经典色谱法液相 (2)精选文档.ppt

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1、经典色谱法液相1本讲稿第一页，共八十九页第第1 1节节 液液-固吸附柱色谱固吸附柱色谱(LSC)(LSC)（一）分离原理（一）分离原理（二）常用吸附剂（二）常用吸附剂（三）色谱条件的选择（三）色谱条件的选择 (四四)操作方法操作方法2本讲稿第二页，共八十九页 各组分与流动相分子争夺吸附剂各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心表面活性中心，利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的利用吸附剂表面的活性吸附中心对不同组分的吸附吸附 能力差异能力差异而实现分离，吸附能力大小用吸附平衡常数而实现分离，吸附能力大小用吸附平衡常数K K表表示示（一）分离原理（一）分离原理1.吸附与吸附平衡吸附与吸附平衡3

2、本讲稿第三页，共八十九页2.吸附等温线：一定温度下，某一组分固定吸附等温线：一定温度下，某一组分固定相和流动相之间达到平衡时，以相和流动相之间达到平衡时，以Cs为纵坐为纵坐标，标，Cm为横坐标得到的曲线。为横坐标得到的曲线。类型：线性、凸形、凹形等温线类型：线性、凸形、凹形等温线4本讲稿第四页，共八十九页吸附等温线吸附等温线色谱柱内溶液浓度的分布色谱柱内溶液浓度的分布流出曲线流出曲线5本讲稿第五页，共八十九页n当吸附等温线是线性时当吸附等温线是线性时,流出曲线是对称流出曲线是对称的的,当吸附等温线是凸型或凹型时，流出当吸附等温线是凸型或凹型时，流出曲线形成拖尾峰或前延峰，曲线形成拖尾峰或前延峰

3、，克服方法：克服方法：减少进样量或样品浓度，利用等温线的减少进样量或样品浓度，利用等温线的直线部分，防止超载。直线部分，防止超载。6本讲稿第六页，共八十九页（二）、吸附剂（二）、吸附剂对吸附剂的要求：对吸附剂的要求：（1 1）具有较大的表面积和一定的吸附能力）具有较大的表面积和一定的吸附能力（2 2）颗粒要有一定的细度）颗粒要有一定的细度(d=75-150m(d=75-150m，即，即100-200100-200目目)，且粒度均匀，且粒度均匀（3 3）与洗脱剂及样品不起反应，不溶解于洗脱剂）与洗脱剂及样品不起反应，不溶解于洗脱剂常用：硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭、大孔树脂常用：硅胶、氧化铝、聚

4、酰胺、活性炭、大孔树脂7本讲稿第七页，共八十九页吸附机制：吸附机制：表面的硅醇基，与物质形成氢键表面的硅醇基，与物质形成氢键适用范围：适用范围：微酸性（微酸性（pH=45），），适于酸性和中性物质适于酸性和中性物质失活：失活：水与硅醇基结合使其失去活性水与硅醇基结合使其失去活性活化：活化：105-110105-110加热加热30min30min粒度：粒度：100-200100-200目目1.硅胶硅胶（SiO2H2O）中等极性吸附剂中等极性吸附剂8本讲稿第八页，共八十九页 碱性氧化铝碱性氧化铝 pH 9pH 910 10 适于分析碱性、中性物质适于分析碱性、中性物质 如：生物碱如：生物碱 中中性

5、性氧氧化化铝铝 pH pH 7.5 7.5 适适于于分分析析酸酸性性、碱碱性性和和中中性性物质物质 如如：生生物物碱碱、挥挥发发油油、萜萜类类、甾甾体体及及在在酸酸碱碱中中不不稳定的苷类、酯、内酯等化合物稳定的苷类、酯、内酯等化合物 酸性氧化铝酸性氧化铝 pH 4pH 45 5 适于分析酸性、中性物质适于分析酸性、中性物质 如：酸性色素、氨基酸、对酸稳定的中性物质如：酸性色素、氨基酸、对酸稳定的中性物质2.氧化铝：吸附力较强氧化铝：吸附力较强9本讲稿第九页，共八十九页硅胶、氧化铝的含水量与活性关系硅胶、氧化铝的含水量与活性关系 硅胶含水量硅胶含水量%活度级活度级氧化铝含水量氧化铝含水量%005

6、315625103815活度测定法：活度测定法：BrockmamnBrockmamn法法结论：含水量越低，活度级别越小，吸附结论：含水量越低，活度级别越小，吸附力越强。力越强。10本讲稿第十页，共八十九页3 3、聚酰胺、聚酰胺商品名：锦纶、尼龙商品名：锦纶、尼龙-6不溶于水和有机溶剂，易溶于浓无机酸不溶于水和有机溶剂，易溶于浓无机酸分离机制：主要是分离机制：主要是氢键吸附氢键吸附适用对象：适用对象：黄酮类、鞣质、醌黄酮类、鞣质、醌粒度：粒度：2020200200目目氢键能力氢键能力强强组分越后出柱组分越后出柱 11本讲稿第十一页，共八十九页4 4、大孔树脂、大孔树脂是一种具有大孔网状结构的高分

