CTAB法原理（植物提取经典方法）法原理植物DNA提取经典方法提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基（，溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，），是一种阳离子去污剂溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂）是可溶的，抽提，去除蛋白、多糖、抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。出来。溶液在低于15时会形成沉淀析出，注：CTAB溶液在低于时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的溶

4、液在低于植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。基因组DNACTAB法基因组DNACTAB法CTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合2+或Mn2+离子，抑制螯合Mg离子，抑制DNase活性；活性；螯合活性NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；提供一个高盐环境，DNP充分溶解存在于液相中；充分溶解，CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜-巯基乙醇是抗

5、氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，巯基乙醇是抗氧化剂CTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，物质，有效去除多酚，减少中酚的污染；物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，中酚的污染同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。有效去除多糖。基因组DNACTAB法基因组DNACTAB法CTAB法流程图法流程图植物材料裂解液酒精沉淀液氮研磨抽提离心洗涤DNA溶液溶液细胞裂解上层溶液干燥溶解基因组DNASDS法基因组

6、DNASDS法SDS法原理法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细是一种阴离子去垢剂，在高温（是一种阴离子去垢剂使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖或浓度并降低温度（提高盐浓度并降低温度冰浴）杂质沉淀，离心后除去沉淀；杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的用酚/氯仿抽提上清液中的用酚氯仿抽提，DNA。基因组DNASDS法基因组DNASDS法SDS法流程图以动物组织为例）SDS法流程图（以动物组织为例）动物组织抽提离心洗涤

7、组织匀浆上层溶液干燥溶解细胞裂解酒精沉淀DNA溶液溶液基因组DNA基因组DNA其它方法根据细胞裂解方式的不同有：根据细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：生物方式：酶法基因组DNA基因组DNA其它方法根据核酸分离纯化方式的不同有：根据核酸分离纯化方式的不同有：吸附材料结合法：吸附材料结合法：?硅质材料高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。pH值结合核酸pH值洗脱快捷高效。快捷高效。阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸，高盐低

8、pH值洗脱。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。pH值结合核酸pH值洗脱适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。从而达到分离目的。基因组DNA基因组DNA其它方法浓盐法：浓盐法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离和在盐溶液中溶解度不同，利用在盐溶液中溶解度不同有机溶剂抽提法：有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂，有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物质粒DNA质粒DNA碱裂解法碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得

9、多，且染色体DNA为染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分DNA比质粒DNA分子大得多DNA而质粒DNA为共价闭合环状分子；DNA为共价闭合环状分子子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共DNA溶液时DNA容易发生变性价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉DNA而复

10、性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相从而可通过离心将两者分开。中，从而可通过离心将两者分开。质粒DNA质粒DNA碱裂解法碱裂解法流程图对数期菌体上清液沉淀溶液I充分重悬溶液充分重悬抽提干燥溶解溶液II裂解溶液裂解酒精沉淀质粒DNA溶液溶液质粒溶液III中和溶液中和离心洗涤质粒DNA质粒DNA煮沸法煮沸法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分DNA比质粒DNA分子大得多DNA而质粒DNA为共价闭合环状分子；DNA为共价闭合环状分子子，而质粒DNA为共价闭合

11、环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共DNA溶液时DNA容易发生变性价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；DNA在冷却时即恢复其天然构象价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉DNA而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态存在液相淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相从而可通过离心将两者分开。中，从而可通过离心将两者分开。细胞器DNA细胞器DNA差速离心法线粒体和叶绿体是生物体内半

12、自主性细胞器，线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋它们的比重和大小一定比重和大小一定，白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。种组分分级分离出来。差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。从而得以分离

13、。内容第一部分：第一部分：DNA提取方法简介提取方法简介第二部分：DNA提取及常见问题分析第二部分：提取及常见问题分析DNA提取的基本步骤DNA提取的基本步骤I.材料准备I.材料准备II.破碎细胞或包膜II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜III.核酸分离、III.核酸分离、纯化核酸分离IV.沉淀或吸附核酸，IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸V.核酸溶解在适量缓冲液或水中V.核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备基因组DNA的提取基因组DNA的提取DNA最好使用新鲜材料，最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要时提取血液基因组选择有核细胞（白细胞

14、）选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解否则会造成降解含病毒的液体材料DNA含量较含病毒的液体材料DNA含量较DNA少，提取前先富集质粒DNA的提取质粒DNA的提取DNA使用处于对数期的新鲜菌体老化菌体导致开环质粒增加）（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）菌株不要频繁转接（质粒丢失）细胞裂解基因组DNA的提取基因组DNA的提取DNA材料应适量，

15、过多会影响裂解，材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低量少，导致量少针对不同材料，针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K蛋白酶组培细胞蛋白酶细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，高温温浴时，定时轻柔振荡质粒DNA的提取质粒DNA的提取DNA菌体量适当培养基去除干净，培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（分钟分钟），变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，复性时间也不宜过长，否则会有基因

