基因工程药物PPT课件.ppt
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1、关于基因工程药物关于基因工程药物第一张,PPT共八十二页,创作于2022年6月基因工程制药基因工程制药:指利用:指利用重组重组DNA技术技术,结合发酵工,结合发酵工程、细胞工程、酶工程等现代生物技术研制预防和程、细胞工程、酶工程等现代生物技术研制预防和治疗人类、动物重大疾病的蛋白质药物、核酸药物治疗人类、动物重大疾病的蛋白质药物、核酸药物以及生物制品的一门技术。以及生物制品的一门技术。第二张,PPT共八十二页,创作于2022年6月28.1 基因工程药物的发展概况基因工程药物的发展概况8.1.1 基因工程药物的发展简史与现状基因工程药物的发展简史与现状8.1.2 基因工程药物的特点基因工程药物的
2、特点8.1.3 基因工程药物的研发过程基因工程药物的研发过程第三张,PPT共八十二页,创作于2022年6月38.1.1 基因工程药物的发展简史与现状基因工程药物的发展简史与现状1973年,年,Cohen等,等,tetr和和strr成功重组,基因工程拉成功重组,基因工程拉开序幕开序幕1974年,重组质粒转化大肠杆菌,获得相应抗性年,重组质粒转化大肠杆菌,获得相应抗性1976年,年,Genentech公司成立公司成立1982年,授权年,授权Eli Lilly公司公司基因重组动物疫苗抗眼基因重组动物疫苗抗眼球病疫苗生产和使用;人胰岛素生产和使用球病疫苗生产和使用;人胰岛素生产和使用希克劳希克劳百忧解
3、百忧解第四张,PPT共八十二页,创作于2022年6月41984年,凝血因子年,凝血因子VIII1985年,注射用促生长素年,注射用促生长素1987年,年,tPA。第五张,PPT共八十二页,创作于2022年6月5国家国家 发展策略发展策略 投入资金投入资金临床试临床试验验上市上市品种品种 产值产值美国支持基础创新,主导领先水平100亿US$/年350110200亿US$/年日本合作,实用化,信息化2千亿日元/年50种以上50五千亿日元/年德国创新,转让,加大投入10068中国重视,优先、优惠20余种2030亿人民币主要国家基因工程制药产业化概况主要国家基因工程制药产业化概况第六张,PPT共八十二
4、页,创作于2022年6月6基因工程药物现状与前景基因工程药物现状与前景2001年,生物技术公司年,生物技术公司4284家(上市家(上市622家),家),销售总额销售总额348亿美元,其中基因药物占亿美元,其中基因药物占70%,250亿美元;亿美元;美国,美国,1466家,占家,占55%;销售总额;销售总额285亿美元,亿美元,占占82;上市公司;上市公司318家,占家,占55%;日本日本欧洲欧洲表表8.1第七张,PPT共八十二页,创作于2022年6月7我国国情我国国情“起步晚,发展快;项目不多,仿制为主;重复生起步晚,发展快;项目不多,仿制为主;重复生产,后劲不足产,后劲不足”。IL-2,干扰
5、素,干扰素,粒细胞集落刺激因子(,粒细胞集落刺激因子(G-CSF),),EPO,生长激素。,生长激素。表表8.3第八张,PPT共八十二页,创作于2022年6月88.1.2 基因工程药物的特点基因工程药物的特点1、高技术:人才、技术、高技术:人才、技术2、长周期:实验室、中试、临床、规模化生产、长周期:实验室、中试、临床、规模化生产、市场商品化阶段、监督环节市场商品化阶段、监督环节3、高投入、高投入4、高风险、高风险5、高收益、高收益第九张,PPT共八十二页,创作于2022年6月9基因工程药物的优点基因工程药物的优点1、可以得到天然状态难以获得的生理活性物质,改造、可以得到天然状态难以获得的生理
