第二章基因工程的酶学基础PPT讲稿.ppt

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1、第二章基因工程的酶学基础第1页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第2页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础第一节限制性核酸内切酶第一节限制性核酸内切酶 第二节第二节DNA连接酶连接酶 第三节第三节DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶 第四节第四节DNA修饰酶修饰酶 第五节外切核酸酶第五节外切核酸酶 第六节单链内切核酸酶第六节单链内切核酸酶 第七节第七节RNA酶酶 第3页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院本章重点掌握的内容本章重点掌握的内容限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶

2、、星星活性。限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、星星活性。II型限制性核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的型限制性核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的原因、影响酶活性的因素。原因、影响酶活性的因素。DNA聚合酶的种类及性质聚合酶的种类及性质 其它常用工具酶的功能及其用途。其它常用工具酶的功能及其用途。第4页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制 限制限制/修饰系统修饰系统(R-M,Restriction-modificati

3、onsystem)第5页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶大肠杆菌大肠杆菌B大肠杆菌大肠杆菌K修饰的修饰的phage(B)EOP=10-4（限制作用）（限制作用）EOP=10-4（限制作用）（限制作用）EOP=1（修饰作用）（修饰作用）修饰的修饰的phage(K)人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的制的限制与修饰现象限制与修饰现象简称（简称（R/M体系体系）。）。细菌的细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别体系类似于免疫系统

4、，能辨别自身的自身的DNA与外来的与外来的DNA，并能使后者降解掉。，并能使后者降解掉。一、寄主的限制与修饰现象一、寄主的限制与修饰现象EOPEfficiencyofplate成斑率第6页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第7页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象一、寄主的限制与修饰现象 限制限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体入侵的噬菌

5、体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。限制作用限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳，维护宿主遗传稳定的保护机制。定的保护机制。第8页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象一、寄主的限制与修饰现象 修饰修饰(modification)：指寄主本身的：指寄主本身的DNA，由于在合成后通，由于在合成后通过过甲基化酶甲基化酶的作用得以甲基化，使的作用得以甲基化，使DNA得以修饰得以修饰，从而免遭自从而免遭自身限制性酶的破坏。身

6、限制性酶的破坏。修饰作用修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。和外来遗传物质的目的。第9页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象一、寄主的限制与修饰现象 1968Linn和和Arber从从E.coliB中发现限制酶中发现限制酶 1970Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶 1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获

7、得诺贝尔生物医学奖对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔生物医学奖第10页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶一、寄主的限制与修饰现象一、寄主的限制与修饰现象 寄主控制的限制与修饰的作用寄主控制的限制与修饰的作用一是保护自身的一是保护自身的DNA不受限制；不受限制；二是破坏外源二是破坏外源DNA使之迅速降解。使之迅速降解。基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。第11页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶二、限制

8、性内切酶的类型二、限制性内切酶的类型 限制性核酸内切酶（限制性酶）限制性核酸内切酶（限制性酶）：在细胞内能够识别双链：在细胞内能够识别双链DNA分子中分子中的特定核苷酸序列，并对的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。分子进行切割的一种酶。据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为活性，可分为、型。型。主要特性主要特性型型型型型型限制修饰限制修饰 蛋白结构蛋白结构 辅助因子辅助因子 识别序列识别序列 切割位点切割位点双功能（具甲基化）双功能（具甲基化）异源三聚体异源三聚体 ATPMg2+SAM距识别

9、序列距识别序列1kb处处 随机性切割随机性切割单一功能单一功能 同源二聚体同源二聚体 Mg2+4-6bp回文序列回文序列 识别序列内或附近识别序列内或附近特异切割特异切割双功能（具甲基化）双功能（具甲基化）异源二聚体异源二聚体 ATPMg2+距识别序列下游距识别序列下游24-26bp处处 随机性切割随机性切割基因工程中使用注：注：SAM为为S腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸第12页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶1.I型限制性内切酶型限制性内切酶首先由首先由M.Meselson和和R.Yuan在在1968年从大肠杆菌年从大肠杆菌