16、组DNA的污染有基因组的污染G菌、酵母质粒的提取，应先酵母质粒的提取，用酶法或机械法处理，用酶法或机械法处理，以破壁?核酸分离、核酸分离、纯化基因组DNA的提取基因组DNA的提取DNA质粒DNA的提取质粒DNA的提取DNA采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提时采用吸附材料吸附的方式分离供相应的缓冲体系采用有机（氯仿抽提时应充分混匀，氯仿）采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法核酸分离、核酸分离、纯化蛋白质的去除：蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性

17、（SDS、异硫氰酸胍等）使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离、核酸分离、纯化多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体1/2积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可(1/2体积以与多糖的羟基作用，以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。代替乙醇沉淀DNADNA：DNA液中加入用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500LDNA液中

18、加入冰浴20min20min。200l20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分离、核酸分离、纯化多酚的去除：多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它加入易与酚类结合的试剂：PVP、PEG(聚乙二醇)聚乙二醇们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNADNA的结合们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除：盐离子的去除：7070的乙醇洗涤核酸沉淀、核酸沉淀、溶解基因组DNA的提取基因组D

19、NA的提取DNA质粒DNA的提取质粒DNA的提取DNA当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的体积的NaOAc（pH5.2，3M），有），有沉淀时加入体积的（，），利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，沉淀后应用的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥），让乙醇充分挥发（不要过分干燥）晾干若长期储存建议使用TE缓冲液溶解若长期储存建议使用缓冲液溶解?TE中的中的EDTA能螯和2+或Mn2+离子，抑制能螯和Mg离子，抑制DNase中的能螯和pH值为，可防止值为8.0，可防止DNA发生酸解

20、值为发生酸解基因组DNA的检测基因组DNA的检测提取的基因组DNA片段在片段在20kb30kb之间提取的基因组片段在之间高质量的基因组DNA带型单一无拖尾现象带型高质量的基因组DNA浓度及纯度的检测A260=1约50?g/mL双链浓度及纯度的检测双链DNA；A260/280约为1.8约为DNA提取常见问题DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯抑制后续酶解和PCR反应。样品不纯，PCR反应问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因1.2.3.4.DNA中含有蛋白、多DNA中含有蛋白、中含有蛋白糖、多酚类杂质DNA在溶解前在溶解前，DNA在溶解前，有酒精残留，精残留，酒精抑制后续酶解

21、反应DNA中残留有金属离DNA中残留有金属离子RNA的存留有RNA的存留1.对策2.3.4.重新纯化DNA，重新纯化DNA，过吸附DNA柱去除蛋白、多糖、柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNADNA，重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加7070增加70乙醇洗涤的次数（次数（2-3次）加入RNase降解RNARNase降解加入RNase降解RNADNA提取常见问题DNA提取常见问题问题二：DNA降解降解。问题二：DNA降解。原因1.2.3.4.5.1.2.3.材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸对酶的活性提取过程操作过于剧策DNA被机械打断烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融4.5.尽

22、量取新鲜材料，尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料DNA时的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌DNA分装保存于缓冲液中分装保存于缓冲液中，将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融DNA提取常见问题DNA提取常见问题问题三：DNA提取量少提取量少。问题三：DNA提取量少。原因1.2.3.4.1.2.实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗涤时DNA丢失洗涤时DNA丢失DNA对策3.4.

23、尽量选用新鲜（幼嫩）的材尽量选用新鲜（幼嫩）料动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长（对于动时间适当延长（物细胞、细菌可增加PKPK的用物细胞、细菌可增加PK的用量）。增加吸附的时间，增加吸附的时间，或低温沉淀小心操作RNA提取专题RNA提取专题第一部分：第一部分：RNA提取方法简介提取方法简介第二部分：RNA提取及常见问题分析第二部分：提取及常见问题分析分离提纯RNA的目的分离提纯RNA的目的分析不同发育时期基因的表达状况获得新基因研究基因的拼接分析相应的蛋白产物RNA的不稳定性RNA的不稳定性由于核糖残

24、基的2和位置带有羟基位置带有羟基，由于核糖残基的和3位置带有羟基，RNA易易于被RNA酶切割水解于被酶切割水解RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复酶含量丰富，酶含量丰富活性，活性，不易失活提取RNA的注意事项提取RNA的注意事项经常更换新手套。经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有RNase，会导致RNase污染。，会导致污染。污染使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在应使用不含的塑料和玻璃器皿。的塑料和玻璃器皿150烘烤4小时，塑料器皿可在烘烤小时塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡小时，中

25、浸泡10中浸泡分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。常用RNA酶抑制剂常用RNA酶抑制剂焦磷酸二乙酯（焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结）：酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，强烈但不彻底的合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。酶抑制剂异硫氰酸胍：目前是最有效的酶抑制剂，异硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使酶抑制剂RNA酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，酶失活RNA酶有强烈的变性作用。酶有强烈的变性作用。

