第五章 色谱法PPT讲稿.ppt

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1、第五章 色谱法第1页，共37页，编辑于2022年，星期三人类基因组计划人类基因组计划(Humangenomeproject,HGP)1990-2003第2页，共37页，编辑于2022年，星期三高效毛细管电泳仪器（高效毛细管电泳仪器（1）第3页，共37页，编辑于2022年，星期三高效毛细管电泳仪器（高效毛细管电泳仪器（2）第4页，共37页，编辑于2022年，星期三高效毛细管电泳仪器（高效毛细管电泳仪器（3）第5页，共37页，编辑于2022年，星期三中南大学生物传感所毛细管电泳仪中南大学生物传感所毛细管电泳仪第6页，共37页，编辑于2022年，星期三n20世纪世纪3040年代年代蒂塞利乌斯蒂塞利乌

2、斯(A.W.K.Tiselius)(19021971)建立了移动界面电泳建立了移动界面电泳，将电泳发展成分离技术将电泳发展成分离技术n获得获得1948年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖5-11毛细管电泳概述毛细管电泳概述第7页，共37页，编辑于2022年，星期三n毛细管电泳毛细管电泳，CapillaryElectrophoresis(CE)，又称，又称高效毛细管电泳高效毛细管电泳(HPCE)。n1981年年J.W.Jorgenson,K.D.Lukacs实验上和理论上实验上和理论上为毛细管电泳的发展奠定了基础。为毛细管电泳的发展奠定了基础。它是一种它是一种新型分离新型分离分析技术分析技术，乃经典电泳

3、技术和现代微柱分离有机结合，乃经典电泳技术和现代微柱分离有机结合的产物，是继的产物，是继高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)之后分析科学领域之后分析科学领域的又一次革命。的又一次革命。第8页，共37页，编辑于2022年，星期三CE与经典电泳与经典电泳两项重要改进：两项重要改进：一是采用了一是采用了50100m内径的毛细管；内径的毛细管；二是采用了高达数万伏的电压。二是采用了高达数万伏的电压。第9页，共37页，编辑于2022年，星期三CE与与HPLCCEHPLC柱效 高(105 107理论塔板)中等分析时间 较短较长进样体积 小(纳升级)较大 大小分子可同时分析每种柱子只适合一定分子量范围色谱柱

4、 毛细管易清洗，更换费用低 不易清洗，产生死吸附，更换费用高 溶剂消耗少，费用低，污染小消耗大量有机溶剂，费用高，污染大检测器 种类少，紫外检测灵敏度低种类多，紫外检测灵敏度高 分离重现性较差，定量精密度RSD35%分离重现性较好，定量精密度RSD1%组分收集 难易第10页，共37页，编辑于2022年，星期三CE的特点的特点1.仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化电源、毛细管、检测器、溶液瓶电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高3min内分离内分离36种无机及有机阴离子，种无机及有机阴离子，4min内分离了内分离了24种阳离子；种阳离子；分离柱效：分离柱效

5、：105107/m理论塔板数；理论塔板数；3.操作方便、消耗少操作方便、消耗少进样量极少，水介质中进行；进样量极少，水介质中进行；4.应用范围极广应用范围极广有机物、无机物、中性分子、生物大分子等；有机物、无机物、中性分子、生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；美国药典美国药典、中国药典中国药典等药典均已收录毛细管电泳法。等药典均已收录毛细管电泳法。第11页，共37页，编辑于2022年，星期三数据来源：数据来源：Webofscience,2009.11检索主题词：检索主题词：CapillaryElectrophoresis

6、第12页，共37页，编辑于2022年，星期三数据来源：国家自然科学基金委数据来源：国家自然科学基金委,2009.11检索主题词：毛细管电泳检索主题词：毛细管电泳第13页，共37页，编辑于2022年，星期三5-12毛细管电泳基本原理毛细管电泳基本原理CE泛指以高压电场为驱动力，泛指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间中各组分之间淌度淌度和和/或或分配行为分配行为上上的差异而实现分离的一类液相的差异而实现分离的一类液相分离技术。分离技术。CE分离的基础分离的基础第14页，共37页，编辑于2022年，星期三第15页，共37页，编辑于2022年，星期

7、三带电粒子在电场下的迁移速度（电泳速度）为：带电粒子在电场下的迁移速度（电泳速度）为：e=e E E:电场强度，是指单位距离的电压降（电场强度，是指单位距离的电压降（V/cm）e：电泳淌度，电泳淌度，是指单位电场下带电粒子的迁移速是指单位电场下带电粒子的迁移速度。度。电泳淌度不同是电泳分离的基础。电泳淌度不同是电泳分离的基础。CE分离的基础分离的基础第16页，共37页，编辑于2022年，星期三如果检测器在阴极端，能否检测负离子？如果检测器在阴极端，能否检测负离子？第17页，共37页，编辑于2022年，星期三电渗现象中整体移动着的液体叫电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流电渗流（electroos