10、B株和株和K株分株分离的。离的。如如EcoB和和EcoK。（1）识别位点序列）识别位点序列未甲基化修饰的特异序列。未甲基化修饰的特异序列。EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC第13页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（2）切割位点）切割位点 在距离特异性识别位点约在距离特异性识别位点约10001500bp处随机切开一条单处随机切开一条单链。链。（3）作用机理）作用机理 需需ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。Recognizesitecut1-1.5kb第14页，共97页

11、，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2.II类限制性内切酶类限制性内切酶首先由首先由H.O.Smith和和K.W.Wilcox在在1970年从流感嗜血菌中分年从流感嗜血菌中分离出来。离出来。分离的第一个酶是分离的第一个酶是Hind（1）识别位点序列）识别位点序列未甲基化修饰的双链未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列），上的特殊靶序列（多数是回文序列），与与DNA的来源无关。的来源无关。ABCCBAABCCBAABNBAABNBA或或第15页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制

12、性核酸内切酶限制性核酸内切酶（2）切割位点）切割位点 识别位点处。识别位点处。切开双链切开双链DNA。形成粘性末端（。形成粘性末端（stickyend）或平齐末端）或平齐末端（bluntend）。如：）。如：EcoRI5-GAATTC-33-CTTAAG-5PstI5-CTGCAG-33-GACGTC-5产生粘性末端产生粘性末端EcoRV5-GATATC-33-CTATAG-5产生平齐末端产生平齐末端第16页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindHind切割位点核酸内切酶Hind对双链DNA分子的

13、切割作用第17页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶3.III类限制性内切酶类限制性内切酶在完全肯定的位点切割在完全肯定的位点切割DNA(识别位点下游识别位点下游24-26bp)，但反，但反应需要应需要ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。EcoP1:AGACC EcoP15:CAGCAG 在基因工程操作中用途不大。在基因工程操作中用途不大。第18页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶主要特性主要特性型型型型型型限制修饰限制修饰 蛋白

14、结构蛋白结构 辅助因子辅助因子 识别序列识别序列 切割位点切割位点多功能（具甲基化）多功能（具甲基化）异源三聚体异源三聚体 ATPMg2+SAM距识别序列距识别序列1kb处处 随机性切割随机性切割单一功能单一功能 同源二聚体同源二聚体 Mg2+4-6bp回文序列回文序列 识别序列内或附近识别序列内或附近特异切割特异切割双功能（具甲基化）双功能（具甲基化）异源二聚体异源二聚体 ATPMg2+距识别序列下游距识别序列下游24-26bp处处 随机性切割随机性切割核酸限制性内切酶的类型及主要特性核酸限制性内切酶的类型及主要特性第19页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第

15、一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶三、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的命名 1973年年H.OSmith和和D.Nathans提议的命名系统，命名原则提议的命名系统，命名原则如下：如下：1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的个字母的略语表示寄主菌的物种名。略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli）用）用Eco表示；表示；流感嗜血菌（流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用）用Hin表示。表示。2.用一个右下标的大写字母表示用一个右下标的大写字母表示菌株或型菌株或型。如。如Ec

16、oK,EcoR（现在（现在都写成平行，如都写成平行，如EcoRI）。）。3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如字母表示。如EcoRI，EcoRV。4.限制酶前面要带上限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上修饰酶前面要带上M（Modification）(现已省略现已省略)。第20页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶三、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的命名 EcoRIEscherichia属名属名Coli种名种

17、名Ry13株系株系编号编号若若种种名名头头2个个字字母母相相同同则则其其中中一一个个可可用用种种名名的的第第一一和和第第三三个字母。个字母。第21页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶四、四、限制性核酸内切酶的基本特性限制性核酸内切酶的基本特性（一）识别序列（一）识别序列 识别顺序的碱基数一般为识别顺序的碱基数一般为4-6bp，少数识别更长，多数识别位，少数识别更长，多数识别位点具有旋转对称性点具有旋转对称性（回文结构），（回文结构），少数的识别位点在切割位点之少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性外，具旋转对称性4bp