6、活性物质,改造成新药成新药 胰岛素胰岛素2、使生理活性物质在各种反应器中获得高表达,符合临、使生理活性物质在各种反应器中获得高表达,符合临床和研究需要床和研究需要3、改造生理活性物质,提高其活性:速效、长效、改造生理活性物质,提高其活性:速效、长效4、可以挖掘和开发更多的新药,获得新物质、可以挖掘和开发更多的新药,获得新物质第十张,PPT共八十二页,创作于2022年6月108.1.3 基因工程药物的研发过程基因工程药物的研发过程1、实验室研究阶段(、实验室研究阶段(discovery,research)2、基因工程药品的开发阶段(、基因工程药品的开发阶段(development)3、基因工程药
7、品的临床试验(、基因工程药品的临床试验(commercialization):、期临床试验期临床试验4、新药申请和上市、新药申请和上市第十一张,PPT共八十二页,创作于2022年6月118.2 基因工程制药的下游技术基因工程制药的下游技术8.2.1 基因工程菌的规模化培养基因工程菌的规模化培养8.2.2基因工程菌细胞膜的破碎基因工程菌细胞膜的破碎8.2.3 基因重组蛋白的分离与纯化基因重组蛋白的分离与纯化下游技术下游技术:表达、分离纯化和活性测定:表达、分离纯化和活性测定第十二张,PPT共八十二页,创作于2022年6月128.2.1 基因工程菌的规模化培养基因工程菌的规模化培养8.2.1.1
8、重组大肠杆菌培养基重组大肠杆菌培养基8.2.1.2 基本培养方式基本培养方式8.2.1.3 培养工艺条件对外源基因表达的影响培养工艺条件对外源基因表达的影响8.2.1.4 培养条件对产物活性、存在形式及释放的影响培养条件对产物活性、存在形式及释放的影响8.2.1.5 高密度和高表达培养对策高密度和高表达培养对策第十三张,PPT共八十二页,创作于2022年6月138.2.1.1 重组大肠杆菌培养基重组大肠杆菌培养基C源、源、N源、无机盐、微量元素、维生素、生物素等源、无机盐、微量元素、维生素、生物素等LB培养基、培养基、M9培养基培养基按组成物质的来源分:合成培养基、天然培养基按组成物质的来源分
9、:合成培养基、天然培养基按存在状态分:固体、液体培养基按存在状态分:固体、液体培养基第十四张,PPT共八十二页,创作于2022年6月148.2.1.2 基本培养方式基本培养方式1、分批培养(、分批培养(batch culture):):在一个封闭培养在一个封闭培养系统内含有初始限制量的基质的培养方法。培养系统内含有初始限制量的基质的培养方法。培养过程从接种开始,经过过程从接种开始,经过4 4个时期:迟滞期、对数生长个时期:迟滞期、对数生长期、减速期和稳定期。期、减速期和稳定期。2、补料分批培养(、补料分批培养(fed-batch culture)3、连续培养(、连续培养(continuous
10、culture)4、透析培养(、透析培养(dialysis culture)第十五张,PPT共八十二页,创作于2022年6月158.2.1.3 培养工艺条件对外源基因培养工艺条件对外源基因表达的影响表达的影响u工程菌大规模培养的优化设计和控制对外源基因的工程菌大规模培养的优化设计和控制对外源基因的高效表达至关重要。高效表达至关重要。工艺工艺:选择合适的发酵系统或生物反应器。:选择合适的发酵系统或生物反应器。生物学生物学方面的因素:方面的因素:与细菌生长密切相关的条件或因素:与细菌生长密切相关的条件或因素:温度温度、pH值值、溶氧溶氧、培养基成分、培养基成分 表达条件表达条件 诱导物、改变温度诱
