第六章发酵过程参数测定精选文档.ppt

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1、第六章发酵过程参数测定本讲稿第一页，共八十四页由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，因此对传感器有特殊要求：因此对传感器有特殊要求：l插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌（材料、数据）（材料、数据）l传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好）防染菌（密封性好）l传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。（响应快、灵敏）（响应快、灵敏）l传感器性能要稳定，受气泡影响小。传感器性能要稳定，受气泡影响小。本讲稿第二页，共八

2、十四页带计算机数据采集与控制的生物反应系统带计算机数据采集与控制的生物反应系统P188本讲稿第三页，共八十四页原理：化学或物理信号原理：化学或物理信号 电信号电信号 放大放大 记录显示仪记录显示仪 控制器（与设定参数比较）控制器（与设定参数比较）发出调节信号发出调节信号 控制器动作控制器动作本讲稿第四页，共八十四页介绍几种常用的在线检测的传感器及其工作介绍几种常用的在线检测的传感器及其工作原理原理 lpH电极电极l溶氧电极溶氧电极它们是基础电极，以它们为基础可以制它们是基础电极，以它们为基础可以制作各种离子电极和酶电极作各种离子电极和酶电极本讲稿第五页，共八十四页（一）（一）pH pH测量测量

3、pH值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物过程控制是一个非常重要的参数。过程控制是一个非常重要的参数。1 1、pHpH的定义的定义影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，但对影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，但对于稀溶液为了避免在氢离子活度很小时表达方式于稀溶液为了避免在氢离子活度很小时表达方式上的麻烦上的麻烦引进引进pH=-lgH+H+=0.00001时时 用用pH5表示表示本讲稿第六页，共八十四页2 2、pHpH测量方法测量方法 pH试纸曾经是一种广泛采用的方法试纸曾经是一种广泛采用的方法优点：方便，易操作优点：方便，易操作缺点：它主观性较强缺点：它

4、主观性较强 质量差异，不同厂家不同批号的质量差异，不同厂家不同批号的pH试纸测出的试纸测出的pH值会有值会有较大的差别，有时甚至达较大的差别，有时甚至达0.51。对于一些要求较高的场合就适用对于一些要求较高的场合就适用pH试纸试纸pH电极电极本讲稿第七页，共八十四页（1）pH电极测量原理电极测量原理pH电极实际上是由参比电极与指示电极实际上是由参比电极与指示电极组成的一个自发电池，该电池电极组成的一个自发电池，该电池的表达式可写为：的表达式可写为：参比电极参比电极 溶液溶液X 指示电极指示电极该电池的参比电极的输出电位恒定，该电池的参比电极的输出电位恒定，指示电极的输出电位随被测体系中指示电极

5、的输出电位随被测体系中氢离子活度而变化。因此整个自发氢离子活度而变化。因此整个自发电池的电动势就是被测体系中氢离电池的电动势就是被测体系中氢离子活度的函数。子活度的函数。E=E0-ln1/=E0-2.303 pH式中式中E0对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从电对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从电位差计的位差计的E值可测出值可测出pH值。值。本讲稿第八页，共八十四页 甘汞电极（甘汞电极（a）232型（型（b）217型型1导线；导线；2加液口；加液口；3-KCl溶液；溶液；4素烧瓷芯；素烧瓷芯；5铂丝；铂丝；6Hg；7Hg2Cl2一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套

6、一根小玻璃管，一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套一根小玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端有糊状甘汞，汞其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端有糊状甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘汞不会漏失，小管和大和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘汞不会漏失，小管和大管之间充满管之间充满KCl溶液，末端用多孔陶瓷渗入到溶液中，实现电极引线与溶液溶液，末端用多孔陶瓷渗入到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。间的电导通。u参参比比电电极极本讲稿第九页，共八十四页 由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐由此可见，甘汞电极是由金属汞

7、及其难溶盐氯化亚氯化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半电池可表示汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半电池可表示为为Hg(L)Hg2Cl2(S)Cl-(L)电极电位产生于汞和甘汞的电极电位产生于汞和甘汞的界面，其电极反应为：界面，其电极反应为：2Cl-+2Hg Hg2Cl2+2e-其电极电位为其电极电位为Cl/HgCl,Hg=+ln1/由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活度有由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活度有关而不受被测溶液的酸碱度影响关而不受被测溶液的酸碱度影响本讲稿第十页，共八十四页（2）指示电极）指示电极对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变化对指示电极的电位值随