8、moticflow，简称，简称EOF）。）。电渗流电渗流EOF第18页，共37页，编辑于2022年，星期三EOF动画动画第19页，共37页，编辑于2022年，星期三n毛细管中的电解质由于同时受到毛细管中的电解质由于同时受到电泳电泳和和电渗流电渗流两种驱动力，在毛细两种驱动力，在毛细管中的迁移速度等于管中的迁移速度等于电泳速度电泳速度和和电渗流速度电渗流速度的的矢量和矢量和。迁移速度迁移速度V0=VEOFVe第20页，共37页，编辑于2022年，星期三例题：例题：判断如下化合物的流出顺序？判断如下化合物的流出顺序？A：Na+B:Cl-C:苯苯D：SO42-ACBD第21页，共37页，编辑于202

9、2年，星期三CE：电荷均匀分布，整体移动，电渗流为平流，塞式流动（谱带展宽很电荷均匀分布，整体移动，电渗流为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；小）；HPLC：溶液流动为层流，抛物线流型（引起谱带展宽较大）。溶液流动为层流，抛物线流型（引起谱带展宽较大）。电渗流的流形电渗流的流形第22页，共37页，编辑于2022年，星期三电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：l l 内表面带负电荷内表面带负电荷内表面带负电荷内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；l

10、l 内表面带正电荷内表面带正电荷内表面带正电荷内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管：带负电荷，电渗流流向阴极。石英毛细管：带负电荷，电渗流流向阴极。电渗流的方向电渗流的方向第23页，共37页，编辑于2022年，星期三改变电渗流方向的方法：改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性）毛细管改性 表面键合阳离子基团。（2）加电渗流反转剂）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。电渗流的方向电渗流的方向第24页，共37

11、页，编辑于2022年，星期三正面作用正面作用n增加分离速度增加分离速度n使得正、负电荷及中性物质同使得正、负电荷及中性物质同时得以分离时得以分离负面作用负面作用电渗流的波动极大地影响了迁电渗流的波动极大地影响了迁移时间的重复性移时间的重复性电渗流是毛细管电泳中最大的驱动力来源之一，电渗流是毛细管电泳中最大的驱动力来源之一，控制电渗流控制电渗流可以影响电泳分离的效率、选择性和分离度，可以影响电泳分离的效率、选择性和分离度，是优化分离的主要参数。是优化分离的主要参数。电渗流的正面和负面作用电渗流的正面和负面作用第25页，共37页，编辑于2022年，星期三分离类型分离类型八种分离类型八种分离类型(1

12、)毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（CZE）最普遍、最基本的一种分离模式。最普遍、最基本的一种分离模式。(2)毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGE）将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶凝胶。其具有多。其具有多孔性孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。等。第26页，共37页，编辑于2022年，星期三(3)毛细管胶束电动色谱（毛细管胶束电动色谱（MECC）在缓冲溶液中加入在缓冲溶液

13、中加入离子型表面活性剂离子型表面活性剂，形成一，形成一疏水内核、外部带负电的胶疏水内核、外部带负电的胶束束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳和电渗流的方向相反，。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳和电渗流的方向相反，且且电渗流电渗流电泳电泳，则带，则带负电的胶束负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。间长。可用来分离中性物质，扩

14、展了高效毛细管电泳的应用范围。第27页，共37页，编辑于2022年，星期三5-13仪器装置仪器装置电压：电压：030KV。分离柱不涂敷任何固定液分离柱不涂敷任何固定液紫外或激光诱导荧光检测器紫外或激光诱导荧光检测器（可检测到：（可检测到：10-1910-21mol/L）第28页，共37页，编辑于2022年，星期三第29页，共37页，编辑于2022年，星期三5-14影响柱效的因素及改进方法影响柱效的因素及改进方法1.热效应：热效应：焦耳热仍是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方焦耳热仍是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，选择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选法散热，选择合适的

15、电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于择合适的电解质降低电阻，电流低于200微安，一般几十微安。微安，一般几十微安。2.电渗流控制：电渗流控制：电渗流的大电渗流的大小和方向依赖于毛细管壁与小和方向依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。溶液间电势的极性和大小。使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低电渗流，加入乙腈则可以增大电渗流，和甲醇可降低电渗流，加入乙腈则可以增大电渗流，加入反转剂，则可以改变电渗流的方向。加入反转剂，则可以改变电渗流的方向。第30页，共37页，编辑于2022年，星期三5-