7、子吸附剂。是一种具有大孔网状结构的高分子吸附剂。不溶于酸、碱及有机溶剂不溶于酸、碱及有机溶剂 分类：非极性和中等极性分类：非极性和中等极性特点：在水中吸附力较强，在有机溶剂中特点：在水中吸附力较强，在有机溶剂中吸附力较弱吸附力较弱适用对象：适用对象：皂苷类、黄酮苷类化合物皂苷类、黄酮苷类化合物粒度：粒度：20206060目目12本讲稿第十二页，共八十九页（三）色谱条件的选择：（三）色谱条件的选择：1.1.被测组分性质（极性大小）：被测组分性质（极性大小）：烷烷烃烃烯烯烃烃醚醚 硝硝基基化化合合物物 二二甲甲胺胺酯酯酮酮醛醛 胺酰胺醇酚羧酸胺酰胺醇酚羧酸依据被测组分、吸附剂和流动相的性质依据被测

8、组分、吸附剂和流动相的性质13本讲稿第十三页，共八十九页2.2.吸附剂的选择：吸附剂的选择：吸附剂的活性吸附剂的活性大，对被测组分的吸附能力大，对被测组分的吸附能力强强 强极性物质强极性物质选择弱吸附剂选择弱吸附剂 弱极性物质弱极性物质选择强吸附剂选择强吸附剂酸性成分：硅胶酸性成分：硅胶 碱性成分：氧化铝碱性成分：氧化铝 黄酮类：聚酰胺黄酮类：聚酰胺本讲稿第十四页，共八十九页 “相相似似相相溶溶”原原则则 ：分分离离极极性性大大的的物物质质应应选选用用极极性性大大的的溶溶剂剂作作流流动动相相，分分离离极极性性小小的的物物质质应选用应选用极性小的溶剂作流动相极性小的溶剂作流动相3、流动相的选择、

9、流动相的选择流动相极性顺序：流动相极性顺序：石油醚石油醚 环已烷环已烷 苯苯 甲苯甲苯 乙醚乙醚 三氯甲烷三氯甲烷 乙乙酸乙酯酸乙酯 丙酮丙酮 正丁醇正丁醇 乙乙醇醇 甲醇甲醇 水水常用：混合溶剂常用：混合溶剂 如：如：不同配比的甲醇不同配比的甲醇-水或甲醇水或甲醇 亲脂性成分用氯仿、乙酸乙酯亲脂性成分用氯仿、乙酸乙酯15本讲稿第十五页，共八十九页4.4.三者关系：三者关系：组分组分 吸附剂吸附剂 流动相流动相极性大极性大 活性小活性小 极性极性非非(弱弱)极性极性 活性大活性大 非极性或弱极性非极性或弱极性16本讲稿第十六页，共八十九页（四）、操作方法（四）、操作方法2、上样、上样3 3、洗

10、脱、洗脱1、色谱柱的制备、色谱柱的制备 要求：填装均匀、紧密，不能有气泡。要求：填装均匀、紧密，不能有气泡。装柱时柱要垂直，表面平整。装柱时柱要垂直，表面平整。固定相的用量适宜。固定相的用量适宜。柱体：色谱柱柱体：色谱柱 固定相：颗粒大小固定相：颗粒大小100-200100-200目，用量目，用量 方法：干法装柱、湿法装柱方法：干法装柱、湿法装柱4 4、检视、检视17本讲稿第十七页，共八十九页第第2 2节节 液液-液分配柱色谱法（液分配柱色谱法（LLCLLC）一、基本原理一、基本原理 原理原理：利用不同组分在固定相中溶解度不：利用不同组分在固定相中溶解度不同，而进行分离同，而进行分离过程：过程

11、：18本讲稿第十八页，共八十九页二、载体二、载体作用作用：支撑与分散固定液的作用：支撑与分散固定液的作用要求要求：1）化学惰性，不易与其它物质发生反应）化学惰性，不易与其它物质发生反应2）对被分离组分没有吸附能力）对被分离组分没有吸附能力3）能吸留较大量的固定相液体）能吸留较大量的固定相液体常用载体常用载体：硅胶、硅藻土、纤维素等：硅胶、硅藻土、纤维素等19本讲稿第十九页，共八十九页三、固定液、流动相及其选择三、固定液、流动相及其选择分类分类：正相分配色谱和反相分配色谱：正相分配色谱和反相分配色谱正相分配色谱正相分配色谱：固定液极性大于流动相：固定液极性大于流动相固定液固定液：水、各种缓冲溶液

12、、甲醇等强极性物质：水、各种缓冲溶液、甲醇等强极性物质流动相流动相：石油醚、三氯甲烷等低极性物质：石油醚、三氯甲烷等低极性物质适合分离的物质适合分离的物质：极性物质：极性物质各种极性物质流出顺序各种极性物质流出顺序：t非极性非极性 t中极性中极性 t强极性强极性20本讲稿第二十页，共八十九页反相分配色谱反相分配色谱：固定液极性小于流动相：固定液极性小于流动相固定液固定液：硅油、液状石蜡等极性小物质：硅油、液状石蜡等极性小物质流动相流动相：水、与水相混溶的有机溶液：水、与水相混溶的有机溶液适于分离物质适于分离物质：中等极性至非极性物质：中等极性至非极性物质各种极性物质流出顺序各种极性物质流出顺序