8、被测溶液氢离子活度的变化而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的电极而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的电极都可用来测定溶液的都可用来测定溶液的pH。l离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构离子选择性电极的结构其中敏感性膜部分随组成其中敏感性膜部分随组成材料的不同而各有特色。材料的不同而各有特色。测定测定pH值的玻璃电极的敏值的玻璃电极的敏感膜是厚度为感膜是厚度为101103mm的玻璃薄膜，其电阻为的玻璃薄膜，其电阻为50500m。本讲稿第十一页，共八十四页指示电极的关键是敏感膜指示电极的关键是敏感膜H+H+H+H+H+H+KCl溶液溶液待测溶液待测溶液浓度差引起电位

9、差浓度差引起电位差浓差电极浓差电极玻璃敏感膜玻璃敏感膜本讲稿第十二页，共八十四页（3）膜电位）膜电位膜电位是由于膜两侧离子活度的差异而产生，故可看作是一种膜电位是由于膜两侧离子活度的差异而产生，故可看作是一种浓差电位。玻璃电极在使用前必须先在水中浸泡一段时间，玻浓差电位。玻璃电极在使用前必须先在水中浸泡一段时间，玻璃膜表面吸收水分溶解，并且其中的一价阳离子（如璃膜表面吸收水分溶解，并且其中的一价阳离子（如Na+离子）离子）与水中与水中H+离子发生离子交换反应。离子发生离子交换反应。SiO-Na+H+SiO-H+Na+使膜表面形成以使膜表面形成以 SiO-H+为主要成分的水合硅胶层，为主要成分的

10、水合硅胶层，厚度约为厚度约为10-410-5mm本讲稿第十三页，共八十四页液液 试试水水合合硅硅胶胶层层干干 玻玻 璃璃 层层水水合合硅硅胶胶层层内内参参比比溶溶液液1 1 2 2 1-2以以1、2分别表示试液内分别表示试液内与内参比溶液中与内参比溶液中H+离子活度，离子活度，1、2分别表示外侧分别表示外侧与内侧硅胶层表面与内侧硅胶层表面H+离子离子活度，活度，由于水合硅胶层表面与内由于水合硅胶层表面与内（内参比溶液）、外（试（内参比溶液）、外（试液）溶液中的液）溶液中的H+离子从活离子从活度大的一方向小的一方迁度大的一方向小的一方迁移，使玻璃膜的外、内侧移，使玻璃膜的外、内侧分别产生相界电位

11、分别产生相界电位1和和2。经水浸泡后的玻璃膜截面成为三层结构，如图。经水浸泡后的玻璃膜截面成为三层结构，如图。则有：则有：外侧外侧:1=K1+内侧：内侧：2=K2+本讲稿第十四页，共八十四页可以认为，玻璃膜两侧表面性状基本相同，可以认为，玻璃膜两侧表面性状基本相同，故故K1=K2，水合硅胶层表面一价阳离子点已基本，水合硅胶层表面一价阳离子点已基本被质子占据，故被质子占据，故1=2，于是玻璃膜内、外，于是玻璃膜内、外侧之间的电位差侧之间的电位差膜膜=1-2=由于内参比溶液的由于内参比溶液的H+活度活度2一定，故玻璃膜电一定，故玻璃膜电位与待测溶液的位与待测溶液的H+离子活度（离子活度（pH值）成

12、线性值）成线性关系。关系。本讲稿第十五页，共八十四页膜膜=常数常数+在在25下：下：膜膜=常数常数-0.0591pH（试液）（试液）但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有微小差别，但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有微小差别，即使即使1=2时，时，膜膜0，这差别所产生的电位叫不，这差别所产生的电位叫不对称电位（对称电位（不对称不对称），这样整个玻璃电极（指示电），这样整个玻璃电极（指示电极）的电位应是内参比电位、膜电位与不对称电极）的电位应是内参比电位、膜电位与不对称电位之和。位之和。本讲稿第十六页，共八十四页玻璃玻璃=0 +膜膜+不对称不对称其中，其中，0 与与不对称不对称对于特定的电极是恒定对于特定

13、的电极是恒定的，故玻璃电极的电极电位与试液的，故玻璃电极的电极电位与试液pH值呈值呈线性关系。线性关系。（4）玻璃电极的性能）玻璃电极的性能l存在不对称电势存在不对称电势不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于膜内不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于膜内外表面状态不完全一样引起的，它与温度、玻璃组外表面状态不完全一样引起的，它与温度、玻璃组成、敏感膜厚度及加工状况等因素有关。不对称电成、敏感膜厚度及加工状况等因素有关。不对称电势可以用已知势可以用已知pH值的标准缓冲液来校正值的标准缓冲液来校正 本讲稿第十七页，共八十四页l零电势或等电势点零电势或等电势点 电极电位为零时的溶液电极电位为零时

