第三章基因工程载体PPT讲稿.ppt

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1、第三章基因工程载体第1页，共129页，编辑于2022年，星期二基因克隆载体基因克隆载体n n要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是就是运载体。n n基因克隆载体基因克隆载体(DNA克隆载体克隆载体)：通过不同途径：通过不同途径能将承载的外源能将承载的外源DNA片段片段(基因基因)带入受体细胞，带入受体细胞，并在其中得以维持的并在其中得以维持的DNA分子。分子。第2页，共129页，编辑于202

2、2年，星期二载体的功能及特征载体的功能及特征一、发展概况一、发展概况一、发展概况一、发展概况 1.1.第一阶段（第一阶段（第一阶段（第一阶段（19771977年前）：年前）：年前）：年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如天然质粒和重组质粒的利用，如天然质粒和重组质粒的利用，如天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,pSC101,colE1,pCR,pBR313colE1,pCR,pBR313和和和和pBR322(1977,Bolivaretal)pBR322(1977,Bolivaretal)2.2.第二阶段：第二阶段：第二阶段：第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和增大载

3、体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如新的遗传标记基因。如新的遗传标记基因。如新的遗传标记基因。如pUCpUC系列载体。系列载体。系列载体。系列载体。3.3.第三阶段：第三阶段：第三阶段：第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如如如如M13mpM13mp系列载体，含系列载体，含系列载体，含系列载体，含T3T

4、3，T7T7，sp6sp6启动子载体，表达型载体启动子载体，表达型载体启动子载体，表达型载体启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。及各种探针型载体。及各种探针型载体。及各种探针型载体。第3页，共129页，编辑于2022年，星期二载体的功能载体的功能n n运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞n n为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力n n为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供必要的条件第4页，共1

5、29页，编辑于2022年，星期二载体应具备的条件载体应具备的条件n n在克隆载体在克隆载体在克隆载体在克隆载体DNADNA分子合适的位置有一至多个克隆分子合适的位置有一至多个克隆分子合适的位置有一至多个克隆分子合适的位置有一至多个克隆位点，供外源位点，供外源位点，供外源位点，供外源DNADNA片段组入克隆载体片段组入克隆载体片段组入克隆载体片段组入克隆载体DNADNA分子。分子。分子。分子。n n至少有一个复制起点，因而至少可在一种至少有一个复制起点，因而至少可在一种至少有一个复制起点，因而至少可在一种至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。生物体中自主复制。生物体中自主复制。生

6、物体中自主复制。n n至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组组组组DNADNA分子是否进入宿主细胞。分子是否进入宿主细胞。分子是否进入宿主细胞。分子是否进入宿主细胞。n n克隆载体必须是安全的。克隆载体必须是安全的。克隆载体必须是安全的。克隆载体必须是安全的。第5页，共129页，编辑于2022年，星期二第6页，共129页，编辑于2022年，星期二第一节第一节 质粒克隆载体质粒克隆载体第7页，共129页，编辑于2022年，星期二一、一、质粒的一般生物学特性质粒的一般生物学特

7、性n n发现：细菌，偶见于链霉菌和酵母n n独立于染色体之外进行复制和遗传,又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。n n比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。第8页，共129页，编辑于2022年，星期二一、质粒的一般生物学特性一、质粒的一般生物学特性n n质粒质粒质粒质粒是细菌染色体外能够自主复制的环是细菌染色体外能够自主复制的环是细菌染色体外能够自主复制的环是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的形双链的形双链的形双链的DNADNA分子分子分子分子n n在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共价闭合在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共价闭合在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共价闭合在宿

8、主细胞内，质粒一般以超螺旋共价闭合环环环环DNADNA分子（分子（分子（分子（ccc-DNAccc-DNA）的形式存在。）的形式存在。）的形式存在。）的形式存在。n n在体外理化因子作用下，质粒可以成为在体外理化因子作用下，质粒可以成为在体外理化因子作用下，质粒可以成为在体外理化因子作用下，质粒可以成为开环开环开环开环DNADNA分子（分子（分子（分子（oc-DNAoc-DNA）或线形）或线形）或线形）或线形DNADNA分子（分子（分子（分子（l-DNAl-DNA）。）。）。）。n n在变性条件下，质粒可成为单链在变性条件下，质粒可成为单链在变性条件下，质粒可成为单链在变性条件下，质粒可成为单