18、HpaC CGGHaeGG CC5bpAvaG GWCCEcoR CCWGG6bpBamHG GATTCSmaCCC GGG11bpBg1GCCNNNN NGGC12bpBstXCCANNNNN NTGCN=A,T,G,C第22页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶四、四、限制性核酸内切酶的基本特性限制性核酸内切酶的基本特性 （二）切割方式（二）切割方式 限制性核酸内切酶切割双链限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中，水解磷酸二酯键中3位酯键位酯键产生两个末端，末端结构是产生两个末端，末端结构是5-P和和3-OH，

19、产生，产生3种不同的切口。种不同的切口。第23页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶1.5突出的末端突出的末端第24页，共97页，编辑于2022年，星期三EcoRI等产生的5粘性末端5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C5 EcoRI 37 5G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-APOH-G-C-T-C5 退火 4-7 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C

20、5生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第25页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2.3突出的末端突出的末端第26页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶PstI等产生的3粘性末端5C-T-G-C-A-G33G-A-C-G-T-C5 PstI 37 5C-T-G-C-A-OHP-G33G-POH-A-C-G-T-C5 退火 4-7 5C-T-G-C-A-G33G-A-C-G-T-C5第27页，共97页，编辑于2022年，星期

21、三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶粘性末端的意义粘性末端的意义 连接便利连接便利i）不同的）不同的DNA双链：双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。这比连接两个平齐末端容易的多。第28页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第29页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶ii）同一个）同一个DNA分子内连接：分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。通

22、过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。5末端标记末端标记 凸出的凸出的5末端可用末端可用DNA多核苷酸激酶进行多核苷酸激酶进行32P标记。标记。凸出的凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如（如AAA或或TTT等）造成人工粘性末端。等）造成人工粘性末端。补平成平齐末端补平成平齐末端 粘性末端可以用粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。聚合酶补平成平齐末端。第30页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶3.平头末端平头末端第31页，共97页，编辑于2022年，星期

23、三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶PvuII等产生的平头末端5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C5 PvuII 37 5G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G33C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C5第32页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第33页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶四、四、限制性核酸内切酶的基本特性限制

24、性核酸内切酶的基本特性（二）切割方式（二）切割方式 同裂酶（同裂酶（isoschizomers）：）：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生不同或相同的末端。进行同样的切割，产生不同或相同的末端。同尾酶（同尾酶（isocaudamer）：）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大(相容性末端相容性末端)。第34页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学

25、院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶同尾酶举例：同尾酶举例：如：如：BamHIGGATCC BglIIAGATCT MboI,Sau3AINGATCN 常用的限制酶常用的限制酶BamH、Bcl、Bgl、Sau3A和和Xho就是一组就是一组同尾酶，它们切割同尾酶，它们切割DNA之后都形成由之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端个核苷酸组成的粘性末端。第35页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶五、五、限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件 1U核酸内切酶的酶活性：在最适反应条件和温度下，保温核酸

26、内切酶的酶活性：在最适反应条件和温度下，保温1小时，使小时，使1gDNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。表示。大部分大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：Tris-HCl50mmol/LpH7.5MgCl210mmol/LNaCl0-150mmol/LDTT1mmol/LVolume20-100LTemperature37Time1-1.5h（DDT：二硫苏糖醇：二硫苏糖醇BSA：牛血清蛋白：牛血清蛋白)0-50mM低盐酶低盐酶100mM中盐酶中盐酶150mM高盐酶高盐酶Buffer第36页，共

27、97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶五、五、限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件 在灭菌的在灭菌的1.5ml离心管中进行限制性酶切反应离心管中进行限制性酶切反应:20l体积反应体系如下体积反应体系如下：DNA0.2-1g10酶切酶切buffer2.0l限制性内切酶限制性内切酶1-2U（单位）（单位）加加ddH2O至至20l多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。第

