食品微生物检验 考试复习.doc

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1、第一章 绪论一、概述1、微生物的基本特点：体积小，比表面积大；吸收多，转化快；生长旺，繁殖快；适应强，易变异；分布广，种类多二、食品微生物检验1、概念： 运用微生物的理论与技术，研究外界环境和食品中的微生物的种类、数量、性质、活动规律及其对人和动物健康的影响，建立食品微生物学检验方法，确定食品卫生的微生物学标准的一门应用性学科。“食品卫生”与 “食品安全”：1986年，世界卫生组织在题为食品安全在卫生和发展中的作用的文件中，曾把“食品卫生”与“食品安全” 作为同义词，定义为：“生产、加工、储存、制作食品过程中确保食品安全可靠，有益于健康并且适合人消费的种种必要条件和措施” 。2、意义（一）有害

2、微生物对人类和生产的影响：1.引起食品变质2.引起食物中毒3.导致人体患病(二) 食品微生物检验的意义1、是衡量食品卫生质量的重要指标，也是判定被检食品能否食用的科学依据。2、可以判断食品加工环境及食品卫生的情况，为卫生管理工作提供科学依据。3、可以有效地防止或减少食物中毒和人畜共患病的发生。4、保证产品的质量，避免不必要的损失3、研究特点1）研究对象以及研究范围广2）涉及学科多3）实用性及应用型强4）采用标准化4、研究范围1）生产环境（车间用水、空气、地面、墙壁等）；2）原辅料（食用的动、植物，添加剂等）；3）食品加工、储藏、运输、销售等环节；4）成品食品。5、研究任务1）研究各类食品中微生

3、物种类、分布及其特性；2）研究食品的微生物污染及其控制，提高食品的卫生质量；3）研究食品中致病性、中毒性、致腐性微生物；4）研究微生物与食品保藏的关系； 5）研究各类食品中微生物的检验方法及标准。6、食品微生物检验的发展过程1）致病菌检测阶段2）指示菌检测阶段（1指示菌：在常规安全卫生检测中，用以指示检验样品卫生状况及安全性的指示性微生物。（2特点：在环境中存在的数量多，易于检出；检测手段与方法简单；具有一定的代表性。（3）检验目的：以指示菌在检验样品中存在与否以及数量的多少为依据，根据检出的情况，判断样品被污染的程度，间接指示致病微生物有无存在的可能，以及对人群是否构成潜在的威胁，对照国家标

4、准，对检品的食用的安全性作出评价。（4）类型 评价被检样品一般卫生质量、污染程度以及安全性指标：菌落总数、霉菌、酵母菌等； 特指粪便污染指标：大肠菌群、肠球菌、亚硫酸盐还原梭菌等； 其他指示菌：包括某些环境不能检出的菌类。菌落总数：指一定数量或面积的食品样品，经过处理，在一定条件下培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，所得1g或1mL或1cm2检样中所含细菌菌落数量即为菌落总数，常用CFU（菌落形成单位，clony forming unit）表示。大肠菌群：指一群需氧及兼性厌氧，在37能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽孢杆菌。这些细菌均来自人和温血动物的肠道。3）微生态制剂检测阶

5、段以乳酸茵、双歧杆菌为主，以调节生态平衡为目的的各种微生态制剂，检验其菌株的特性和数量。 4）现代基因工程菌和尚未培养菌的检测阶段5）快速检测阶段化学比色分析法、酶联免疫法（ELISA)、免疫胶体金试纸检测法。生物芯片、传感器、色谱质谱检测仪。特点： 实验准备简化、试剂少；样品前处理简单；分析方法简单、准确、快速。第二章 食品微生物检验技术第一节 培养基 在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基。一、 培养基中的主要成分及其作用（一）营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水。1、 常用的N源物质：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏2、 糖、醇类物质单糖：葡萄糖

6、、果糖、半乳糖、甘露糖双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖多糖：淀粉、纤维素、菊糖 醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油（二）水 用蒸馏水，不能用自来水。（三）凝固剂琼脂、明胶、血清等。 要求：清一色、杂质少。（四） 抑制剂1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率。2、种类： 盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等。 染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红。 胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐。 抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素。（五） 指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。2