11、导物、改变温度 提高外源基因表达产物的总量:提高外源基因表达产物的总量:表达水平、菌体浓度表达水平、菌体浓度第十六张,PPT共八十二页,创作于2022年6月168.2.1.4 培养条件对产物活性、存在培养条件对产物活性、存在形式及释放的影响形式及释放的影响对产物活性和存在形式的影响:温度和对产物活性和存在形式的影响:温度和pH值值存在形式:包涵体、融合蛋白、分泌型存在形式:包涵体、融合蛋白、分泌型第十七张,PPT共八十二页,创作于2022年6月17外源基因在大肠杆菌中的表达形式外源基因在大肠杆菌中的表达形式表达产物可能存在于:细胞质、细胞周质、胞外培养表达产物可能存在于:细胞质、细胞周质、胞外
12、培养基中基中表达形式表达形式:可溶性蛋白、不溶性蛋白:可溶性蛋白、不溶性蛋白包涵体蛋白包涵体蛋白融合蛋白融合蛋白分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白第十八张,PPT共八十二页,创作于2022年6月181 1、包涵体蛋白包涵体蛋白包涵体包涵体:一定条件下,外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累:一定条件下,外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密的聚集在一起形成无膜的裸露结构。并致密的聚集在一起形成无膜的裸露结构。细胞质中较多,较少细胞周质细胞质中较多,较少细胞周质由蛋白质组成,氨基酸序列正确,空间构象错误,无生由蛋白质组成,氨基酸序列正确,空间构象错误,无生物学活性。物学活性。包涵体包涵体优点优点:易于分
13、离纯化易于分离纯化对蛋白酶有较好的抗性对蛋白酶有较好的抗性第十九张,PPT共八十二页,创作于2022年6月192 2、融合蛋白融合蛋白融合蛋白融合蛋白:外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组:外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起,但不改变两个基因阅读框。在一起,但不改变两个基因阅读框。受体菌蛋白位于受体菌蛋白位于N端,外源蛋白位于端,外源蛋白位于C端。端。融合蛋白优点:融合蛋白优点:稳定性增加:杂合构象,不易被水解稳定性增加:杂合构象,不易被水解具有较高的水溶性和生物学活性具有较高的水溶性和生物学活性能以较高的效率表达:自身蛋白能以较高的效率表达:自身蛋白易于分离纯化:易于分离纯化:酶水解
14、酶水解第二十张,PPT共八十二页,创作于2022年6月203 3、分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白分泌型蛋白分泌型蛋白:指外源基因的表达产物通过运输或分泌:指外源基因的表达产物通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中。的方式穿过细胞的外膜进入培养基中。分泌蛋白需在分泌蛋白需在N端端加上信号肽序列。加上信号肽序列。分泌型蛋白分泌型蛋白优点优点:简化了纯化工艺简化了纯化工艺使外源蛋白免于被降解使外源蛋白免于被降解有利于形成正确的构象,获得有生物活性的蛋白质。有利于形成正确的构象,获得有生物活性的蛋白质。第二十一张,PPT共八十二页,创作于2022年6月21表达蛋白在细胞中的稳定性表达蛋白在细胞中
15、的稳定性防止蛋白降解防止蛋白降解融合蛋白融合蛋白表达系统:封闭了水解酶作用位点,增加稳表达系统:封闭了水解酶作用位点,增加稳定性。定性。分泌蛋白分泌蛋白表达系统:分泌到细胞周质、培养基中表达系统:分泌到细胞周质、培养基中包涵体包涵体表达系统:难溶性的沉淀复合物表达系统:难溶性的沉淀复合物,不易被宿不易被宿主蛋白水解酶降解。主蛋白水解酶降解。蛋白蛋白水解酶基因缺陷型水解酶基因缺陷型的受体系统:的受体系统:第二十二张,PPT共八十二页,创作于2022年6月228.2.1.5 高密度和高表达培养对策高密度和高表达培养对策1、高密度培养:、高密度培养:2、高表达培养:、高表达培养:单因素实验单因素实验