28、37页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶五、五、限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件 酶切反应的终止酶切反应的终止 EDTA（终浓度（终浓度10mmol/L)或或SDS终浓度终浓度0.1%(W/V)65oC温育温育20min酚酚/氯仿抽提，乙醇沉淀氯仿抽提，乙醇沉淀 酶解结果鉴定酶解结果鉴定 琼脂糖电泳琼脂糖电泳 第38页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶五、五、限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件 完全消化完全消化：内

29、切酶在：内切酶在DNA上的上的所有所有识别位点都被切开。识别位点都被切开。局部消化局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。：只有有限数量的酶切位点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。局部消化的目的。第39页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶五、五、限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件 酶切的注意事项酶切的注意事项:1.购买的限制性内切酶多保存于购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于甘油中，于-20是稳定的。是稳定的。

30、进行酶切消进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从再从-20冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20冰箱。冰箱。2.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将，否则酶活性将受到甘油的抑制受到甘油的抑制。3.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量通常延长时间可使所

31、需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。时可用。4.注意注意星号酶切活力星号酶切活力。第40页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶六、影响限制性核酸内切酶活性的因素六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（一）酶的纯度（一）酶的纯度 （二）（二）DNA样品的纯度样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等等，都有可能抑制酶活性。都有可能抑制酶活性。可采用以下方法，提高酶活性：可采用以下方法，提高酶活性：加大酶的用量，加大酶的用量，1gDNA用用10U酶酶 加大反应

32、总体积加大反应总体积 延长反应时间延长反应时间 第41页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶六、影响限制性核酸内切酶活性的因素六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（三）（三）DNA样品的甲基化程度样品的甲基化程度 采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒采用去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒DNA，可防止，可防止DNA的甲基化。的甲基化。第42页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶六、影响限制性核酸内切酶活性的因素六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（四）酶切反

33、应的温度与时间（四）酶切反应的温度与时间 多数标准反应温度是多数标准反应温度是37，如，如SmaI为为25或或30，SfiI为为50。反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。反应温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。酶解时间可通过加大酶量而缩短，反之酶量较少时，可通过延长酶解时间可通过加大酶量而缩短，反之酶量较少时，可通过延长酶解时间以达到完全酶解酶解时间以达到完全酶解DNA的目的。的目的。第43页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶六、影响限制性核酸内切酶活性的因素六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（五）

34、（五）DNA的分子构型的分子构型 某些酶切割超螺旋质粒某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线性时，酶量比切割线性DNA时高时高出多倍，可高达出多倍，可高达20倍。倍。酶酶最适温度最适温度oC 酶酶最适温度最适温度oC 酶酶最适温度最适温度oC ApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI504525第44页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶六、影响限制性核酸内切酶活性的因素六、影响限制性核酸内切酶活性的因素（六）限制性核酸内切酶的反应缓冲液（六）

35、限制性核酸内切酶的反应缓冲液 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的“星星活性活性”（staractivity）现象。现象。EcoRI*代表代表EcoRI的星号活力。的星号活力。星活性的特点星活性的特点:限制酶识别序列特异性降低限制酶识别序列特异性降低例如：例如：EcoRI（高（高pH值或低盐离子强度）值或低盐离子强度）5GAATTC3变成变成5NAATTN3，另有一种情况是对，另有一种情况是对AATT中的中的A、T分辨不

36、严格分辨不严格商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。第45页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶发生星反应的限制酶和条件发生星反应的限制酶和条件 1)反应体系中甘油含量过高（反应体系中甘油含量过高（5%，V/V），应使用能完全酶切），应使用能完全酶切DNA的最小的最小酶量避免这种情况的发生；酶量避免这种情况的发生；2)限制酶用量过大（限制酶用量过大（100U/ugDNA）；）；3)低离子浓度（低离子浓度（5mM,NaCl25mM,Ca2+0.1mM第55页，共97页，编辑于2022年，星期三