14、的溶液pH值称为零电势值称为零电势pH值，该值取决于内参比溶液的值，该值取决于内参比溶液的pH值。含值。含有有0.025mol/l的的 KCl和等摩尔浓度的磷酸混和等摩尔浓度的磷酸混合缓冲液的等电势点为合缓冲液的等电势点为pH=7，在，在pH7时，玻璃电极的极性发生改变。时，玻璃电极的极性发生改变。本讲稿第十八页，共八十四页l玻璃电极的测量范围玻璃电极的测量范围 玻璃电极的实际转换系数并不是在整个玻璃电极的实际转换系数并不是在整个pH范围都是范围都是常数，因而响应曲线会偏离直线，实际的常数，因而响应曲线会偏离直线，实际的pH响应曲线响应曲线如图如图测量值测量值pH在碱性范围内在碱性范围内pH1

15、0 k降低，测量值偏高降低，测量值偏高在酸性范围内在酸性范围内pH1 k升高，测量值偏低升高，测量值偏低本讲稿第十九页，共八十四页（5）玻璃电极的使用限制）玻璃电极的使用限制l对于蛋白质等粘度较大的测量体系，容易对于蛋白质等粘度较大的测量体系，容易在玻璃电极敏感膜上产生沉积，应设法缩在玻璃电极敏感膜上产生沉积，应设法缩短电极的沉浸时间或设法对电极表面进行短电极的沉浸时间或设法对电极表面进行清洗，工业测试中常用特制毛刷或超声波清洗，工业测试中常用特制毛刷或超声波清洗电极表面。清洗电极表面。l强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液，如氢强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液，如氢氟酸溶液会破坏电极氟酸溶液会破

16、坏电极l脱水性介质，如无水乙醇、浓硫酸会破坏水脱水性介质，如无水乙醇、浓硫酸会破坏水合硅胶层合硅胶层本讲稿第二十页，共八十四页（6）复合电极）复合电极将两支电极都装在将两支电极都装在一根玻璃管中，这一根玻璃管中，这种电极叫复合电极，种电极叫复合电极，工业上在线检测大工业上在线检测大都使用这种电极。都使用这种电极。它结构紧凑，便于它结构紧凑，便于安装。安装。本讲稿第二十一页，共八十四页pH复合电极的结构复合电极的结构屏蔽引线用于减少噪声（电磁波、感应）。当电屏蔽引线用于减少噪声（电磁波、感应）。当电极插入被测溶液中后，参比电极极插入被测溶液中后，参比电极 隔膜隔膜 被测被测体系体系 玻璃敏感膜玻

17、璃敏感膜 内参比电极之间达到电内参比电极之间达到电导通，组成原电池，其原理与双电极导通，组成原电池，其原理与双电极pH计的工计的工作原理完全相同，只是结构更紧凑，使用更方便。作原理完全相同，只是结构更紧凑，使用更方便。本讲稿第二十二页，共八十四页（二）（二）敏化离子选择性电极敏化离子选择性电极以离子选择性电极为基础电极，通过化学反以离子选择性电极为基础电极，通过化学反应或生化反应使离子选择性电极的响应得到应或生化反应使离子选择性电极的响应得到敏化，叫作敏化离子选择性电极。包括有气敏化，叫作敏化离子选择性电极。包括有气敏电极和酶电极等。敏电极和酶电极等。本讲稿第二十三页，共八十四页气敏电极是基于

18、界面化学反应的敏化电极气敏电极是基于界面化学反应的敏化电极 在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎水在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎水的透气膜，在透气膜和这种离子选择性电极之间的透气膜，在透气膜和这种离子选择性电极之间充以中间溶液，透气膜不允许溶液中的离子通过，充以中间溶液，透气膜不允许溶液中的离子通过，而只允许被测定的气体通过，直到透气膜内外两而只允许被测定的气体通过，直到透气膜内外两边该气体的分压相等。边该气体的分压相等。进入透气膜的气体与中间溶液起反应，从而进入透气膜的气体与中间溶液起反应，从而使中间溶液中的某一被离子选择性电极响应的物使中间溶液中的某一被离子选择性电极响应的物质的量发