7、、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。二、培养基的类型由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。（一） 根据培养基的物理状态来区分1、液体培养基 ：主要用于增菌培养、鉴别性培养，大型生产、科研等。2、固体培养基 ：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。3、半固体培养基：观察微生物的动力，菌种鉴定等。4、脱水培养基 ：含有除水分外的一切成分的商品培养基，使用时加水灭菌。（二）根据培养基的用途来区分 1、增殖培养基：在普通培养基中加入一些某种微

8、生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。2、选择培养基 ：在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。分离培养用的培养基名 称 用 途SS琼脂培养基 沙门氏菌和志贺氏菌属分离HE琼脂培养基 志贺氏菌分离鉴别伊红美蓝琼脂培养基 大肠杆菌、产气杆菌分离鉴别麦康凯琼脂培养基（MacC）肠道致病菌分离甘露醇高盐琼脂培养基 绿脓杆菌分离鉴别XLD琼脂培养基 志贺氏菌、沙门氏菌分离中国蓝琼脂培养基 肠道菌分离鉴别碱性琼脂培养基 霍乱弧菌分离高盐蔡氏琼脂培养基 真菌、酵母菌分离3、鉴别培养基 ：在培养基中加入某种试剂

9、或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。名 称 用 途蛋白胨水培养基 靛基质和霍乱红试验乳糖胆盐发酵培养基 大肠杆菌发酵乳糖试验0.5%乳糖发酵培养基 肠道菌生化试验（复发酵）半固体培养基 动力试验和菌种保存三糖铁琼脂培养基（TST） 肠杆菌糖发酵及硫化氢反应氰化钾基础培养基 沙门氏菌分离脱羧酶试验对照培养基 细菌脱羧酶试验三、培养基制备的基本方法和注意事项 1、培养基的制备记录 每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间，制备的日期和制备者等。2、 培养基成分

10、的称取 培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于旁侧，每称完一种成分即在配方上面做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。3、 培养基各成份的混合和溶化 指示剂应在调节好pH值后再加入；煮溶后要补加足水份；不能把培养基煮焦，焦化的不能使用。4、 培养基pH的初步调正 灭菌后pH值会下降0.10.2，在做培养基校正pH值时，应比实际值高0.10.2；pH调整后，还应将培养基煮沸。5、 培养基的过滤澄清液体培养基可用滤纸过滤法。琼脂培养基,可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。6、 培养

11、基的分装斜面： 1/管 半固体培养基：1/3管 高层斜面：1/41/3管 平板：1315mL7、 培养基的灭菌（1）含糖类或明胶的培养基： 113灭菌15分钟或115灭菌10分钟。（2）无糖培养基： 121灭菌1520分钟。（3）血液、体液和抗生素等以无菌操作技术抽取后再加入冷却至约50左右的培养基中。（4）琼脂斜面培养基应在灭菌后冷至55-60时取出，再摆置成适当斜面。8、培养基的质量测试（）如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等,均应挑出弃去。并测定其最终pH。（）将全部培养基放入361C恒温箱培养过夜， 如发现有菌生长，即弃去。（）用有关的标准菌株接种12管或瓶培养基，培 养

12、2448小时，如无菌生长或生长不好,应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。9、培养基的保存 （1）基础培养基不能超过两周。（2）生化试验培养基不宜超过一周。（3）选择性或鉴别性培养最好当天使用，倾注的平板培养基不宜超过3天。培养基配制器材：培养基、玻璃器皿、天平、药匙培养基配制仪器：灭菌锅、无菌操作台培养基配制装水：以量桶装取适量蒸馏水于玻璃容器中；于玻璃容器上标示培养基名称。培养基配制称药：放上秤药纸并归零；以秤药匙舀出适当量培养基培养基配制溶解培养基：倾倒培养基时小心不要沾到玻璃壁上注意事项配药结束：清理配药桌面与天平；清洗称药匙，擦干放回；药品放回药品柜

13、培养基配制分装：调整分注器刻度；分装试管；盖上试管盖培养基配制灭菌：放入灭菌锅灭菌注意事项：拿灭菌后物品记得带耐热手套培养基的配制 平板培养基：灭过菌的固态培养基于无菌操作台內倒制平板培养基第二节 微生物检验的基本操作技术一、无菌技术（一）什么是无菌技术？指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。（二）无菌环境：无菌室、无菌柜、超净工作台1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间。（2）无菌室的消毒和防污染：每日（使用前）紫外线照射（12小时）。每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）。每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次。2、超净工作台超净台的