37、生命科学学院生命科学学院第二节第二节 DNA连接酶连接酶二、二、DNA连接酶的种类连接酶的种类(二）大肠杆菌二）大肠杆菌DNA连接酶连接酶 连接具粘性末端连接具粘性末端DNA分子，以分子，以NAD作辅助因子作辅助因子(三）热稳定三）热稳定DNA连接酶连接酶 以以NAD为辅助因子，优先作用于缺口为辅助因子，优先作用于缺口 连接酶使用注意事项连接酶使用注意事项 1)DNA连接酶不能催化两连接酶不能催化两单链单链DNA分子分子连接；连接；2)只能连接双链只能连接双链DNA分子的分子的单链切口单链切口(nick)；3)不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的缺口

38、（缺口（gap）。DNA连接酶的部分性质连接酶的部分性质连接酶连接酶底物底物辅助辅助 因子因子巯基巯基 试剂试剂粘性末端粘性末端平末端平末端DNA-RNA杂合体杂合体 RNA-RNA杂合体杂合体 大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶 可行可行可行可行不行不行不行不行NAD+Mg2+不需要不需要T4DNA连接酶连接酶 可行可行可行可行可行可行可行可行ATPMg2+需需DTT噬热菌噬热菌DNA连接酶连接酶 可行可行不行不行不行不行不行不行NAD+Mg2+需要需要第56页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第二节第二节 DNA连接酶连接酶DNA连接酶应用图解连接酶应用图解（一）

39、分子间的连接（一）分子间的连接 （二）分子内的连接（二）分子内的连接第57页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第二节第二节 DNA连接酶连接酶三、三、DNA连接酶的反应体系连接酶的反应体系 四、影响连接反应的因素四、影响连接反应的因素 1.插入片段与载体的浓度比例：插入片段与载体的浓度比例：2-10:1 增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象 2.反应温度：一般反应温度：一般416 3.ATP浓度浓度10T4DNALigaseBuffer1lpMD18-T（30ng/l）1l已纯化的已纯化的PCR产物产

40、物Xl*T4DNALigase23WeissUnitsddH2O至至10l第58页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第二节第二节 DNA连接酶连接酶平末端平末端DNA片段的连接片段的连接(补充补充)1.同聚物加尾法同聚物加尾法 第59页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第二节第二节 DNA连接酶连接酶平末端平末端DNA片段的连接片段的连接(补充补充)2.衔接物连接法衔接物连接法 第60页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第二节第二节 DNA连接酶连接酶平末端平末端DNA片段的连接片段的连接(补充补充)3.DNA接头（

41、接头（adaptor）连接法）连接法 问：问：衔接物和衔接物和DNA接头有什么接头有什么区别？区别？衔接物（衔接物（linker）是一种人工合成的双链是一种人工合成的双链DNA短片段，其上具有一个或数个在短片段，其上具有一个或数个在将与其连接的载体将与其连接的载体DNA上不存在的限制酶识别位点，可按平齐末端连接法上不存在的限制酶识别位点，可按平齐末端连接法给平齐末端片段加上相同识别位点的衔接物，再用在衔接物中具有识别位给平齐末端片段加上相同识别位点的衔接物，再用在衔接物中具有识别位点的合适限制酶切割，用常规方法连接的方法，提高平齐末端间的连接作点的合适限制酶切割，用常规方法连接的方法，提高平齐

42、末端间的连接作用效率。也可利用接头进行用效率。也可利用接头进行DNA平齐末端门的连接。平齐末端门的连接。接头（接头（adaptor）是一种具有粘性末端的短核昔酸双链，它与平齐末端连接后，是一种具有粘性末端的短核昔酸双链，它与平齐末端连接后，不用经过切割即可与载体相连。不用经过切割即可与载体相连。第61页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第三节第三节 DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶DNA聚合酶聚合酶 35外切酶外切酶活性活性53外切酶外切酶活性活性聚合速率聚合速率持续能力持续能力大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶低低有有中中低低Klenowfragment 低低