19、生变化，并通过选择性电极电位反映出质的量发生变化，并通过选择性电极电位反映出来，达到间接表征被测气体含量的目的。来，达到间接表征被测气体含量的目的。本讲稿第二十四页，共八十四页 能用气敏电极测定气体有能用气敏电极测定气体有CO2、NH3、SO2、NO2、H2S、HCN、HF、Cl2、Br2、I2的蒸的蒸气等，其中以氨电极比较成熟，应用较广。气等，其中以氨电极比较成熟，应用较广。1、NH4的测量的测量氨是酶反应中最常见的产物和反应物，氨氨是酶反应中最常见的产物和反应物，氨离子可用氨气敏电极来测定。常用的氨电离子可用氨气敏电极来测定。常用的氨电极为：极为：本讲稿第二十五页，共八十四页1电极管；电极

20、管；2透气膜；透气膜；30.1mol/LNH4Cl溶液；溶液；4pH玻璃电极；玻璃电极；5Ag/AgCl参比电极；参比电极；6，7玻璃膜；玻璃膜；8可卸电极头；可卸电极头；9内参比溶液，内参比溶液，10内参比电极内参比电极在电极管内装有玻璃在电极管内装有玻璃电极电极Ag-AgCl电电极，底部装有一微孔极，底部装有一微孔透气膜，玻璃电极的透气膜，玻璃电极的敏感膜紧贴于透气膜敏感膜紧贴于透气膜上，中间有一极薄的上，中间有一极薄的液层，当氨通过透气液层，当氨通过透气膜渗入内充液薄层，膜渗入内充液薄层，即发生如下反应即发生如下反应NH3+H2O=NH4+OH-本讲稿第二十六页，共八十四页内充液中内充液

21、中NH4+远大于生成的远大于生成的NH4+，故其变，故其变化可以忽略不计，而薄层的化可以忽略不计，而薄层的pH则由于则由于OH-的生成而升高，因此由玻璃电极检的生成而升高，因此由玻璃电极检出出OH-的浓度，即可检出的浓度，即可检出NH3的浓度，电的浓度，电极电位与氨的浓度是对数响应。极电位与氨的浓度是对数响应。透气膜一般是透气膜一般是0.1mm厚的微孔聚四氟乙厚的微孔聚四氟乙烯，内充液为烯，内充液为0.1mol/L的的NH4Cl溶液。溶液。氨电极使用的上限为氨电极使用的上限为1mol/L,下限为下限为10-6mol/L。本讲稿第二十七页，共八十四页2、CO2的测量的测量（1）CO2电极（测溶液

22、中的电极（测溶液中的CO2）结构与氨电极类似。测量结构与氨电极类似。测量CO2时，气体透过电极时，气体透过电极膜，膜，CO2和水反应，达到以下平衡：和水反应，达到以下平衡：CO2+H2O HCO3-+H+产生的氢离子引起产生的氢离子引起pH的变化，就可以测出的变化，就可以测出溶解溶解CO2的浓度。如果的浓度。如果CO2扩散在水或扩散在水或NaHCO3的水溶液中，它们的的水溶液中，它们的pH值会依据下值会依据下列的式子而变化：列的式子而变化：本讲稿第二十八页，共八十四页在纯水中在纯水中 pH=常数常数lg 在在NaHCO3溶液中溶液中 pH=常数常数-lgpCO2在在NaHCO3溶液中测量能方便

23、地确定溶液中测量能方便地确定pH和和pCO2之间的对应关系。使用特殊的气体渗透之间的对应关系。使用特殊的气体渗透膜，它能够使膜，它能够使CO2扩散到扩散到NaHCO3溶液中去，溶液中去，溶液中溶液中pH变化就是变化就是CO2实际分压的测量值实际分压的测量值 本讲稿第二十九页，共八十四页(2)尾气尾气CO2的测量的测量常用的尾气测定仪是常用的尾气测定仪是不分光红外线二氧化碳测定仪不分光红外线二氧化碳测定仪（简称（简称IR），其精度高，可达，其精度高，可达 0.5%，量程的线性范围大，量程的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞培养时常被采用。虽然仪器价格高，但在生物细胞培养时常被采用。不分光红

24、外线不分光红外线CO2气体分析原理是：除了单原子气体气体分析原理是：除了单原子气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如氧、氢、（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段（即微米级）氮等）外，几乎所有气体都在红外波段（即微米级）具有不同的红外吸收光谱，具有不同的红外吸收光谱，CO2的红外吸收峰在的红外吸收峰在2.62.9m和和4.14.5m之间有两个吸收峰，根据之间有两个吸收峰，根据吸收峰值可以求出吸收峰值可以求出CO2的所含浓度。的所含浓度。本讲稿第三十页，共八十四页（3）尾气氧的仪器分析）尾气氧的仪器分析采用热磁氧分析仪测定采用热磁氧分析仪测定原理是氧