13、：t极性极性 t中极性中极性 t非极性非极性21本讲稿第二十一页，共八十九页选择原则选择原则：固定液与流动相的选择，要根据被分固定液与流动相的选择，要根据被分离物中各组分在两相中的溶解度之比即分配系离物中各组分在两相中的溶解度之比即分配系数而定。数而定。可先使用对各组分溶解度大的溶剂为可先使用对各组分溶解度大的溶剂为洗脱剂，再根据分离情况改变洗脱剂的组成，洗脱剂，再根据分离情况改变洗脱剂的组成，即在流动相中加入一些可调节溶解度的溶剂即在流动相中加入一些可调节溶解度的溶剂以改变各组分被分离的情况与洗脱速率。以改变各组分被分离的情况与洗脱速率。22本讲稿第二十二页，共八十九页四、操作方法四、操作方

14、法1.固定液的涂布与装柱：固定液的涂布与装柱：装柱前，首先将固定装柱前，首先将固定液与载体混合均匀液与载体混合均匀 2.加样与洗脱：加样与洗脱：加样方法：加样方法：试样配成浓溶液试样配成浓溶液；试样溶液用少试样溶液用少量固定相吸附，待溶剂挥干后，加入柱内；量固定相吸附，待溶剂挥干后，加入柱内；用用一块比色谱柱内径略小的圆形滤纸吸附试样溶液，一块比色谱柱内径略小的圆形滤纸吸附试样溶液，待溶剂挥发后，加入柱内待溶剂挥发后，加入柱内 23本讲稿第二十三页，共八十九页洗脱洗脱：洗脱时流动相应先与固定相互相饱和，：洗脱时流动相应先与固定相互相饱和，防止固定相流失防止固定相流失应用应用：适合各种类型化合物

15、的分离：适合各种类型化合物的分离24本讲稿第二十四页，共八十九页第第3 3节节 离子交换柱色谱法（离子交换柱色谱法（IECIEC）1 1、离子交换树脂：、离子交换树脂：树脂：母体骨架是树脂：母体骨架是苯乙烯苯乙烯和和二乙烯苯二乙烯苯聚合而成的球形聚合而成的球形网状结构的网状结构的高分子聚合物高分子聚合物-SO3H、-COOH 阳阳离子交换树脂离子交换树脂 -N(CH3)3+、-NH2 阴阴离子交换树脂离子交换树脂 定义：利用离子交换剂对各组分交换性能定义：利用离子交换剂对各组分交换性能的差异使其分离分析的方法的差异使其分离分析的方法25本讲稿第二十五页，共八十九页阳离子交换树脂：阳离子交换树脂

16、：强酸型强酸型弱酸型弱酸型树脂酸性强度次序树脂酸性强度次序交换与再生反应交换与再生反应26本讲稿第二十六页，共八十九页阴离子交换树脂：阴离子交换树脂：强碱型强碱型 如如弱碱型弱碱型 如如交换与再生反应交换与再生反应27本讲稿第二十七页，共八十九页交联度：交联剂（如二乙烯苯）的用量，重量百分比表交联度：交联剂（如二乙烯苯）的用量，重量百分比表示示阳离子交换树脂交联度以阳离子交换树脂交联度以8 8，阴离子交换树脂交联度以阴离子交换树脂交联度以4 4左右为宜。左右为宜。高交联度树脂紧密网状结构，交换速度慢，但选择性好，高交联度树脂紧密网状结构，交换速度慢，但选择性好，反之，则具有较好的渗透性，选择性

17、差。反之，则具有较好的渗透性，选择性差。2、性能、性能本讲稿第二十八页，共八十九页交换容量：交换容量：每克干树脂含有可交换基团的数每克干树脂含有可交换基团的数目，单位以目，单位以mmol/gmmol/g表示。表示。交换容量表示离子交换树脂进行离子交换能力交换容量表示离子交换树脂进行离子交换能力大小。实际交换容量与理论有所不同。大小。实际交换容量与理论有所不同。溶胀：溶胀：树脂吸收水分后，引起的膨胀。树脂吸收水分后，引起的膨胀。溶胀程度取决于交联度高低，交联度高，溶胀溶胀程度取决于交联度高低，交联度高，溶胀小，反之，溶胀大。小，反之，溶胀大。29本讲稿第二十九页，共八十九页粒度：粒度：交换树脂颗

18、粒的大小，一般以溶胀状交换树脂颗粒的大小，一般以溶胀状态下通过的筛孔来表示。态下通过的筛孔来表示。颗粒小，离子交换达到平衡快，但洗脱慢。颗粒小，离子交换达到平衡快，但洗脱慢。30本讲稿第三十页，共八十九页3、离子交换平衡、离子交换平衡平衡常数平衡常数K KA/BA/B也称离子选择性系数，是衡量某树也称离子选择性系数，是衡量某树脂交换能力大小的一种量度。脂交换能力大小的一种量度。K K越大，保留越大，保留时间越长。时间越长。31本讲稿第三十一页，共八十九页4 4、影响选择性系数的因素、影响选择性系数的因素离子价数离子价数越高，越高，水合离子半径水合离子半径越小和离子交换越小和离子交换树脂的亲和力