16、正交实验正交实验第二十三张,PPT共八十二页,创作于2022年6月23基因表达产物的分离纯化基因表达产物的分离纯化收集细胞收集细胞破碎细胞破碎细胞初步分离初步分离柱层析柱层析经一步分离纯化经一步分离纯化第二十四张,PPT共八十二页,创作于2022年6月248.2.2基因工程菌细胞膜的破碎基因工程菌细胞膜的破碎(一)细胞收集(一)细胞收集离心法离心法贝克曼贝克曼beckman离心机离心机第二十五张,PPT共八十二页,创作于2022年6月25(二)破碎细胞(二)破碎细胞变性剂裂解法:哺乳动物变性剂裂解法:哺乳动物 SDS超声波破碎法超声波破碎法:细菌和酵母:细菌和酵母 缓冲液缓冲液机械破碎法机械破
17、碎法适用于细菌、酵母、植物细胞适用于细菌、酵母、植物细胞石英砂、细玻璃珠:石英砂、细玻璃珠:液氮液氮酶解裂解法:细菌、酵母、植物酶解裂解法:细菌、酵母、植物cell第二十六张,PPT共八十二页,创作于2022年6月268.2.3 基因重组蛋白的分离与纯化基因重组蛋白的分离与纯化8.2.3.1 重组蛋白的分离重组蛋白的分离1、离心:、离心:去除未破碎的细胞和细胞碎片等去除未破碎的细胞和细胞碎片等2、沉淀:盐溶和盐析:、沉淀:盐溶和盐析:(NH4)2SO4;有机溶剂沉淀:有机溶剂沉淀:乙醇、丙酮;乙醇、丙酮;等电点沉淀等电点沉淀3、膜分离:透析和超滤:透析膜、超滤管、膜分离:透析和超滤:透析膜、超
18、滤管透析透析超滤超滤第二十七张,PPT共八十二页,创作于2022年6月274、双水相萃取双水相萃取:利用物质在互不相溶的两水相间分配系利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行萃取的方法。数的差异进行萃取的方法。原理:水相中加入溶于水的高分子化合物,形成密度原理:水相中加入溶于水的高分子化合物,形成密度不同的两相体系。不同的两相体系。形成原因:聚合物的不相容性,即聚合物分子的空间形成原因:聚合物的不相容性,即聚合物分子的空间阻碍作用,无法形成均一相。阻碍作用,无法形成均一相。n双聚合物:聚乙二醇双聚合物:聚乙二醇(PEG)/(PEG)/葡聚糖葡聚糖(Dx)(Dx)。该系统上相。该系统上相富
19、含富含PEGPEG,下相富含,下相富含DxDx;第二十八张,PPT共八十二页,创作于2022年6月285、反胶团萃取:、反胶团萃取:反胶团反胶团:是表面活性剂分散在连续的有机溶剂:是表面活性剂分散在连续的有机溶剂中,自发形成的纳米尺度的一种聚集体。中,自发形成的纳米尺度的一种聚集体。第二十九张,PPT共八十二页,创作于2022年6月298.2.3.2 基因重组蛋白的纯化方法基因重组蛋白的纯化方法进一步分离纯化进一步分离纯化离子交换层析:等电点的差异离子交换层析:等电点的差异 阳、阴离子阳、阴离子凝胶柱层析(分子筛):分子量大小凝胶柱层析(分子筛):分子量大小亲和层析:分子间特异相互作用亲和层析
20、:分子间特异相互作用凝胶层析柱凝胶层析柱离子交换柱离子交换柱亲和层析柱亲和层析柱第三十张,PPT共八十二页,创作于2022年6月30柱层析柱层析基本步骤基本步骤(1)装柱)装柱 (2)柱平衡)柱平衡(3)上样)上样 (4)洗脱)洗脱(5)样品收集:鉴定脱盐浓缩)样品收集:鉴定脱盐浓缩自动核酸蛋白分离层析仪自动核酸蛋白分离层析仪 第三十一张,PPT共八十二页,创作于2022年6月31基因表达产物的精细纯化基因表达产物的精细纯化检测、制备和纯化蛋白质检测、制备和纯化蛋白质 蛋白浓度、纯度测定蛋白浓度、纯度测定PAGESDS-PAGEHPLC第三十二张,PPT共八十二页,创作于2022年6月328.