25、具有高顺磁性。在磁场中，氧气的原理是氧具有高顺磁性。在磁场中，氧气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少。将排磁化率几乎完全取决于含氧气的多少。将排气通入热磁氧分析仪，就可测出排气氧的含气通入热磁氧分析仪，就可测出排气氧的含量。量。本讲稿第三十一页，共八十四页通过通过RQ值的测定，可以分析微生物可能利用值的测定，可以分析微生物可能利用的基质的基质氧化型的或还原型的，分析微生物氧化型的或还原型的，分析微生物生长阶段，分析补料的速率是否合理生长阶段，分析补料的速率是否合理例如，储炬等发现例如，储炬等发现RQ的变化与菌体生长、营

26、养状况以及产生抗的变化与菌体生长、营养状况以及产生抗生素密切相关。如生素密切相关。如20h菌丝开始发生膨大，而此时菌丝开始发生膨大，而此时RQ达到峰值达到峰值开始下降；开始下降；40h左右左右RQ降至谷底开始回升，正是在这段时间产降至谷底开始回升，正是在这段时间产生抗生素启动。由于生抗生素启动。由于RQ具有以上的关联特性，他们尝试在具有以上的关联特性，他们尝试在avemectin发酵过程中利用发酵过程中利用RQ作为补料控制的参考之一。作为补料控制的参考之一。3 3、排气氧、排气、排气氧、排气COCO2 2和呼吸熵和呼吸熵本讲稿第三十二页，共八十四页酶电极与气敏电极相似，是在离子选择性电极的表面

27、酶电极与气敏电极相似，是在离子选择性电极的表面覆盖一个涂层，把酶固定在涂层内，通过酶反应产生覆盖一个涂层，把酶固定在涂层内，通过酶反应产生的物质的测定，可以推算出反应物的量。的物质的测定，可以推算出反应物的量。例如脲酶电极，把脲酶固定在例如脲酶电极，把脲酶固定在NH3气敏电极或气敏电极或CO2气敏气敏电极的表面，在脲酶的催化下，尿素可以发生如下的分解电极的表面，在脲酶的催化下，尿素可以发生如下的分解反应：反应：CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2通过通过NH3或或CO2气敏电极测定气敏电极测定NH3或或CO2的分的分压即可达到间接测定尿素的目的。压即可达到间接测定尿素的目的。4 4、酶电

28、极、酶电极本讲稿第三十三页，共八十四页（三）（三）溶氧的测定溶氧的测定 对于好氧微生物来说氧的供应十分重要，对于好氧微生物来说氧的供应十分重要，了解发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键方了解发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键方面。现在发酵中溶氧测定大多用溶氧电极来测面。现在发酵中溶氧测定大多用溶氧电极来测定。溶氧电极可分为极谱型和原电池型。定。溶氧电极可分为极谱型和原电池型。极谱型极谱型 需极化电压及放大器，耗氧少，受气流需极化电压及放大器，耗氧少，受气流影响小影响小 原电池型原电池型 简单便宜，适于中小罐。耗氧较大，受简单便宜，适于中小罐。耗氧较大，受气流和气泡影响大。气流和气泡影响大。本讲稿

29、第三十四页，共八十四页现在国内外测定溶液中的溶解氧基本上现在国内外测定溶液中的溶解氧基本上用用极谱型的复膜氧电极极谱型的复膜氧电极。复膜氧电极可分为复膜氧电极可分为 敞口式敞口式 封闭式封闭式本讲稿第三十五页，共八十四页敞口式敞口式 在电极的玻璃管上有一个小孔，在电极的玻璃管上有一个小孔，使玻璃管与环境相通，这样在蒸汽灭菌使玻璃管与环境相通，这样在蒸汽灭菌时电极玻璃管内外压力相等，有利于保时电极玻璃管内外压力相等，有利于保护电极护电极封闭式的电极玻璃管上没有小孔，蒸汽灭封闭式的电极玻璃管上没有小孔，蒸汽灭菌时玻璃管受压大菌时玻璃管受压大现在使用的大多数是敞口式电极现在使用的大多数是敞口式电极本