9、链DNADNA分子分子分子分子（ss-DNAss-DNA）。）。）。）。n n质粒质粒质粒质粒DNADNA分子大小分子大小分子大小分子大小1-100Kb1-100Kb以上以上以上以上。第9页，共129页，编辑于2022年，星期二质粒质粒DNA的复制的复制n n质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNADNADNA复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制复制系统进行自主复制n n复制方向性：纯单向性（复制方向性：纯单向性（复制方向性：纯单向性（复制方向性：纯单向性（ColEIColEIColEIColEI）；纯双向性（）；纯双

10、向性（）；纯双向性（）；纯双向性（F F F F质粒）；既质粒）；既质粒）；既质粒）；既有单向又有双向性（有单向又有双向性（有单向又有双向性（有单向又有双向性（R6KR6KR6KR6K）。）。）。）。n n根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：复制类型：复制类型：复制类型：严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒11数个数个数个数个 拷贝拷贝拷贝拷贝stringentp

11、lasmidstringentplasmid 松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒1010个个个个 拷贝以上拷贝以上拷贝以上拷贝以上stringentplasmidstringentplasmid第10页，共129页，编辑于2022年，星期二质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒质粒质粒质粒DNADNA复制启动控制复制启动控制复制启动控制复制启动控制n n控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结合控制复制引物与模板的结

12、合oriori E.coli E.coli E.coli ColE1ColE1ColE1 plasmidplasmidplasmid复制方向复制方向复制方向复制方向复制方向复制方向roprop（+）RopRopRNA IIRNA IIRNA IIRNA IRNA IRNA I333555555333第11页，共129页，编辑于2022年，星期二质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒质粒质粒质粒DNADNA复制启动控制复制启动控制复制启动控制复制启动控制n n控制复制起始因子与复制起始位点（控

13、制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（控制复制起始因子与复制起始位点（oriori）的结合）的结合PcoPcoPcop p pcopcopcopP/OrepP/OrepP/Oreprererep p poriorioriCopCopCopRepRepRep第12页，共129页，编辑于2022年，星期二第13页，共129页，编辑于2022年，星期二质粒的不亲和性质粒的不亲和性n n有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主

14、细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。亲和质粒。n n以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例：ColE1ColE1、pMB1pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101pSC101、F F、RP4RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容拥

15、有相似的复制子结构，彼此不相容拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15Ap15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容第14页，共129页，编辑于2022年，星期二第15页，共129页，编辑于2022年，星期二质粒迁移n n革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒接合型质粒接合型质粒接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞能在天然条件下自发地从一

16、个细胞转移到另一个细胞能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如（接合作用），如（接合作用），如（接合作用），如F F、ColCol、RR质粒等质粒等质粒等质粒等 非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用如不能在天然条件下独立地发生接合作用如不能在天然条件下独立地发生接合作用如不能在天然条件下独立地发生接合作用如ColCol、RR的其它的其它的其它的其它成员成员成员成员n n值得注意的是，某些非接合型质粒（值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质）在接合型质粒的存在和协助下

17、，也能发生粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由转移，这个过程由bom 和和和和mob mob 基因决定基因决定基因决定基因决定第16页，共129页，编辑于2022年，星期二携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记n n野生型的质粒野生型的质粒野生型的质粒野生型的质粒DNADNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，上往往携带一个或多个遗传标记基因，上往往携带一个或多个遗传标记基因，上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：这使得寄主生物产生正常生长非

18、必需的附加性状，包括：物质抗性物质抗性物质抗性物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成物质合成物质合成物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱n n这些标记基因对这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义第17页，共129页，编辑于2022年，星期二质粒载体质粒载体第18页，共129页，编辑于2022年，星期二第19页，共129页，编辑于2022年，星期二二、构建质粒克隆载