19、越大，即选择系数越大树脂的亲和力越大，即选择系数越大（1 1）强酸型阳离子交换树脂）强酸型阳离子交换树脂不同价态的离子，电荷越高，亲和力越强，选择性不同价态的离子，电荷越高，亲和力越强，选择性系数越大，如系数越大，如ThTh4+4+AlAl3+3+CaCa2+2+NaNa+一价阳离子的亲和力顺序为一价阳离子的亲和力顺序为AgAg+TlTl+CsCs+RbRb+K K+NHNH4 4+NaNa+H H+LiLi+32本讲稿第三十二页，共八十九页 （2 2）强碱型阴离子交换树脂）强碱型阴离子交换树脂 阴离子的亲和力顺序为阴离子的亲和力顺序为柠檬酸根柠檬酸根SOSO4 42-2-CrOCrO4 42

20、-2-I I-HSOHSO4 4-NONO3 3-BrBr-CNCN-NONO2 2-ClCl-HCOOHCOO-CHCH3 3COOCOO-OHOH-F F-33本讲稿第三十三页，共八十九页5、操作方法及应用、操作方法及应用（1 1）树脂处理和再生）树脂处理和再生处理目的：除去杂质、转变为所需要的形式处理目的：除去杂质、转变为所需要的形式阳离子树脂转变为氢型，阴离子树脂转变为氯型或阳离子树脂转变为氢型，阴离子树脂转变为氯型或羟基型。羟基型。处理方法：处理方法：树脂再生：树脂再生：34本讲稿第三十四页，共八十九页（2 2）装柱）装柱处理好的树脂加少量水搅拌后倒入色谱处理好的树脂加少量水搅拌后倒

21、入色谱柱中，注意防止气泡进入。柱中，注意防止气泡进入。（3 3）洗脱）洗脱洗脱剂一般为水，或弱酸弱碱溶液，必洗脱剂一般为水，或弱酸弱碱溶液，必要时加入少量有机溶剂要时加入少量有机溶剂（4 4）应用）应用除去干扰离子，微量元素的富集、水的纯除去干扰离子，微量元素的富集、水的纯化等化等35本讲稿第三十五页，共八十九页第第4节节 空间排阻柱色谱法（空间排阻柱色谱法（SEC）又称为又称为凝胶色谱法凝胶色谱法、分子排阻色谱法分子排阻色谱法、分子筛色谱分子筛色谱法法和和尺寸排阻色谱法尺寸排阻色谱法分类：分类：凝胶渗透色谱法（流动相为有机溶剂）凝胶渗透色谱法（流动相为有机溶剂）凝胶过滤色谱法（流动相为水溶液

22、）凝胶过滤色谱法（流动相为水溶液）作用：用于大分子物质如蛋白质、多糖的分离作用：用于大分子物质如蛋白质、多糖的分离36本讲稿第三十六页，共八十九页一、基本原理一、基本原理分子筛效应：分子排阻色谱是根据溶质分子大小分子筛效应：分子排阻色谱是根据溶质分子大小的不同即分子筛效应而进行分离的。的不同即分子筛效应而进行分离的。大分子的流程短，移动速度快，先流出色谱柱；小分子的大分子的流程短，移动速度快，先流出色谱柱；小分子的流程长，移动速度慢，后流出色谱柱；而中等分子居两者流程长，移动速度慢，后流出色谱柱；而中等分子居两者之间，可使分子大小不一样的混合组分实现分离。之间，可使分子大小不一样的混合组分实现

23、分离。37本讲稿第三十七页，共八十九页渗透系数渗透系数K K 溶胶孔穴内外同等大小的溶质分子溶胶孔穴内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态。处于扩散平衡状态。渗透系数渗透系数K由溶质分子的体积大小与孔穴的孔径大小的相对由溶质分子的体积大小与孔穴的孔径大小的相对关系决定，与流动相的种类无关。关系决定，与流动相的种类无关。K越大，保留时间越长越大，保留时间越长38本讲稿第三十八页，共八十九页三、操作方法及应用三、操作方法及应用 （自学）（自学）二、凝胶的分类二、凝胶的分类 （自学）（自学）39本讲稿第三十九页，共八十九页 小结小结经典液相柱色谱的主要用途：经典液相柱色谱的主要用途：色谱分析前样品预

24、处理、化学分离色谱分析前样品预处理、化学分离 熟悉各种柱的使用熟悉各种柱的使用 掌握常用吸附剂的性质掌握常用吸附剂的性质 掌握色谱条件的选择掌握色谱条件的选择 掌握洗脱规律掌握洗脱规律40本讲稿第四十页，共八十九页第第5节节 薄层色谱法薄层色谱法（Thin Layer chromatography，TLC）1 1、定义：、定义：将固定相将固定相(吸附剂吸附剂)均匀地铺在具有光均匀地铺在具有光洁表面的薄板上形成薄层，在此薄层上进行色洁表面的薄板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法。谱分离的方法。薄板：薄板：玻璃、塑料薄膜、铝箔玻璃、塑料薄膜、铝箔吸附剂：吸附剂：硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝41本