30、讲稿第三十六页，共八十四页1 1、复膜氧电极的工作原理、复膜氧电极的工作原理阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由铅、阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由铅、锡、铝等组成锡、铝等组成。当给电极施加极谱电压。当给电极施加极谱电压（0.60.8V负电压）时，溶液中的氧就在阴负电压）时，溶液中的氧就在阴极被还原。当产生的电流与溶液中氧含量成极被还原。当产生的电流与溶液中氧含量成正比时，此时的电极电流为饱和电流，此时正比时，此时的电极电流为饱和电流，此时的电压为极谱电压。氧浓度与饱和电流成正的电压为极谱电压。氧浓度与饱和电流成正比关系。比关系。本讲稿第三十七页，共八十四页在阴极表面发生的电极反应：在阴极

31、表面发生的电极反应：1/2O2+H2O+e-2OH-阴极上失去电子后，阳极反应产生的电子流向阴极上失去电子后，阳极反应产生的电子流向阴极，于是在二电极之间形成电流，将氧的信阴极，于是在二电极之间形成电流，将氧的信号转变成电信号。氧浓度越高，电流越大。号转变成电信号。氧浓度越高，电流越大。阳极上的反应是：阳极上的反应是：Pb+2ACO-Pb(ACO)2+2e-化学信号转变成电信号化学信号转变成电信号本讲稿第三十八页，共八十四页2 2、电极的构造、电极的构造在阴极银（铂）片在阴极银（铂）片的前面包一张半透的前面包一张半透膜，氧可以透过半膜，氧可以透过半透膜达到阴极上进透膜达到阴极上进行电极反应。该

32、半行电极反应。该半透膜固定在阴极表透膜固定在阴极表面。小孔用于压力面。小孔用于压力补偿。补偿。本讲稿第三十九页，共八十四页3 3、溶氧电极的影响因素、溶氧电极的影响因素（1）电极的灵敏度）电极的灵敏度电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定条电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定条件下当膜成为氧扩散的控制因素时，氧分压的件下当膜成为氧扩散的控制因素时，氧分压的变化与电流输出的稳态有以下对应式：变化与电流输出的稳态有以下对应式：IS=NFA(pm/dm)pO2式中式中IS电极电流电极电流 N电子数电子数 F法拉第常数法拉第常数 A阴极表面积阴极表面积 Pm氧在复膜中的穿透系数氧在复膜中的穿透系数

33、PO2被测溶液中的氧分压被测溶液中的氧分压 dm膜的厚度膜的厚度本讲稿第四十页，共八十四页增加灵敏度因素：增加灵敏度因素：l增加膜穿透系数增加膜穿透系数pml减小膜厚度减小膜厚度dml增加阴极表面积增加阴极表面积A扩散速度扩散速度 因为电极表面的氧浓度与液因为电极表面的氧浓度与液体主流中的氧浓度存在浓度梯度体主流中的氧浓度存在浓度梯度搅拌速度、通气量和培养液粘度搅拌速度、通气量和培养液粘度本讲稿第四十一页，共八十四页（2）温度的影响）温度的影响电极还会受温度的影响电极还会受温度的影响l氧在溶液中的溶解度随温度上升而下降氧在溶液中的溶解度随温度上升而下降l温度上升使膜穿透系数增加，且氧的内相扩温

34、度上升使膜穿透系数增加，且氧的内相扩散增加，增加了电化学反应速率。散增加，增加了电化学反应速率。由于后者影响比较显著，因此随着温度的上升，由于后者影响比较显著，因此随着温度的上升，电极输出电流呈指数上升。所以电极须有温度电极输出电流呈指数上升。所以电极须有温度补偿功能，才能真正反映出氧溶解度变化的情补偿功能，才能真正反映出氧溶解度变化的情况。况。本讲稿第四十二页，共八十四页4 4、电极的标定、电极的标定一般测定中应进行以下二点标定一般测定中应进行以下二点标定（1）零点标定）零点标定用饱和用饱和Na2SO3作无氧状态的溶液，将氧电极放入该溶液中，作无氧状态的溶液，将氧电极放入该溶液中，显示仪表上

35、可见溶氧浓度下降，待下降稳定后，调节零点旋显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降稳定后，调节零点旋钮显示零值。钮显示零值。（2）饱和校正（满刻度）饱和校正（满刻度）进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电极进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上可见放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至100%即为饱和值。即为饱和值。本讲稿第四十三页，共八十四页5.5.摄氧率摄氧率r r的测定的测定(1)用溶氧电极测定用溶氧电极测定r要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的变化。要求电极响应时