19、体的基本策略n n1 1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝。贝。n n2 2、含有尽可能多的克隆位点。、含有尽可能多的克隆位点。n n3、含有供选择克隆子的标记基因。n n4 4、构建的质粒克隆载体、构建的质粒克隆载体DNADNA分子尽可能小。分子尽可能小。n n5 5、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件元件”（小（小DNADNA片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。第20页，共129页，编辑于2022年，星期二三、质粒克隆载体

20、的构建n n质粒克隆载体的设计和构建过程的原则选择合适的出发质粒（亲本质粒）。正确获得构建质粒克隆载体的元件。组装合适的选择标记基因。选用合适的启动子。在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体的构建过程力求简单。第21页，共129页，编辑于2022年，星期二大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建n npBR322pBR322的构建是质粒载体构建的的构建是质粒载体构建的一个典范。一个典范。n npBR322pBR322的亲本质粒的亲本质粒 pSF2124pSF2124，含有，含有AmpAmp抗性基因抗性基因 pMB1pMB1，含有松弛型，含有松弛型ColE1ColE1的复制

21、起点的复制起点（oriori）Psc101Psc101，含有，含有TetTet抗性基因抗性基因第22页，共129页，编辑于2022年，星期二大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建n n1、在菌体内将R1drd19质粒（沙门氏菌中R1质粒的一种变异体）的易位子Tn3（携带有Amp抗性基因）易位到pMB1质粒上，构成一个较大的质粒pMB3(13.3Kb)。pMB3 AATT黏性末端环化 导入大肠杆菌 pMB8(2.6Kb)EcoRI*第23页，共129页，编辑于2022年，星期二n n2、从质粒pSC101获得四环素抗性基因（Tetr)。n n获得pMB9（5.3Kb)第24页

22、，共129页，编辑于2022年，星期二n n3、向pMB9引入Amp抗性基因。n npSF2124的Tn3体内易位至pMB9获得pBR312(10.2Kb,具有Amp抗性基因和Tet抗性基因）n npBR312 pBR313(8.8Kb，除去 Amp抗性基因中的BamHI位点）EcoRI*第25页，共129页，编辑于2022年，星期二n n4、pBR313pBR322(4.3Kb)pBR320(2.8Kb)pBR318（6.3Kb)去除两个PstIEcoRII片断去掉酶切酶切体外重组第26页，共129页，编辑于2022年，星期二第27页，共129页，编辑于2022年，星期二四、常用质粒载体类型

23、n n1、克隆质粒载体n n2、表达质粒载体n n3、多功能质粒载体n n4、穿梭质粒载体第28页，共129页，编辑于2022年，星期二1、克隆质粒载体n n克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁殖的质粒载体。pBR322质粒pUC系列的质粒载体第29页，共129页，编辑于2022年，星期二pBR322质粒n n 具有较小的分子量，大小具有较小的分子量，大小4363bp4363bp 可以克隆大到可以克隆大到6Kb6Kb的外源的外源DNADNA片断片断n n具有两种选择标记，即Ampr和Tetr。n n具有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点具有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点 AmpAm

24、p抗性基因内可被抗性基因内可被Pst I,Pvu I,Sac IPst I,Pvu I,Sac I切开，切开，TetTet抗性基因可被抗性基因可被BamH I,BamH I,Hind IIIHind III切开，通过插入失活筛选重组子。切开，通过插入失活筛选重组子。n n在宿主细胞内具有较高的拷贝数。一般一个细胞内可达到一般一个细胞内可达到1515个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，可达到可达到1000-30001000-3000拷贝，如氯霉素。拷贝，如氯霉素。第30页，共129页，编辑于2022年，星期二CAP protein binding site-5

25、91-554(compl.strand);mRNA(LacZ)starts at nt position 507(compl.strand);lac repressor binding site-507-487(compl.strand).第31页，共129页，编辑于2022年，星期二pBR322插入失活效应第32页，共129页，编辑于2022年，星期二筛筛选选重重组组子子的的示示意意图图第33页，共129页，编辑于2022年，星期二 BamHI片段片段(Tcr)pBR322PstI(Apr)片段片段 重组分子重组分子I 重组分子重组分子(Aps Tcr)(Apr Tcs）PstI片段片段 外