25、讲稿第四十一页，共八十九页操作形式操作形式:平面平面流动相：展开剂流动相：展开剂操作：点样、展开操作：点样、展开驱动力驱动力:毛细管力毛细管力42本讲稿第四十二页，共八十九页特点特点：分析时间短分析时间短 分离能力强，一次可分离多个组分分离能力强，一次可分离多个组分灵敏度高灵敏度高检视方便检视方便设备简单设备简单分类分类：1.按分离机理分：吸附、分配、离子交换、按分离机理分：吸附、分配、离子交换、空间排阻色谱等。空间排阻色谱等。2.按薄层板的分离效率不同：经典薄层色谱法和高效按薄层板的分离效率不同：经典薄层色谱法和高效薄层薄层色谱法薄层薄层色谱法应用：药物的定性鉴别应用：药物的定性鉴别43本讲

26、稿第四十三页，共八十九页一、基本原理及名词术语一、基本原理及名词术语1.分离过程：以吸附薄层色谱法为例分离过程：以吸附薄层色谱法为例由于各组分与吸附剂具有不同的吸附能力，展开剂对由于各组分与吸附剂具有不同的吸附能力，展开剂对各组分的溶解能力不同，各组分的溶解能力不同，即各组分有不同的吸附即各组分有不同的吸附平衡常数平衡常数，因此在展开过程中，产生差速迁移，因此在展开过程中，产生差速迁移，实现分离。实现分离。44本讲稿第四十四页，共八十九页3、比移值（、比移值（Rf）可用范围：可用范围：0.2-0.8 0.2-0.8 最佳范围：最佳范围：0.3-0.50.3-0.5 2 2、原点、溶剂前沿、展距

27、、原点、溶剂前沿、展距分离的前提：分离的前提：k不同不同l0l45本讲稿第四十五页，共八十九页1、Rf与与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄层板有关，即与组分性质（溶解度）以及薄层板和展开剂的性质有关和展开剂的性质有关2、色谱条件一定，、色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为基本定性参数，说明组分的色谱保留行为讨讨 论论46本讲稿第四十六页，共八十九页3.相对比移值相对比移值Rs 讨论讨论参考物与被测组分在完全相同条件下展开参考物与被测组分在完全相同条件下展开 可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性；可以消除系统误差，

28、大大提高重现性和可靠性；参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分相相对对比比移移值值Rs与与组组分分、参参考考物物性性质质及及色色谱谱条条件件有有关关，范围可以大于或小于范围可以大于或小于121LLRRRffs=中心的距离原点到参考物斑点质量心的距离原点到组分斑点质量中（参）（组）本讲稿第四十七页，共八十九页二、固定相二、固定相常用的固定相：硅胶、氧化铝、聚酰胺等常用的固定相：硅胶、氧化铝、聚酰胺等粒度：粒度：200300目目吸附剂的选择：根据样品的性质如极性、酸碱性及溶解度来吸附剂的选择：根据样品的性质如极性、酸碱性及溶解度来选择选择如：氧

29、化铝一般适合碱性物质和中性物质的分离如：氧化铝一般适合碱性物质和中性物质的分离硅胶适用于酸性及中性物质的分离硅胶适用于酸性及中性物质的分离48本讲稿第四十八页，共八十九页1.1.硅胶：硅胶：硅胶硅胶H H、硅胶、硅胶G G、硅胶、硅胶HFHF254254、硅胶、硅胶GFGF254254G：指含煅石膏：指含煅石膏(Gypsum)黏合剂黏合剂H：不含黏合剂：不含黏合剂F254：含一种在：含一种在254nm下能发出黄绿下能发出黄绿色荧色荧光的无机荧光剂光的无机荧光剂F365：含荧光剂，含荧光剂，365nm紫外光照发光紫外光照发光粒度：粒度：101040m(25040m(250300300目）目）含荧

30、光剂的硅胶适用于本身不发光又无适当显色剂显色的物质含荧光剂的硅胶适用于本身不发光又无适当显色剂显色的物质本讲稿第四十九页，共八十九页三、展开剂三、展开剂展开剂选择：主要根据被分离物质的极性、吸附剂展开剂选择：主要根据被分离物质的极性、吸附剂的活性及展开剂本身的极性来选择的活性及展开剂本身的极性来选择 组分组分 吸附剂吸附剂 流动相流动相极性大极性大 活性小活性小 极性极性非非(弱弱)极性极性 活性大活性大 非极性或弱极性非极性或弱极性50本讲稿第五十页，共八十九页 制板制板 点样点样 展开展开 检视检视四、操作方法四、操作方法51本讲稿第五十一页，共八十九页（一）制板（一）制板（2）粘合剂：水