14、使用与保养:（1）风速保持在0.32-0.48米/秒;（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上;（3）让超净台预工作1015分钟;（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。（三）无菌器材灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等。 消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等。（四）无菌操作1、目的：（1）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；（2）是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。2、进入无菌室前的准备（1） 定期检查无菌环境的空气是否符合规定；（2） 用紫外线灭菌处理3060分钟；（3） 检查无菌器材是否完备；（4） 洗手消毒；（5） 手部消毒后，再穿戴无菌工作

15、服。3、检验操作过程的无菌操作要求（1） 在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2） 使用玻璃器皿应轻取轻放；（3） 在火焰正上方操作；（4） 接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5） 在接种培养物时，动作应轻、准；（6） 不能用嘴直接吸吹吸管；（7） 带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。 无菌操作取菌技巧 (从斜面取菌）1.接种环前端铁丝部分以酒精灯烧红，后端铁棒部分过火。2. 试管前端过火。3. 打开试管盖。4. 试管倾斜，放入接种环。无菌操作取菌技巧 (从平板取菌）1. 自平板上取单一菌落 (方法一：盖子微开遮住培养基，避免空气中菌体掉入；方法二：平板反

16、面拿起)。无菌操作取菌技巧（从液体内取菌）1. 调整移液枪刻度。2. 插上灭过菌的枪头 (用力插紧)。3. 按钮压至第一段 (不可压至最底)。4. 深入液面下 2 - 4 mm。5. 慢慢释放按钮，即可 吸取液体。无菌操作接菌技巧1. 试管前端过火。2. 打开试管盖。方法一：以接种环沾菌，放入新的培养基中接菌。方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培养基中，向下排出菌液。方法三：以移液枪吸取菌液，按钮压至最底排出菌液。无菌操作错误示范试管直放，空气中菌体容易掉入。操作时距离火源远。移液枪倒放，菌液容易流入。注意事项生物性废弃物：放在正确位置以便灭菌。二、微生物的接种与分离技术（一）接种：将微生物

17、接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。、接种工具和方法接种和分离工具：接种针；接种环；接种钩；玻璃涂棒；接种圈；接种锄；小解剖刀常用的接种方法有以下几种：1）划线接种：在固体培养基表面作来回直线的移动。 2）三点接种：把少量微生物接种在平板表面上成等边三角形的三点，让他们各自独立形成菌落。3）穿刺接种：用接种针蘸取少量菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺。4）浇混接种：将待接的微生物先放到培养皿中，然后倒入冷却好的培养基，迅速轻轻摇匀，待平板凝固后，置于适宜温度下培养。5）涂布接种：先倒好培养基，让其凝固后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面做左右涂布，让菌液均

18、匀分布。6）液体接种：从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中。 7）注射接种：用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内。8）活体接种 ：用于培养病毒或其它病原微生物，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。(二) 分离纯化、倾注平板法首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40-50左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒温箱中培养。单

19、一细胞经多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。 、 涂布平板法首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃涂棒把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。 、平板划线法最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。三、微生物的培养方法（一）根据培养时是否需要氧气分好氧培养；厌氧培养：最重要的一点就是要除去培养基中的氧气。

20、（二）根据培养基的物理状态分固体培养；液体培养第三节 微生物常规鉴定技术一、形态结构主要通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。二、培养特性：1）细菌的培养特性：固体培养基：观察菌落大小、形态、颜色、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性。液体培养基：表面生长情况（是否有菌膜、菌环出现）、浑浊度如何、是否有沉淀出现等。半固体培养基：观察细菌是否有运动、扩散情况。2）酵母菌的培养特性：固体培养基：大多数酵母菌没有丝状体

21、，在固体培养基上形成的菌落与细菌很相似，只是比细菌菌落大且厚。 液体培养基：液体培养基也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。3）霉菌培养特性：霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在适宜条件的培养基里菌丝无限伸长，沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同的颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面的颜色常常不同。三、生理特性试验1、适应环境特性试验：各种微生物对生活的环境均有不同的适应性，对这些环境因素的适应性实验是微生物检验研究的基本内容，也常用来鉴别一些在形态和其他方面不易区分的微生物。 （1）生长温度试验：各种微生物进行正常的新陈代谢均要有一定的生长温度范围，如果环境温