26、源外源DNABamHI片段片段利利用用抗抗生生素素抗抗性性基基因因筛筛选选重重组组子子的的过过程程重组分子重组分子I 涂布涂布Ap平板平板 Apr转化子转化子 分别转化分别转化E.coli(ApS TcS)重组分子重组分子 涂布涂布Tc平板平板 Tcr转化子转化子影印到影印到Tc平板上平板上 Apr TcS为重组子为重组子Apr Tcr为原载体为原载体 影印到影印到Ap平板上平板上 ApS Tcr为重组子为重组子 即为非重组子即为非重组子第34页，共129页，编辑于2022年，星期二pUC系列的质粒载体n npBR322质粒的复制起点质粒的复制起点n nAmp抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限

27、制性抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限制性核酸内切酶的单一酶切位点核酸内切酶的单一酶切位点n n大大肠杆菌肠杆菌-半乳糖酶基因（半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其）的启动子及其编码编码-肽链的肽链的DNA序列，此结构特称为序列，此结构特称为lacZ基因基因 n n位于位于lacZ基因中的靠近基因中的靠近5”端的一段多克隆位点端的一段多克隆位点(MCS，multiplecloningsites)区，但它并区，但它并不破坏该基因的功能不破坏该基因的功能 第35页，共129页，编辑于2022年，星期二第36页，共129页，编辑于2022年，星期二Multiple Cloning SitespUC1

28、8pUC19第37页，共129页，编辑于2022年，星期二第38页，共129页，编辑于2022年，星期二pUC系列质粒载体的优点 n n具有更小的分子量和更高的拷贝数具有更小的分子量和更高的拷贝数具有更小的分子量和更高的拷贝数具有更小的分子量和更高的拷贝数 pUC8pUC8为为为为2750bp2750bp，pUCl8pUCl8为为为为2686bp2686bp pBR322pBR322质粒的复制起点内部发生了自发的突变，导致质粒的复制起点内部发生了自发的突变，导致质粒的复制起点内部发生了自发的突变，导致质粒的复制起点内部发生了自发的突变，导致roprop基因的缺失基因的缺失基因的缺失基因的缺失

29、n n适用于组织化学方法检测重组体适用于组织化学方法检测重组体适用于组织化学方法检测重组体适用于组织化学方法检测重组体 LacZLacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做互补。互

30、补。互补。互补。n n具有多克隆位点具有多克隆位点具有多克隆位点具有多克隆位点MCSMCS区区区区 pUCpUC质粒载体具有与质粒载体具有与质粒载体具有与质粒载体具有与M13mp8M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点噬菌体载体相同的多克隆位点噬菌体载体相同的多克隆位点噬菌体载体相同的多克隆位点 具两种不同粘性末端具两种不同粘性末端具两种不同粘性末端具两种不同粘性末端(如如如如EcoRIEcoRI和和和和BamHI)BamHI)的外源的外源的外源的外源DNADNA片段，无需借片段，无需借片段，无需借片段，无需借助其它操作而直接克隆到助其它操作而直接克隆到助其它操作而直接克隆到助其它操作而直接克

31、隆到pUCpUC质粒载体上质粒载体上质粒载体上质粒载体上 第39页，共129页，编辑于2022年，星期二pUC18/19：正选择标记：正选择标记lacZ lacZ 的显色原理的显色原理的显色原理的显色原理pUC18/19pUC18/19pUC18/19PlacPlaclacZlacZMCSMCSb b b b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的a a a a-肽段肽段肽段肽段a a ab b b5-5-5-溴溴溴溴溴溴-4-4-4-氯氯氯氯氯氯-3-3-3-吲哚基吲哚基吲哚基吲哚基吲哚基吲哚基-b b b bb b-D-D-D-半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷X-

32、galX-galX-gal第40页，共129页，编辑于2022年，星期二利利用用菌菌落落颜颜色色筛筛选选重重组组子子第41页，共129页，编辑于2022年，星期二2、表达质粒载体n n是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体根据表达的蛋白是否分泌到细胞外：非分泌型表达载体（胞内表达载体）和分泌型表达载体根据表达所用的受体细胞：原核细胞表达载体和真核细胞表达载体第42页，共129页，编辑于2022年，星期二表达载体与克隆载体的区别n n强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因有效的转录n n在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进蛋白