31、或）粘合剂：水或0.30.7%CMC-Na，用量，用量1:3（3）涂铺厚度：）涂铺厚度：0.3mm，0.5mm（4）活化：自然晾干后，）活化：自然晾干后，105烘烘1h（5）贮备：干燥器）贮备：干燥器（1）载板的准备：多用玻璃板，要求表面光滑，）载板的准备：多用玻璃板，要求表面光滑，平整清洁。平整清洁。常用规格：常用规格：10cm10cm、20cm20cm、载玻片等、载玻片等52本讲稿第五十二页，共八十九页薄层板的铺制方法薄层板的铺制方法（1）手工涂铺法）手工涂铺法（2）机械涂铺法（半自动、全自动）机械涂铺法（半自动、全自动）（3）烧结玻璃法）烧结玻璃法53本讲稿第五十三页，共八十九页（1 1

32、）样品溶液的制备：）样品溶液的制备：一般用溶解度大，低沸点、弱极性、易一般用溶解度大，低沸点、弱极性、易挥发的有机溶剂。不宜用水。挥发的有机溶剂。不宜用水。（2 2）器具：毛细管、微量注射器、自动点样器）器具：毛细管、微量注射器、自动点样器2 2、点样、点样（3 3）点样量：）点样量：110l110l操作要点：溶解样品的溶剂、点样量和正确的点操作要点：溶解样品的溶剂、点样量和正确的点样方法样方法54本讲稿第五十四页，共八十九页（4）点样方法：垂直方向，不能用力太大）点样方法：垂直方向，不能用力太大（5）点样后溶剂须挥干）点样后溶剂须挥干点样点样斑点直径斑点直径2mm2mm一般为圆点，或条带状一

33、般为圆点，或条带状1cm1cm1cm55本讲稿第五十五页，共八十九页1)1)展开装置展开装置：展开槽（层析缸）：展开槽（层析缸）3 3、展、展 开开单槽单槽双槽双槽56本讲稿第五十六页，共八十九页展距：815cm2 2）展开方式）展开方式 a 上行法展开、近水平展开方式上行法展开、近水平展开方式57本讲稿第五十七页，共八十九页 b 单向多次展开：取展开一次后的薄层板，挥干单向多次展开：取展开一次后的薄层板，挥干溶剂，再用同一种展开剂，按同样的展开方向进溶剂，再用同一种展开剂，按同样的展开方向进行多次展开，以达更好的分离效果。行多次展开，以达更好的分离效果。ABAB一次展开一次展开多次展开多次展

34、开58本讲稿第五十八页，共八十九页 c 单向多级展开：取一次展开后的薄层板，挥干单向多级展开：取一次展开后的薄层板，挥干溶剂，再改用另一展开剂，按同样的展开方向溶剂，再改用另一展开剂，按同样的展开方向进行多次展开，以达更好分离效果。进行多次展开，以达更好分离效果。d 双向展开：取一次展开后的薄层板，挥干溶剂，将双向展开：取一次展开后的薄层板，挥干溶剂，将薄层板旋转薄层板旋转90，再改用另一种展开剂展开，以达更，再改用另一种展开剂展开，以达更好分离效果。好分离效果。对象：极性相差较大的组分对象：极性相差较大的组分对象：复杂体系中极性相差较小的组分对象：复杂体系中极性相差较小的组分59本讲稿第五十

35、九页，共八十九页3）注意事项）注意事项 a 层析缸必须密闭良好层析缸必须密闭良好 b 防止边缘效应防止边缘效应边缘效应：同一物质的色谱斑点在同一薄层板边缘效应：同一物质的色谱斑点在同一薄层板上出现的两边缘的上出现的两边缘的Rf值大于中间部分的值大于中间部分的Rf值的值的现象。现象。60本讲稿第六十页，共八十九页原因：原因：色谱缸内溶剂蒸气未达饱和，造成展开剂色谱缸内溶剂蒸气未达饱和，造成展开剂的蒸发速率在薄层板两边与中间部分不等的蒸发速率在薄层板两边与中间部分不等克服办法：克服办法：a “预饱和预饱和”b 层析缸内壁贴浸湿的滤纸条层析缸内壁贴浸湿的滤纸条 c 点样时不要太靠边缘点样时不要太靠边

36、缘61本讲稿第六十一页，共八十九页 c c 在展开过程中注意恒温恒湿在展开过程中注意恒温恒湿相对湿度硫酸（ml）+水（ml）32%6810042%5710058%39.510065%3410072%27.510088%1.8100温度和湿度的改变会影响温度和湿度的改变会影响Rf值和分离效果，值和分离效果，降低重现性。降低重现性。62本讲稿第六十二页，共八十九页对展开剂的基本要求：对展开剂的基本要求：不与组分或吸附剂存在化学反应不与组分或吸附剂存在化学反应 使样品各组分完全分离使样品各组分完全分离 使待测组分的使待测组分的R Rf f在在0.30.30.50.5 展开后各斑点圆而集中，不拖尾展开