26、酶有强烈的变性作用氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制酶的活性。酶结合形成过渡态类物质酶的活性RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来酶的蛋白抑制剂（）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来酶的蛋白抑制剂）：的酸性糖蛋白。酶的一种非竞争性抑制剂，的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和是酶的一种非竞争性抑制剂多种RNA酶结合，使其失活。酶结合，使其失活。多种酶结合其它：酶也有一定抑制作用。

27、其它：SDS、尿素、硅藻土等对、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。酶也有一定抑制作用RNA提取专题RNA提取专题第一部分：第一部分：RNA提取方法简介提取方法简介第二部分：RNA提取及常见问题分析第二部分：提取及常见问题分析RNA提取的步骤RNA提取的步骤材料的裂解异硫氰酸胍，亚硫氢胍，巯基乙醇，异硫氰酸胍，亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等。使细胞及核蛋白复月桂肌氨酸合物变性，释放RNA，有效抑制核酸合物变性，释放，酶。苯酚，氯仿，异戊醇抽提去除杂物，苯酚，氯仿，异戊醇抽提去除杂物，及蛋白沉淀到有机相。使DNA及蛋白沉淀到有机相。及蛋白沉淀到有机相杂质的去除RNA的吸附或沉淀的吸附

28、或沉淀硅质材料的吸附或用异丙醇沉淀浓缩RNA。或用异丙醇沉淀浓缩。处理的水溶解RNA经DEPC处理的水溶解材料准备及裂解RNA的提取的提取尽量使用新鲜材料，植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位，尽量使用新鲜材料，植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位，现取现提。现取现提。组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清，消化系统的组组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清，织选取杂质少的部位,细菌和酵母需要匀浆处理。织选取杂质少的部位细菌和酵母需要匀浆处理。对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻，对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻，或投入专门的RNA样品储存液中保存。样品储存液中保存

29、。专门的样品储存液中保存液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆。底而迅速地匀浆。杂质的抽提RNA的提取的提取采用有机（采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀氯仿）离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、DNA分布到中间层和有机相中RNA留在水相中分布到中间层和有机相中，DNA分布到中间层和有机相中，RNA留在水相中对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层，对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层，可以再次用有机溶剂抽提RNA的沉淀和溶解的沉淀和溶解RNA的提取的提取含

30、RNA的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖RNA的水相过吸附柱，的水相过吸附柱等杂质或使用异丙醇沉淀RNA应充分的混匀并放置10min左右离心收集或使用异丙醇沉淀RNA应充分的混匀并放置10min左右离心收集RNA应充分的混匀并放置10min沉淀，70乙醇洗涤，沉淀，70乙醇洗涤，晾干用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA用经处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解样品收集后或需长期保存时应置于或加入RNase抑制剂，抑制剂，样品收集后或需长期保存时应置于70或加入抑制剂分装使用RNA的检测的检测电泳槽系统的处理乙二醛化琼脂糖凝胶电泳含有甲

31、醛的琼脂糖凝胶电泳RNA纯度及浓度的检测纯度及浓度的检测（A260=1，约40?g/mLRNA；约为1.9-2.1）A260/A280约为RNA提取常见问题提问题一：问题一：RNA样品不纯样品不纯原因1保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心；转数一定时间的离心；增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化减少处理样品的量；2减少处理样品的量；加入不含RNase的DNase处入不含RNase的DNase处RNase理；再次纯化3增加漂洗次数抽提过程不彻底存在蛋白或多糖多酚的污染2DNA的污染3离子浓度较高1对策RNA提取常见问题提问题二：问题二：RNA得率低得率低原因1去除样品中的杂质，离去除样品中的杂

32、质，心除净样品中的培养基或储存液减少样品用量；2减少样品用量；充分研磨样品，磨样品，增加裂解液的用量和裂解的时间3延长吸附时间或保证异丙醇沉淀的时间和离心时间；时间；再次洗脱重复吸附，4重复吸附，加入肝糖等有助RNA沉淀的试剂有助RNA沉淀的试剂RNA1样品含有杂质杂液2样品过量或样品裂解和匀浆不彻底RNA未有效的吸附沉3RNA未有效的吸附沉淀或洗脱样品RNARNA含量少4样品RNA含量少对策RNA提取常见问题提问题三：RNA容易降解问题三：RNA容易降解原因1尽量取新鲜的样品；尽量取新鲜的样品；取样后立即放入液氮保存；后立即放入液氮保存；或放入专门的储存液内；放入专门的储存液内；研磨样品及时补充液氮2认真地处理相应的器具和试剂；试剂；严格地操作冻存，分装使用；3-70冻存，分装使用；加入RNaseRNase抑制剂加入RNase抑制剂样品不新鲜或样品保存不当，RNA降解保存不当，RNA降解污染了RNase2污染了RNase3样品储存不当-