33、质翻译n n在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳定性第43页，共129页，编辑于2022年，星期二表达型载体表达型载体（expression vector）n n 特点特点 基因的启动子序列和终止子序列基因的启动子序列和终止子序列基因的启动子序列和终止子序列基因的启动子序列和终止子序列 一般无检测标记基因一般无检测标记基因一般无检测标记基因一般无检测标记基因 克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量

34、差异）。重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。n n结构结构 转化单元转化单元转化单元转化单元-宿主细胞转化宿主细胞转化宿主细胞转化宿主细胞转化 表达单元表达单元表达单元表达单元-外源基因表达外源基因表达外源基因表达外源基因表达第44页，共129页，编辑于2022年，星期二表达型载体表达型载体（expression vector）n n 类型类型 型：转录起始区（调控序列型：转录起始区（调控序列+启动子）启动子）+终止子终止子型型:转录起始区终止子转录起始区终止子+翻译起始区（核糖体结合翻译起始区（核

35、糖体结合序列和起始密码子）序列和起始密码子）+终止子终止子型型:转录起始区转录起始区+翻译起始区翻译起始区+信号肽链编码区信号肽链编码区+终止子（常称之为表达分泌型载体）终止子（常称之为表达分泌型载体）第45页，共129页，编辑于2022年，星期二三三种种表表达达型型载载体体结结构构图图第46页，共129页，编辑于2022年，星期二表达型载体表达型载体（expression vector）n n显然显然,不同类型载体中所缺少的部分必须由外源不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之基因提供。换言之,被表达的外源基因一旦确定被表达的外源基因一旦确定,表达载体的类型也就确定了。表达载体的

36、类型也就确定了。n n用途用途表达外源基因以产生大量外源基因产物表达外源基因以产生大量外源基因产物用于构建用于构建cDNA文库文库第47页，共129页，编辑于2022年，星期二3、多功能质粒载体n n载体具有多种功能，根据需要进行体外转录、载体具有多种功能，根据需要进行体外转录、载体具有多种功能，根据需要进行体外转录、载体具有多种功能，根据需要进行体外转录、克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。n npGEMpGEM系列质粒载体就是一类多功能载系列质粒载体就是一类多功能载系列质粒载

37、体就是一类多功能载系列质粒载体就是一类多功能载体，如：体，如：体，如：体，如：pGEM-3pGEM-3、pGEM-4pGEM-4、pGEM-3ZpGEM-3Z、pGEM4ZpGEM4Z、pSP64pSP64、pSP65pSP65、pGEM3ZfpGEM3Zf。第48页，共129页，编辑于2022年，星期二pGEM系列载体系列载体 n npGEM系列载体是一种与系列载体是一种与pUC系列十分类似的小分系列十分类似的小分子的质粒载体。子的质粒载体。n n在其总长度为在其总长度为2743bp的基因组的基因组DNA中，编码有中，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因

38、。基因。n n在后者还插入了一段含多个限制性内切酶的识别序在后者还插入了一段含多个限制性内切酶的识别序列的多克隆位点。列的多克隆位点。n n此序列结构几乎与此序列结构几乎与pUC克隆载体的完全一样。克隆载体的完全一样。第49页，共129页，编辑于2022年，星期二pGEM3Z载体载体n npGEM3Z与与pUC载体非常相似载体非常相似，其不同点：，其不同点：pGEM3Z含有两段额外的短的含有两段额外的短的DNA片段，每一段可片段，每一段可以作为以作为RNA聚合酶的识别位点。聚合酶的识别位点。这两段启动子（噬菌体这两段启动子（噬菌体SP6T7)存在于限制性内切存在于限制性内切酶的两端，这意味着如

39、果在重组的酶的两端，这意味着如果在重组的pGEM3Z载体中载体中加入加入RNA聚合酶，可以发生转录。聚合酶，可以发生转录。n n合成的合成的RNA可以作为探针使用，或者研究可以作为探针使用，或者研究RNA的加工过程或者蛋白质的合成。的加工过程或者蛋白质的合成。第50页，共129页，编辑于2022年，星期二第51页，共129页，编辑于2022年，星期二274327432743bpbpbpMCSMCSMCSlacZlacZlacZP PPT7T7T7oriorioriApApApr rrPgem-3EPgem-3EPgem-3EP PPSP6SP6SP6n n注意：注意：T7和和SP6启动子特异启