36、间短，能跟上摄氧率的变化。测定前先用纯水标定电极，得到单位电流代测定前先用纯水标定电极，得到单位电流代表的溶氧浓度：表的溶氧浓度：I饱饱在饱和氧浓度在饱和氧浓度C*时的电流值时的电流值I残残氧浓度为零时电极所具有的电流氧浓度为零时电极所具有的电流本讲稿第四十四页，共八十四页若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，保持搅拌，在罐顶通氮气，赶走上面的空气。保持搅拌，在罐顶通氮气，赶走上面的空气。此时，由于耗氧，此时，由于耗氧，CL下降，仪表上电流值也不下降，仪表上电流值也不断下降。断下降。R=(-i/t)t停止供气后停止供气后CL下降到最低点时所下降到最低点

37、时所需时间需时间 i在在t时间内的电流变化时间内的电流变化本讲稿第四十五页，共八十四页(2)用热磁氧分析仪测定用热磁氧分析仪测定原理是氧具有高顺磁性，氧气的磁化率比原理是氧具有高顺磁性，氧气的磁化率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少，根据排气几乎完全取决于含氧气的多少，根据排气中的氧含量，可以算出摄氧率中的氧含量，可以算出摄氧率设进口氧含量为设进口氧含量为21%r=每小时通气量每小时通气量（0.21-出口氧出口氧%）*22.41000*V本讲稿第四十六页，共八十四页6 6、氧传递系数、氧传递系数kLakLa的测定的测定设备的设备

38、的KLa可以用亚硫酸钠法来测定，但它可以用亚硫酸钠法来测定，但它是在非发酵过程中测定的，不能完全代表发是在非发酵过程中测定的，不能完全代表发酵过程中的酵过程中的KLa值。其它测定方法有值。其它测定方法有(1)用溶氧电极和热磁氧分析仪共同测定用溶氧电极和热磁氧分析仪共同测定在发酵过程中如果溶氧浓度恒定在一定值表在发酵过程中如果溶氧浓度恒定在一定值表示此时供氧和需氧达到平衡，即示此时供氧和需氧达到平衡，即 r=KLa(C*-CL)式中式中C*可以查得，可以查得，CL可以用溶氧电极测得，可以用溶氧电极测得，r也可算出，因此可求得也可算出，因此可求得KLa值值本讲稿第四十七页，共八十四页例：一装料为例

39、：一装料为7L的发酵罐，通气量的发酵罐，通气量1l/L.m，操作压力为，操作压力为0.3Kg/cm2，在某发酵时间，在某发酵时间内发酵液的溶氧浓度为饱和氧浓度的内发酵液的溶氧浓度为饱和氧浓度的25%，空气进入时的氧含量为，空气进入时的氧含量为21%，废气排出，废气排出时的氧含量为时的氧含量为19.8%（1atm时氧饱和浓度时氧饱和浓度C*=0.2mmol/L）求此时菌的摄氧率）求此时菌的摄氧率r=1*7*60/22.4*103*(0.21-0.198)/7KLar/0.26(0.21.0.198)本讲稿第四十八页，共八十四页(2)单用溶氧仪测定单用溶氧仪测定用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时供

40、氧和用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时供氧和需氧达到平衡，溶氧是一条水平线。这是停止需氧达到平衡，溶氧是一条水平线。这是停止通气，保持搅拌，在罐顶通入氮气，赶掉氧气。通气，保持搅拌，在罐顶通入氮气，赶掉氧气。由于微生物对氧的利用，溶氧迅速下降，过一由于微生物对氧的利用，溶氧迅速下降，过一段时间溶氧下降缓慢，待溶氧到最低点后在恢段时间溶氧下降缓慢，待溶氧到最低点后在恢复通气。这样可以得到溶氧随时间变化的曲线复通气。这样可以得到溶氧随时间变化的曲线本讲稿第四十九页，共八十四页CL/t=KLa(C*-CL)-rCL=-1/KLa(CL/t+r)+C*将将CL对对CL/t+r作图，得到一条直线，斜率为

41、作图，得到一条直线，斜率为-1/KLa因此可求得因此可求得KLa,延长直线与纵坐标相交点为延长直线与纵坐标相交点为C*溶解氧浓度随通气变化的情况溶解氧浓度随通气变化的情况 KLa的求取的求取本讲稿第五十页，共八十四页二二 参数的离线检测进展参数的离线检测进展（一）（一）利用高效液相（利用高效液相（HPLC）分析代谢中间）分析代谢中间产物产物 通过中间代谢产物的测定可以深入了解通过中间代谢产物的测定可以深入了解微生物代谢的流向，依此来分析代谢的情微生物代谢的流向，依此来分析代谢的情况。从而有的放矢的控制发酵过程况。从而有的放矢的控制发酵过程本讲稿第五十一页，共八十四页例：鸟苷生产例：鸟苷生产在鸟