37、后各斑点圆而集中，不拖尾 具有适中的沸点和小的粘度具有适中的沸点和小的粘度 临用前配制临用前配制4 4）展开剂）展开剂本讲稿第六十三页，共八十九页展开剂的组成：单一溶剂、多元溶剂展开剂的组成：单一溶剂、多元溶剂 单一溶剂：重现性好，分离能力差单一溶剂：重现性好，分离能力差 多元展开剂：可改善分离效果，重现性差多元展开剂：可改善分离效果，重现性差展开系统的优化展开系统的优化优化原则：优化原则：先调整展开剂极性使待测组分先调整展开剂极性使待测组分R Rf f值适值适中，保持这个极性不变，改变展开剂的选择中，保持这个极性不变，改变展开剂的选择性，直至所有组分有合适的分离度性，直至所有组分有合适的分离

38、度64本讲稿第六十四页，共八十九页Stahl图解法图解法展开剂展开剂极性极性非极性非极性V活性活性I吸附剂吸附剂待测物待测物非极性非极性极性极性Rf值的决定因素：值的决定因素：组分极性组分极性展开剂的极性展开剂的极性 吸附剂的活性吸附剂的活性本讲稿第六十五页，共八十九页 加入少量的酸碱加入少量的酸碱常用酸：常用酸：甲酸、冰醋酸甲酸、冰醋酸常用碱：常用碱：浓氨水浓氨水、乙二胺、乙二胺 展开剂用量：展开剂用量：展开剂浸没薄板下端约展开剂浸没薄板下端约0.5cm0.5cm66本讲稿第六十六页，共八十九页附：常用展开系统附：常用展开系统人参皂苷、黄芪甲苷：人参皂苷、黄芪甲苷：氯仿氯仿-甲醇甲醇-水（水

39、（65：35：10，下层），下层）正丁醇正丁醇-醋酸乙酯醋酸乙酯-水（水（4：1：5，上层），上层）黄酮苷：黄酮苷：醋酸乙酯醋酸乙酯-丁酮丁酮-甲酸甲酸-水（水（10：1：1：1）糖：糖：正丁醇正丁醇-冰醋酸冰醋酸-水（水（4 4：1 1：5 5，上层），上层）中等极性：中等极性：甲苯甲苯-醋酸乙酯醋酸乙酯-甲酸甲酸（1010：3 3：0.5)0.5)67本讲稿第六十七页，共八十九页苯苯醋酸乙酯醋酸乙酯甲醇甲醇异丙醇异丙醇浓氨水（浓氨水（6：3：1.5：1.5：0.5）例：例：68本讲稿第六十八页，共八十九页1 1、定位方法：日光检视、定位方法：日光检视4.4.检检 测测荧光淬灭斑点2.紫外光

40、下检视（紫外光下检视（254 nm、365nm）69本讲稿第六十九页，共八十九页3 3、显色检视：利用显色剂与待测物质反应，从而显色。、显色检视：利用显色剂与待测物质反应，从而显色。显色剂分类：通用型显色剂和专属型显色剂显色剂分类：通用型显色剂和专属型显色剂通用型显色剂：对大部分物质均显色的试剂。如碘、硫酸通用型显色剂：对大部分物质均显色的试剂。如碘、硫酸乙醇等乙醇等专属型显色剂：对某个或某一类化合物显色的试剂。如茚三专属型显色剂：对某个或某一类化合物显色的试剂。如茚三酮酮，三氯化铁乙醇液等，三氯化铁乙醇液等70本讲稿第七十页，共八十九页常用显色剂常用显色剂10%硫酸乙醇溶液硫酸乙醇溶液 5%

41、三氯化铁乙醇液（酸性）：酚三氯化铁乙醇液（酸性）：酚生物碱：改良碘化铋钾生物碱：改良碘化铋钾黄酮：黄酮：5%三氯化铝乙醇液三氯化铝乙醇液蒽醌：氨气蒽醌：氨气 挥发油及低极性分子：挥发油及低极性分子：5%香草醛硫酸液香草醛硫酸液71本讲稿第七十一页，共八十九页五、薄层色谱法的应用五、薄层色谱法的应用定性分析定性分析限量分析限量分析含量测定：洗脱测定法含量测定：洗脱测定法 薄层扫描法薄层扫描法72本讲稿第七十二页，共八十九页依据：固定色谱条件下，相同物质的依据：固定色谱条件下，相同物质的Rf值相同值相同1对照品对照品2供试品供试品 1 2定性分析定性分析73本讲稿第七十三页，共八十九页限量检查限量

42、检查如：附子中乌头碱的限量检查如：附子中乌头碱的限量检查1.乌头碱对照品乌头碱对照品2，3，4.样品样品1 2 3 474本讲稿第七十四页，共八十九页定量分析定量分析一、冼脱法一、冼脱法二、薄层扫描法（二、薄层扫描法（TLCS）75本讲稿第七十五页，共八十九页薄层扫描法薄层扫描法定义：定义：将一定波长的单色光照射展开后的薄层板，将一定波长的单色光照射展开后的薄层板，测定薄层色谱斑点的吸收度，根据其色谱峰积分测定薄层色谱斑点的吸收度，根据其色谱峰积分面积与待测物浓度或量成正比的定量方法面积与待测物浓度或量成正比的定量方法薄层色谱扫描曲线薄层色谱扫描曲线hAL76本讲稿第七十六页，共八十九页常用：