43、无无中中低低T4DNA聚合酶聚合酶 高高无无中中低低T7DNA聚合酶聚合酶 高高无无快快高高化学修饰化学修饰T7DNA聚合酶聚合酶低低无无快快高高遗传修饰遗传修饰T7DNA聚合酶聚合酶无无无无快快高高逆转录酶逆转录酶无无无无低低中中TaqDNA聚合酶聚合酶 无无有有快快高高DNA聚合酶（聚合酶（DNApolymerase)是指能在引物和模板的存在下，将脱氧核糖单核苷酸连续地加到是指能在引物和模板的存在下，将脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链双链DNA分子引物链的分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。分为：依赖于末端，催化核苷酸的聚合作用。分为：依赖于DNA的的DNA聚聚合酶和依赖于合酶和

44、依赖于RNA的的DNA聚合酶。聚合酶。第62页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第三节第三节 DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶一、大肠杆菌一、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I1957年，美国的生物学家年，美国的生物学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶。聚合酶。第63页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第三节第三节 DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶CCGGGCTATCGGE.coli DNApolIMg2+，4dNTPC

45、CGATAGCCGGCTATCGG1.53聚合酶活性聚合酶活性GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coli DNApolIMg2+pC，pT5TCGATAGCCAGCTATE.coli DNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC52.53外切酶活性外切酶活性3.35外切酶活性外切酶活性DNA聚合酶的三种活性聚合酶的三种活性第64页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第三节第三节 DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶一、大肠杆菌一、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I用途：用途：1）除去除去3-端突起的单链端突起的单链D

46、NA（在无（在无dNTP时）时）2）补齐补齐5-突起端突起端3）合成第二条合成第二条cDNA4）切口移位制备探针切口移位制备探针其中用途其中用途2)和和3)常用大片段常用大片段第65页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第三节第三节 DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶二、二、Klenow片段片段（一）基本性质（一）基本性质 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理经枯草杆菌蛋白酶处理，获得获得N端三分之端三分之二的大肽段二的大肽段，即即Klenow片段。片段。Klenow片段仍片段仍拥有拥有53的的DNA聚合酶活性聚合酶活性和和35的核酸的核酸外切酶

47、活性外切酶活性，但，但失去失去了了53的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性。第66页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第三节第三节 DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶二、二、Klenow片段片段（二）用途（二）用途 1.3端补平端补平：补平限制性内切酶切后形成的：补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端隐蔽端。2.DNA3末端标记末端标记:在在3隐蔽端隐蔽端加上放射性标记的加上放射性标记的dNTP。5klenowklenow5第67页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第三节第三节 DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶二、二、Klenow片段片段（

48、二）用途（二）用途 3.cDNA第二链的合成第二链的合成 mRNAcDNA第一链第一链逆转录逆转录cDNA第二链第二链klenow 533553引物引物 第68页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第三节第三节 DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶三、三、T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶（一）（一）T4DNA酶的基本特性酶的基本特性 有有35的核酸外切酶活性和的核酸外切酶活性和53的的DNA聚合酶活性聚合酶活性（降解单（降解单链更快）链更快）。在无在无dNTP时，可以从任何时，可以从任何3-OH端外切端外切 在四种在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位均存在时，

49、聚合活性占主导地位 第69页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第三节第三节 DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶三、三、T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶（二）用途（二）用途第70页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第三节第三节 DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶四、四、T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶与测序酶聚合酶与测序酶（一）（一）T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶从从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成，已知成，已知DNA聚合酶中持续结合能力最强的一个。聚合酶中持续结合

50、能力最强的一个。（二）（二）T7噬菌体噬菌体DNA测序酶测序酶通过对通过对T7DNA聚合酶进行化学修饰，聚合酶进行化学修饰，去除去除35外切酶活外切酶活性，使性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了聚合能力和聚合速率提高了3倍。倍。第71页，共97页，编辑于2022年，星期三生命科学学院生命科学学院第三节第三节 DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶五、五、TaqDNA聚合酶聚合酶来源来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。结构结构：单亚基：单亚基MW=94000d。特点特点：热稳定性，热稳定性，70反应反应2h残留活性为原来的残留活性为原来的90%；93