21、2.3.3 重组蛋白活性的测定重组蛋白活性的测定生物活性的保持生物活性的保持免疫测定法免疫测定法第三十三张,PPT共八十二页,创作于2022年6月338.3 几种重要基因工程药物的研发概况几种重要基因工程药物的研发概况8.3.1 基因工程激素类药物基因工程激素类药物8.3.2 基因工程基因工程细胞因子细胞因子类药物类药物8.3.3 基因工程抗体基因工程抗体8.3.4 基因工程疫苗基因工程疫苗8.3.5 基因工程受体基因工程受体第三十四张,PPT共八十二页,创作于2022年6月348.3.1 基因工程激素类药物基因工程激素类药物u激素(激素(hormone):由生物体内分泌腺或特异性细):由生物
22、体内分泌腺或特异性细胞产生的微量有机化合物,通过体液或细胞外液运胞产生的微量有机化合物,通过体液或细胞外液运送到特定的作用部位,能引起特殊的生理效应。送到特定的作用部位,能引起特殊的生理效应。分类:分类:多肽蛋白类激素多肽蛋白类激素、甾醇类激素、脂肪酸类激、甾醇类激素、脂肪酸类激素素如胰岛素、人生长激素、人促卵泡激素如胰岛素、人生长激素、人促卵泡激素第三十五张,PPT共八十二页,创作于2022年6月35u激素(hormones):又称化学信使,是特定细胞合成的,能使生物体发生一定反应的有机分子;它们的作用力很强,很低的浓度就能引起很强的反应;它们都是短命的,在细胞中不能积累,很快就会被破坏。激
23、素都是有特异性的,只对某种或某几种细胞有效,具有接受相应激素的特异受体。第三十六张,PPT共八十二页,创作于2022年6月36激素的传递方式激素的传递方式第三十七张,PPT共八十二页,创作于2022年6月378.3.1.1 胰岛素(胰岛素(insulin)l概况:动物胰脏胰岛的概况:动物胰脏胰岛的细胞以细胞以前胰岛素原前胰岛素原形式合形式合成成跨膜运输后成跨膜运输后成胰岛素原胰岛素原高尔基体内形成成熟高尔基体内形成成熟胰岛素胰岛素。l生理功能:治疗糖尿病生理功能:治疗糖尿病 降低血糖降低血糖提高组织摄取葡萄糖的能力提高组织摄取葡萄糖的能力抑制肝糖原的分解抑制肝糖原的分解促进肝糖原和肌糖原的合成
24、促进肝糖原和肌糖原的合成第三十八张,PPT共八十二页,创作于2022年6月38 胰岛素原的结构第三十九张,PPT共八十二页,创作于2022年6月39基因工程生产人胰岛素的途径基因工程生产人胰岛素的途径用大肠杆菌发酵生产胰岛素原,用大肠杆菌发酵生产胰岛素原,在体外将胰岛素原转变为胰岛素。在体外将胰岛素原转变为胰岛素。(丹麦丹麦NovoNordisk公司公司)先分别大肠杆菌发酵胰岛素的先分别大肠杆菌发酵胰岛素的A链链和和B链,纯化后再在体外重组产生完整链,纯化后再在体外重组产生完整的人胰岛素。(美国的人胰岛素。(美国Elililly公司)公司)酵母发酵产生前胰岛素原。酵母发酵产生前胰岛素原。第四十
25、张,PPT共八十二页,创作于2022年6月40已上市的基因工程胰岛素药物已上市的基因工程胰岛素药物1、重组人胰岛素:、重组人胰岛素:Humulin、Novoli2、重组人胰岛素类似物:赖脯胰岛素、重组人胰岛素类似物:赖脯胰岛素 Humalog,作,作用快用快3、甘精胰岛素:、甘精胰岛素:Lantus4、门冬胰岛素:、门冬胰岛素:Novolog:速效:速效HumulinHumalog第四十一张,PPT共八十二页,创作于2022年6月41曾经的曾经的II型糖尿病治疗药物型糖尿病治疗药物第四十二张,PPT共八十二页,创作于2022年6月42研制基因工程药物胰岛素的基本路线研制基因工程药物胰岛素的基本
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