22、度超出这个范围，便会对微生物产生不利影响，引起微生物生长停滞甚至大量死亡。试验方法：将微生物分别接种于5、10、20、30、37、41、45、55培养箱中培养1-2d，观察不同温度下各个微生物的生长情况，确定生长温度范围和最适温度。同时还要做一个空白试验，即准备一只未接种的培养基试管在37 下同时培养，若空白试管未见异常，则试验结果有效。（2）耐热试验：测定生物在不同温度下的抵抗能力。普通微生物的营养体在60-70可存活30min，在100时几分钟即可死亡，而细菌芽孢及真菌孢子等对热的抵抗力就很强。试验方法：将纯培养物各取0.1mL，接种于一系列肉汤培养基中，分别置于50、53、56、60、6

23、5、70、80、90等不同的高温水浴中，隔水加热10min或30min后立即浸入冷水中冷却，然后一起放入37培养箱中培养24h，取出后观察各管中微生物生长情况。以判断致死最低温度和致死时间。空白：同生长温度试验。（3）生长pH实验：环境酸碱度对微生物生长发育有很大的影响，每一种微生物都有各自的生长pH范围，可划分为最高、最适、最低生长PH。大多数细菌和放线菌的最适生长pH在7.2-7.6之间，真菌类则大约在3.0-6.5的范围内生长。试验方法：按照不同的实验菌种选择适宜的液体培养基，用酸或碱调整培养基的pH（5.4，5.6,5.810.0等），然后将菌种分别接种于上述培养基中于37 培养1-2

24、d，定时观察各个微生物的生长情况。判断微生物的最高、最适、最低生长的pH范围。（4）耐盐实验：观察渗透压对微生物生长影响。不同微生物对盐的浓度要求不同，过高的盐浓度所形成的高渗透压会对微生物造成不利影响。试验方法：将普通肉汤培养液调成不同浓度的盐溶液（0、1、2、4、6%.10%等）经过灭菌后分别接种待试菌种，然后在37培养，观察微生物生长情况。判断菌生长的氯化钠浓度范围及最适宜盐浓度。 2、生化试验：指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。（一）生化试验的方法1）在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的pH值变化。2）

25、在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。3）根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。4）根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。（二）生化试验的注意事项1）待检菌应是新鲜培养物。培养1824h。2）待检菌应是纯种培养物。3）遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。4）应做必要的对照试验。5）提高阳性检出率，至少挑取23个待检的疑似菌落分别进行试验。（三）生化试验的范围从食品质检的角度，主要是试验各种糖类能否作为碳源和能源被利用，对于氮源主要检验其对蛋白质、蛋白胨、氨基酸、铵盐及硝酸盐的利用能力。（四）生化试验1）糖醇类代谢试验 糖酵解试验（糖醇类发

26、酵试验）原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇，有的只能分解12种糖醇 ，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。试验方法：用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置361.0 培养13天，每天观察结果。检视培养基颜色有无变化，小倒管中有无气泡。一般常用的指示剂为：酚红、溴甲酚紫、溴百里酚蓝 （红变黄）（紫红变黄）（蓝变黄）。结果观察和记录：产酸不产气，阳性，以“+”表示产酸产气，阳性，以“”表示不产酸不产气，阴性，以“-”表示 葡萄糖氧化发酵（O/F）试验 原理：细菌

27、对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。试验方法：取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37培养24天，每天观察结果。结果观察与记录： 封油管 未封油管发酵型 产酸（黄色） 产酸（黄色）氧化型 不产酸（蓝色） 产酸（黄色）产碱型 不产酸（蓝色） 不产酸（蓝色） 乙酰甲基甲醇试验（V-P试验）原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇

28、，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V-P（+）反应。试验方法奥梅拉法： 将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361 培养48h， 每1mL培养液加奥梅拉OMeara试剂（加有0.3%肌酸或肌酸酐的40%氢氧化钠水溶液）0.1mL，摇动试管12min，静置于37恒温箱4h ，或在4850 水浴放置2h后判定结果。结果观察与记录：（1）发酵管出现红色者，为阳性，记V-P + （2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记V-P 甲基红试验（M.R试验）原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使

29、丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基pH值下降至pH4.5以下，使甲基红变红色，为甲基红试验阳性 ；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH5.4，甲基红呈桔黄色，为甲基红试验阴性。试验方法：挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于361 或30 （以30 较好）培养35天，从第48h起，每日取培养液1mL，加入甲基红指示剂12滴，立即观察结果。结果观察与记录：（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR +； （2）呈橘黄色或黄色为阴性， 记MR -， 迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。2） 氮源代谢试验