40、动子特异性地由噬菌体性地由噬菌体DNA编码的编码的RNA聚合聚合n n酶所识别，因此相应的受酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：聚合酶，如：n nE.coliE.coliBL21（DE3）等）等第52页，共129页，编辑于2022年，星期二第53页，共129页，编辑于2022年，星期二1、克隆载体，全长、克隆载体，全长3.19kb，具有，具有Amp抗性基因和复制起始点抗性基因和复制起始点2、MCS两侧有两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子聚合酶启动子-可进行体外转录；为插入片段可进行体外转录；为插入片段的测序提供特异引物位点的测序提供特异引物位点3、MC

41、S为于为于lacZ基因内部（插入失活）基因内部（插入失活）蓝白斑筛选蓝白斑筛选4、引入丝状噬菌体、引入丝状噬菌体f1(+)复制起始点复制起始点-可以产生单链可以产生单链DNA，并分泌至上清中，并分泌至上清中，第54页，共129页，编辑于2022年，星期二第55页，共129页，编辑于2022年，星期二第56页，共129页，编辑于2022年，星期二分泌型融合表达载体，分泌型融合表达载体，有两个启动子有两个启动子（Plac,Pspa），启动子），启动子下游装有下游装有SPA的信号肽的信号肽序列和两个结构基因序列和两个结构基因ZZ。产生与产生与SPA蛋白蛋白ZZ段融段融合的蛋白，并可将融合合的蛋白，并

42、可将融合蛋白分泌出胞蛋白分泌出胞4.59kb，含，含Amp抗性基因抗性基因和原核复制起始点和原核复制起始点有有f1复制起始点，可产生复制起始点，可产生单链单链DNA第57页，共129页，编辑于2022年，星期二4、穿梭质粒载体n n是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。n n特点：质粒载体可以携带外源DNA序列在不同物种的细胞之间，特别是在原核和真核之间往返穿梭。n n常见的穿梭质粒载体：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体等。第58页，共129页，编辑于2022年，

43、星期二第59页，共129页，编辑于2022年，星期二穿梭质粒穿梭质粒 能在两种不同的生物中复制的能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌如大肠杆菌)中复制，又能在中复制，又能在真核细胞真核细胞(如酵母如酵母)中复制的载中复制的载体。体。很多酵母菌的穿梭载体，用于功能互补法分离、鉴定真核生物基因的研究 第60页，共129页，编辑于2022年，星期二第二节 噬菌体载体噬菌体载体第61页，共129页，编辑于2022年，星期二一、噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性n n噬菌体的生活周期噬菌体的生活周期n n噬菌体的基因组结构和功能噬菌体的基因组结构和功能

44、n n噬菌体的噬菌体的DNADNA复制复制第62页，共129页，编辑于2022年，星期二1 1、噬菌体的生活周期噬菌体的生活周期n nl l 噬菌体是噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体大肠杆菌的温和型噬菌体n nl l 噬菌体由外壳包装蛋白和噬菌体由外壳包装蛋白和l l-DNA组成组成第63页，共129页，编辑于2022年，星期二第64页，共129页，编辑于2022年，星期二2 2、噬菌体的基因组结构和功能噬菌体的基因组结构和功能n nl l-DNA全长全长48502个核苷酸个核苷酸n nl l-DNA上至少有上至少有61个基因个基因n n线状线状ds-DNA，两端具有，两端具有12bp 5-突起

45、（突起（5-GGGCGGCGACCT-3）该末端称为）该末端称为cos位点，可位点，可被被编码的末端酶所识别编码的末端酶所识别第65页，共129页，编辑于2022年，星期二第66页，共129页，编辑于2022年，星期二第67页，共129页，编辑于2022年，星期二2 2、噬菌体的基因组结构和功能噬菌体的基因组结构和功能n n人为将人为将噬菌体基因组分为噬菌体基因组分为3 3个区域：个区域：左侧区：自基因左侧区：自基因A A到基因到基因J J，包含外壳蛋白的全部编码，包含外壳蛋白的全部编码基因。基因。中间区：介于基因中间区：介于基因J J和基因和基因N N之间，这个区又称为非必之间，这个区又称为