42、苷发酵中，发现发在鸟苷发酵中，发现发酵到酵到40小时后鸟苷合成小时后鸟苷合成速率下降，但糖耗速率速率下降，但糖耗速率并未下降，而且由于耗并未下降，而且由于耗糖糖,使发酵过程使发酵过程pH下降，下降，补入氨水增多。那么糖补入氨水增多。那么糖耗到哪里去了呢？耗到哪里去了呢？于是进行以下一些于是进行以下一些测定与分析测定与分析本讲稿第五十二页，共八十四页什么因素导致什么因素导致pH下降？下降？1 1、有机酸的积累、有机酸的积累 有机酸积累有机酸积累 pH下降下降 补加氨水补加氨水 在正常代谢情况下，细胞通过在正常代谢情况下，细胞通过EMP途径和途径和TCA循循环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按

43、照细环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的积累的积累若发酵后期有机酸积累会引起加入的若发酵后期有机酸积累会引起加入的NH4+积累，积累，相应出现产苷速率下降。相应出现产苷速率下降。代谢不正常代谢不正常本讲稿第五十三页，共八十四页测定以下中间物测定以下中间物发酵后期丙酮酸积累发酵后期丙酮酸积累本讲稿第五十四页，共八十四页2 2、氨基酸的积累、氨基酸的积累在有机酸分析的基础上进一步通过在有机酸分析的基础上进一步通过HPLC测测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结果

44、发现总氨基酸积累并且其积累晚于有机酸果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有机酸和和NH4+积累。积累。本讲稿第五十五页，共八十四页氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在8小时之前小时之前已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在48小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累量达到初始量的中积累量达到初始量的12.6倍之

45、多，其它十余种倍之多，其它十余种氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵过程中氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。是导致代谢流迁移所致。本讲稿第五十六页，共八十四页3 3、分析原因、分析原因发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以推断由于可以推断由于EMP途径代谢流的增加造成了丙途径代谢流的增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙

46、氨酸丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（GS）造成反）造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。本讲稿第五十七页，共八十四页丙酮酸积累丙酮酸积累 氨水补加增加氨水补加增加NH4+积累积累抑制抑制GS抑制抑制TCA循环循环丙酮酸积累丙酮酸积累激活磷酸果糖激酶激活磷酸果糖激酶EMP流量增加流量增加恶性循环恶性循环丙氨酸积丙氨酸积累累本讲稿第五十八页，共八十四页（二）（二）代谢流迁移的酶学证明代谢流迁移的酶学证明糖代谢途径关键酶糖代谢途径关键酶糖酵解途径（糖酵解途径（EMP）在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：磷

47、酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶 磷酸果糖激酶的时序分析磷酸果糖激酶的时序分析本讲稿第五十九页，共八十四页12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，所以所以PFK的活力相对较低。的活力相对较低。24小时后随着发酵过程进入小时后随着发酵过程进入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活力也平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平稳。但是到基本保持平稳。但是到40小时以后，鸟苷形成速率减慢小时以后，鸟苷形成速率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，PFK相对相对酶活

48、增加，这表明此时通过酶活增加，这表明此时通过EMP途径的糖代谢通量已有途径的糖代谢通量已有了明显的增加。了明显的增加。本讲稿第六十页，共八十四页丙酮酸激酶时序分析丙酮酸激酶时序分析本讲稿第六十一页，共八十四页丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在在24小时就基本上达到其最大值，随后维持在小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时恒定的水平，这表明在糖代谢时EMP途径代途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因素造成代谢流迁移的主要因素 磷酸戊糖途径（磷酸戊糖途径（

49、HMP）关键酶）关键酶磷酸戊糖途径中主要的限速酶是磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6磷酸葡萄糖脱磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化氢酶，该酶催化6磷酸葡萄糖脱氢生成磷酸葡萄糖脱氢生成6磷酸葡磷酸葡萄糖酸内酯萄糖酸内酯。本讲稿第六十二页，共八十四页6磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析由图可以看到，早期由图可以看到，早期6磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过前期菌体合成代谢比较活跃，通过HMP途径合成用于细胞成分的途径合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持EMP和和HMP途径通途

50、径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到40小时后，小时后，6磷磷酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在过程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在HMP途径通量下降而途径通量下降而EMP途径通量增加。途径通量增加。本讲稿第六十三页，共八十四页三羧酸三羧酸(TCA)循环的关键酶循环的关键酶三羧酸循环是三羧酸循环是“消耗消耗”丙酮酸的途径，三羧丙酮酸的途径，三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的酸流量大丙酮酸不会