30、靛基质（吲哚）试验原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。试验方法：将待检菌小量接种于培养基中，于361 培养2448h时后，沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5mL覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。结果观察与记录：呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+；无红色者，为阴性反应，记尿素酶试验原理：某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚酞指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。试验方法：挑取1824h待试菌培养物大量

31、接种于液体培养基管中，摇匀，于361培养10，60和120min，分别观察结果。 或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2，4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。结果观察与记录：培养基变成粉红色，为阳性，记 +；培养基颜色不变，为阴性，记氨基酸脱羧酶试验原理：某些细菌能产生氨基酸脱羧酶, 可使赖氨酸、鸟氨酸产生脱羧作用, 生成胺类物质和CO2。胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性， 如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。试验方法：取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在361 培养14天，每天观察结果。结果

32、观察与记录：培养基变成红色，为阳性，记+；培养基变成黄色，为阴性，记 硫化氢（H2S）试验原理：某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或亚铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌。试验方法与记录：挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养基上，于361培养2448h，观察结果。培养基底部呈黑色，为阳性，记+；培养基底部无黑色，为阴性，记-苯丙氨酸脱氨酶试验原理：苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物。试验方法：加氯化铁试剂结果记录：生长于苯丙氨酸培养基上的菌苔出现绿色，记为+3） 三糖铁(TSI)试验测定细菌对葡萄糖、乳糖、蔗

33、糖的分解、产气和产硫化氢情况。原理：如果细菌可利用葡萄糖、乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。如果细菌能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部变黑。 试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于三糖铁斜面，置361培养1824h，观察结果。三糖铁琼脂成分：蛋白胨、牛肉膏、乳糖、蔗糖、葡萄糖、氯化钠、硫代硫酸钠、硫酸亚铁铵、酚红、蒸馏水。记录： 斜面：黄色为阳

34、性，记为+；红色记为- 底面：黄色为阳性，记为+；红色记为- 产气：产气为阳性，记为+；不产气记为- 产硫化氢：培养基底部变黑为阳性，记为+；培养基底部不变黑，记为-。4）呼吸酶类试验（氧化酶试验、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、氰化钾试验）5）毒性酶类试验（溶血试验、链激酶试验、卵磷脂酶试验、血浆凝固酶试验）四、血清学试验定义：是将抗原和抗体在体外血清环境中特异性结合的实验。常见的类型主要有：凝集反应、沉淀反应、溶解反应、补体反应和中和反应。特点：特异性强、灵敏度高。1、抗原与抗体：（1）抗原：是一种能够刺激人体或动物机体的免疫系统发生免疫应答，产生特异性抗体，并在其体内或体外与相应的抗体发

35、生特异性结合的物质。抗原的性质：一般为大分子胶体，相对分子量在10万以上，且分子量越高，其抗原性越强；大多数天然抗原物质都是蛋白质，但并非所有蛋白质都具有抗原性；抗原都具有高特异性，其特异性与其本身的化学结构有关；异质物质才具有抗原性，并且自身与抗原物质的亲缘关系越远，抗原性就越强。（2）抗体：是抗原刺激机体免疫系统而引起的免疫应答的产物之一，是一类免疫性球蛋白。抗体的性质：抗体是球蛋白，能与相应的抗原结合；抗体的相对分子量普遍较抗原大，在15万-100万之间；不同动物体内的球蛋白不同，因此，同一种抗原刺激不同动物所产生的抗体也会不同。2、诊断血清（1）诊断血清：将已知的抗原注射于动物体，使其

36、产生相应的抗体，采出动物的血液，分离出含有大量抗体的血清，称为诊断血清（或抗血清、免疫血清）。（2）诊断血清类型：抗O血清：用菌体抗原（O抗原）免疫动物后所获得的血清。抗H血清：用鞭毛抗原（H抗原）免疫动物后所获得的血清。表面抗原血清：用含有表面抗原的菌体免疫动物后所获得的血清。单因子血清：只含有一种特异性抗体的血清。复因子血清：含有两种抗体的血清称为复因子血清。多价血清：含有两种以上抗体的血清称为多价血清。（3）诊断血清的使用与保存：保存：210 冰箱；无菌取用，有效期2年。3、 凝集试验（1）颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应