43、常用：CS-9000双波长飞点扫描仪双波长飞点扫描仪 CAMAG SCANNER 光源光源单色器单色器连续光连续光单色光单色光狭缝狭缝样品点样品点 I0I检测器检测器记录记录仪器结构：仪器结构：77本讲稿第七十七页，共八十九页单色器单色器检测器检测器1薄层板薄层板光源光源A检测器检测器21.基本原理：基本原理：折射光吸光度折射光吸光度反射光吸光度：反射光吸光度：78本讲稿第七十八页，共八十九页2.扫描条件的选择扫描条件的选择1）光学模式的选择）光学模式的选择反射法：测量的是反射光的强度反射法：测量的是反射光的强度透射法：测量的是透射光的强度透射法：测量的是透射光的强度2）波长模式的选择）波长模

44、式的选择单波长模式单波长模式：使用一种波长的光束对薄层进行：使用一种波长的光束对薄层进行扫描。分为单光束及双光束两种形式。扫描。分为单光束及双光束两种形式。79本讲稿第七十九页，共八十九页单光束单波长系统单光束单波长系统检测器检测器单色器单色器检测器检测器薄层板薄层板光源光源AB缺点：扫描结果受光源稳定性和薄层质量缺点：扫描结果受光源稳定性和薄层质量（均匀性）的影响（均匀性）的影响80本讲稿第八十页，共八十九页双光束单波长系统双光束单波长系统优点：有利于补偿由光源不稳定引起的误差优点：有利于补偿由光源不稳定引起的误差缺点：对板层不均匀造成的干扰不起作用缺点：对板层不均匀造成的干扰不起作用检测器

45、检测器薄层板薄层板光源光源单色器单色器检测器检测器检测器检测器分光镜分光镜81本讲稿第八十一页，共八十九页双波长系统双波长系统优点：克服背景不均匀引起的干扰优点：克服背景不均匀引起的干扰缺点：对光源不稳定造成的干扰则无作用缺点：对光源不稳定造成的干扰则无作用单色器单色器检测检测器器薄层板薄层板光源光源单色器单色器斩光器斩光器12检测检测器器双波长模式：双波长模式：采用的是两种不同波长的光束采用的是两种不同波长的光束82本讲稿第八十二页，共八十九页双波长模式中波长的选择：双波长模式中波长的选择：测定波长：常选择斑点化合物的最大吸收波长测定波长：常选择斑点化合物的最大吸收波长参比波长：常选择斑点化

46、合物无吸收的波长参比波长：常选择斑点化合物无吸收的波长83本讲稿第八十三页，共八十九页3）扫描模式的选择）扫描模式的选择：（1）直线式扫描）直线式扫描：扫描过程中，照射在薄层板的：扫描过程中，照射在薄层板的光束在板上作直线运动光束在板上作直线运动,光束足够大。光束足够大。适用范围：适用范围：均匀分布的规则斑点均匀分布的规则斑点缺点：光束扫描方向不同，测得的吸收值将会不同缺点：光束扫描方向不同，测得的吸收值将会不同x84本讲稿第八十四页，共八十九页（2）锯齿式扫描（）锯齿式扫描（“飞点飞点”式扫描）：式扫描）：扫描过程扫描过程中，照在薄层板上的光束在薄板上作锯齿形运动。光中，照在薄层板上的光束在

47、薄板上作锯齿形运动。光束微小束微小xY适用：斑点的形状不规则，浓度分布不均匀适用：斑点的形状不规则，浓度分布不均匀优点：扫描测定值不受扫描方向和斑点形状、优点：扫描测定值不受扫描方向和斑点形状、浓度分布的影响，结果稳定浓度分布的影响，结果稳定85本讲稿第八十五页，共八十九页3.3.定量分析方法定量分析方法通常使用随行标准、外标两点法定量测定。通常使用随行标准、外标两点法定量测定。目的：克服板间误差，提高定量分析的准确度。目的：克服板间误差，提高定量分析的准确度。86本讲稿第八十六页，共八十九页外标两点法：对照品两种不同的量外标两点法：对照品两种不同的量A1标标A样样m2标标m样样m1标标A2标

48、标m样样=a+b A样样87本讲稿第八十七页，共八十九页第第6 6节节 纸色谱法纸色谱法1、载体：纸、载体：纸 固定相：纤维素结合的水，固定相：纤维素结合的水，属属正相正相分配色谱分配色谱 展开剂：有机溶剂（正丁醇）展开剂：有机溶剂（正丁醇）2 2、适用：极性化合物（多糖）、适用：极性化合物（多糖）3.操作方法：与操作方法：与TLC相同相同定义：以滤纸作为载体，以纤维素所结合的水分为固定液，定义：以滤纸作为载体，以纤维素所结合的水分为固定液，以有机溶机为展开剂的色谱分析法。以有机溶机为展开剂的色谱分析法。88本讲稿第八十八页，共八十九页葡萄糖葡萄糖鼠李糖鼠李糖毛地黄毒糖毛地黄毒糖极性极性最强最强其次其次最弱最弱Rf值值最小最小其次其次最大最大4、Rf值与物质的化学结构的关系：值与物质的化学结构的关系：89本讲稿第八十九页，共八十九页