16、15主要特点和应用主要特点和应用高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。高灵敏度：可检测出低至高灵敏度：可检测出低至10-21mol/L浓度的物质。浓度的物质。高分析速度：可在高分析速度：可在3分钟内分离分钟内分离30种阴离子；种阴离子；1.7分钟分离分钟分离19种种阳离子；阳离子；4分钟可分离分钟可分离10种蛋白质。种蛋白质。试样用量少：仅需几试样用量少：仅需几nL（10-9L）的试样。的试样。仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液。仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液。不足之处：不足之处：进样不够方便。应用范

17、围相对较窄。进样不够方便。应用范围相对较窄。分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但电渗流方向与阴离子受分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但电渗流方向与阴离子受电场力作用移动方向相反，出峰时间较长。电场力作用移动方向相反，出峰时间较长。第31页，共37页，编辑于2022年，星期三分析化学分析化学生物化学生物化学分子生物学分子生物学药物化学药物化学环境化学环境化学食品化学食品化学医学和法学等医学和法学等应用领域应用领域核酸（核酸（DNA）、蛋白质、肽、）、蛋白质、肽、手性化合物、糖类、小分子和小离子手性化合物、糖类、小分子和小离子检测对象检测对象 不足：检测灵不足：检测灵敏度低敏度低第32页

18、，共37页，编辑于2022年，星期三 但但CE依依然然是是目目前前分分析析化化学学和和生生命命分分析析化化学学中中最最活活跃跃的的前沿领域！前沿领域！生生命命科科学学时时代代样样品品非非常常复复杂杂，迫迫切切需需要要各各种种高高效效的的分分离离技术与灵敏的检测方法联用。技术与灵敏的检测方法联用。因因此此，改改善善灵灵敏敏度度（如如使使用用高高灵灵敏敏度度的的检检测测器器：激激光光诱诱导导荧荧光光、化化学学发发光光、电电化化学学发发光光等等和和各各种种样样品品富富集集技技术术的的应应用）一直是用）一直是CE领域研究的热点。领域研究的热点。第33页，共37页，编辑于2022年，星期三CE和和HGP

19、n目前，人类基因测序已基本完成，人类基因组计划进入目前，人类基因测序已基本完成，人类基因组计划进入后基因组时代。但是，耗资巨大的后基因组时代。但是，耗资巨大的HGP至少在现阶段并至少在现阶段并没有产生原先设想的强大影响力。这是因为人类基没有产生原先设想的强大影响力。这是因为人类基因组图谱并没有告诉我们所有基因的因组图谱并没有告诉我们所有基因的“身份身份”以及以及它们所编码的蛋白质。人体内真正发挥作用的是蛋它们所编码的蛋白质。人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块砖块”角色，角色，其中可能藏着开发疾病诊断方法和新药的其中可能藏着开发疾病诊断

20、方法和新药的“钥匙钥匙”。“后基因时代后基因时代”，一个以，一个以“蛋白质组蛋白质组”为重点的生为重点的生命科学的新时代到来，需要对蛋白质更多的研究，命科学的新时代到来，需要对蛋白质更多的研究，毛细管电泳技术将发挥更大的作用。毛细管电泳技术将发挥更大的作用。第34页，共37页，编辑于2022年，星期三蛋白质蛋白质肽片段混合物肽片段混合物酶切酶切CZE分离分离特征性肽图微微量量制制备备CE分别测定各片段的氨基酸序列整个蛋白质的一级结构CE应用举例应用举例-肽的分析肽的分析第35页，共37页，编辑于2022年，星期三NewMethodBasedonCapillaryElectrophoresisw

21、ithLaser-InducedFluorescenceDetection(CE-LIF)toMonitorInteractionbetweenNanoparticlesandtheAmyloid-PeptideAnal.Chem.,2010,82(24),pp1008310089第36页，共37页，编辑于2022年，星期三新进展新进展advances and special topics1.微型化微型化整体化学分析系统（整体化学分析系统（TAS）及）及TAS微型化微型化在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数105/m；2.联用仪器联用仪器CE-MS；3.阵列毛细管凝胶电泳阵列毛细管凝胶电泳应用于人类基因应用于人类基因DNA测序；测序；510万个基因，万个基因，30亿个碱基对，目前最有效的亿个碱基对，目前最有效的DNA序列分析仪，序列分析仪，10小时小时/次；可同时电泳次；可同时电泳24个样品；速度个样品；速度1200碱基对碱基对/小时，提高速小时，提高速度！度！100支毛细管阵列电泳；速度支毛细管阵列电泳；速度280碱基对碱基对/小时小时/支支第37页，共37页，编辑于2022年，星期三