37、。（2）凝集试验的方法：1）直接凝集法：颗粒性抗原与相应抗体直接结合 。2）间接凝集法：可溶性抗原（抗体）先吸附在一种与免疫无关的，颗粒状微球表面，然后与相应的抗体（抗原）作用。 直接凝集试验：玻片凝集法原理：用已知抗体作为诊断血清，来检测未知抗原,以鉴定相应的抗原。方法步骤：于洁净玻片的一端加诊断血清1滴，另一端加生理盐水1滴作为阴性对照。用接种环取待检菌或血细胞的悬液分别涂于诊断血清和生理盐水中。轻轻转动玻片，使其充分混匀，静置数分钟，观察结果。（凝集者为+）第三章 ） 第三章 食品微生物的基本程序一、 食品微生物检验的一般一般步骤 菌落总数 样品保存 样品处理 结果报告 大肠菌群 样品采

38、集 分离培养 染色镜检 选择参 检验前 致病菌 纯 生化验验 考菌群 的准备 化 血清学试验 增菌 分离培养 动物试验二、 检验前的准备1、准备好所需的各种仪器。2、按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。3、准备好所用的各种试剂，做好普通营养琼脂或其他选择培养基。4、做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前1h灭菌3060min。5、工作衣、鞋、帽等灭菌后备用。6、工作人员进入无菌室后，实验没有完成之前不得随便出入无菌室。三、样品的采集（一）采样的步骤采样前调查现场观察确定采样方案采样 样品封存 开具采样证明（二）采样的原则（要求）1、严格遵守样品采集的操作规程

39、。2、所采样品必须具有代表性。3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。4、在保存和运送过程中保证样品中微生物的状态不发生变化.5、采样标签应完整、清楚。（三）食品微生物检验的采样方案ICMSF（国际食品微生物规范委员会）取样方案；美国FDA的取样方案；世界粮农组织（FAO）取样方案；我国的食品取样方案。每批货物的抽样数量不得少于5件，对于需要检验沙门氏菌的，不少于8件。（四）食品微生物检验采样方法1、液体样品采样方法充分混匀后，无菌操作打开包装，用100mL无菌注射器抽取，注入无菌盛样容器。2、 半固体样品采样方法无菌操作打开包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。 3、固体样

40、品采样方法（1）大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割取，并注意其代表性；（2）小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。（3）若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。4、冷冻食品采样方法大包装小块冷冻食品按小块个体采取；大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无菌手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。5、 生产工序监测采样1）车间用水：从车间各龙头采样；2）车间台面、用具及加工售货员手的卫生监测：用5cm2孔无菌采样板和5支无菌棉签擦拭25cm2面积，擦拭后立即用无菌剪刀将棉签头剪入无菌容器中。3）车间空气采样：将5个直径90mm的普通琼

41、脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖盖送检。（五）采样标签的填写标签内容主要：编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况等。四、 样品的送检要求1、要快速运送：不要超过3小时；2、若路途遥远，可在15低温下运送；3、要注意防污染、防散漏、防变质；4、要填写检验申请单。五、样品的处理方法（一）液体样品的处理1.瓶装液体样品的处理 用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样

42、25mL检验。2.盒装或软塑料包装样品的处理将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品25mL ，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。（二）固体样品的处理1、捣碎均质法均质就是指物料的料液在挤压、强冲击与失压膨胀的三重作用下使物料细化，从而使物料能更均匀的相互混合.将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，800010000r/min均质12min即可。2、 剪碎振摇法将中样剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进一步剪碎，放入带225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖

43、，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。3、 研磨法将中样剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。4、 整粒振摇法直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。5、胃蠕动均质法将一定量的样品和稀释液放入无菌均质袋中，开机（均质器）均质。（三）冷冻样品冷冻样品，先将中样在04 下解冻，时间不能超过18h，或在45 下解冻，时间不能超过15min。再取检样25g做稀释处理。六、 样品的检验（一）收样： 1、收到样品后逐一核对验收，登记编号； 如2004年收到的50号样品，编号可写成：。2、立即将样品放在冰箱或冰盒中，并积极做好准备工作。（二）检验1、选择检验方法：国内：国家标准国外：国际标准：如FAO标准、WHO标准； 每个进口国的标准：如美国FDA标准、日本厚生省标准、欧共体标准等。2、检验要求（1）按照标准操作规程进行检验操作，边工作边做原始记录。（2）检测结束，连同结果一起交同条线技术人员复核。复核过程中发现错误，复核人应通知检测人更正，然后重新复核。（3）检测人和复核人在