46、非必需区，与噬菌斑形成无关，被外源需区，与噬菌斑形成无关，被外源DNADNA片断取代后，片断取代后，并不影响噬菌体的生命活动。中间区包含重组基因和并不影响噬菌体的生命活动。中间区包含重组基因和一整合切割基因。一整合切割基因。右侧区：位于右侧区：位于N N基因的右侧，包含全部的主要调节基基因的右侧，包含全部的主要调节基因及复制基因和裂解基因。因及复制基因和裂解基因。第68页，共129页，编辑于2022年，星期二3 3、噬菌体的噬菌体的DNADNA复制复制n n裂解周期裂解周期早期：环状的早期：环状的DNA分子按分子按型双向复制，复制起点位型双向复制，复制起点位于于O基因内，需要基因内，需要O、P

47、基因编码蛋白的参与。基因编码蛋白的参与。晚期：控制滚环型复制的开关被启动，复制从晚期：控制滚环型复制的开关被启动，复制从型转型转变为滚环型复制，合成出一系列变为滚环型复制，合成出一系列DNA线性排列的多线性排列的多聚体分子。聚体分子。cos位点是位点是噬菌体正确包装的必需位点。噬菌体正确包装的必需位点。第69页，共129页，编辑于2022年，星期二第70页，共129页，编辑于2022年，星期二3 3、噬菌体的噬菌体的DNADNA复制复制n n溶原性周期溶原性周期溶原性周期溶原性周期 DNADNADNADNA复制以另外一种形式进行，稳定的整合到宿主染色体上并随之一起复制以另外一种形式进行，稳定的

48、整合到宿主染色体上并随之一起复制以另外一种形式进行，稳定的整合到宿主染色体上并随之一起复制以另外一种形式进行，稳定的整合到宿主染色体上并随之一起复制。复制。复制。复制。cIcIcIcI基因表达，合成参与溶菌周期活动的所有基因被阻遏的蛋白质。基因表达，合成参与溶菌周期活动的所有基因被阻遏的蛋白质。基因表达，合成参与溶菌周期活动的所有基因被阻遏的蛋白质。基因表达，合成参与溶菌周期活动的所有基因被阻遏的蛋白质。附着位点附着位点附着位点附着位点attatt，同大肠杆菌染色体，同大肠杆菌染色体，同大肠杆菌染色体，同大肠杆菌染色体DNADNADNADNA的局部同源位点之间的重组反应实的局部同源位点之间的重

49、组反应实的局部同源位点之间的重组反应实的局部同源位点之间的重组反应实现现现现。n n原噬菌体的删除作用原噬菌体的删除作用原噬菌体的删除作用原噬菌体的删除作用 整合作用需要整合作用需要整合作用需要整合作用需要intint基因的表达，是一种可逆的过程：一方面，噬菌体基因的表达，是一种可逆的过程：一方面，噬菌体基因的表达，是一种可逆的过程：一方面，噬菌体基因的表达，是一种可逆的过程：一方面，噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体基因组可以整合到大肠杆菌染色体基因组可以整合到大肠杆菌染色体基因组可以整合到大肠杆菌染色体DNADNA上，成为原噬菌体；另一方上，成为原噬菌体；另一方上，成为原噬菌体；另一方上

50、，成为原噬菌体；另一方面，在适当条件下，原噬菌体又可以脱离宿主主染色体，重新变成面，在适当条件下，原噬菌体又可以脱离宿主主染色体，重新变成面，在适当条件下，原噬菌体又可以脱离宿主主染色体，重新变成面，在适当条件下，原噬菌体又可以脱离宿主主染色体，重新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。噬菌体的噬菌体的噬菌体的噬菌体的删除，需要噬菌体删除，需要噬菌体删除，需要噬菌体删除，需要噬菌体xisxis基因和基因和基因和基因和intint基因的协同作用才能