实验十二氨基转换反应的定性鉴定精品文稿.ppt

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1、实验十二氨基转换反应的定性鉴定第1页，本讲稿共11页实验原理转氨酶能催化-AA的氨基与-酮酸的-酮基互换，生成一种新的氨基酸和新的-酮酸，这种反应称为转氨作用。它在体内蛋白质合成与分解等中间代谢中，在糖、脂肪、蛋白质之内物质代谢的相互关系、相互转化上都起着重要作用。任何一种氨基酸的转氨基反应都由专一的转氨酶催化，其最适pH接近7.4。其中Glu-草酰乙酸转氨酶及谷氨酸-丙酮酸转氨酶活力最强。当机体发病时，如肝炎、心肌梗塞等，血清中转氨酶活力显著增加。测定转氨酶活性的方法有分光光度法、纸上层析、光电比色法。为防止丙酮酸被组织中其它酶氧化或还原，可加碘乙酸或溴乙酸以抑制酵解或氧化作用。第2页，本讲

2、稿共11页氨基转换反应试管号 酶液 15%三氯乙酸 1%Glu 1%丙酮酸 0.1%碳酸氢钾 0.05%碘乙酸 1 10d 10d,10min 10d 10d 10d 5d 2 10d 10d 10d 10d 5d37-40反应1.5小时，经常摇动确保反应进行完全。保温后取出第2号试管，加入15%三氯乙酸10d，沉淀蛋白终止反应。将两只试管中的内容物转移到离心管中，2500rpm/min离心5min，将上清转移到干净的试管中备用。第3页，本讲稿共11页纸层析检测原理滤纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸的成份是纤维素，纤维素的 OH基为亲水性基团，因此可吸附一层水或其它溶剂作为固定相

3、。通常把有机溶剂作为流动相。当将溶质样品(被分离物)点在滤纸的一端后，该物质溶解在吸附于支持物上的水分子或其它溶剂分子的固定相中，有机溶剂自下而上移动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相对溶质进行连续的抽提，物质在两相间不断分配的结果即得到分离。第4页，本讲稿共11页纸层析检测 纸层析是以滤纸为载体，用一定的溶剂系统展开而达到分离、分析目的的层析方法。此法可用于定性，亦可用于分离制备微量样品。20ml展层剂饱和20min点样展层2小时左右显色第5页，本讲稿共11页Rf值的定义l物质分离后在图谱上的位置，可用比移值 Rf来表示，Rf值的定义是：从溶质层析的起点(原点)到层析斑点中心的垂直距

4、离与从原点到溶剂流动的前沿的垂直距离的比值：Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 l两相体积比在同一实验情况下是不变的，所以 Rf值的主要决定因素是分配系数()。对于每一物质在一定条件下值是固定的，因此Rf值为其特征常数，可做为定性鉴定的参考数值。第6页，本讲稿共11页影响 Rf值的主要因素 1.物质结构对于Rf值的影响 2.溶质与溶剂间的相互作用对Rf值的影响 3.pH对Rf值的影响 4.滤纸对Rf值的影响 5.温度对Rf值的影响 第7页，本讲稿共11页转氨基反应的定性鉴定原理无色物质的层析图谱可用光谱法(如核苷酸类物质用紫外光照射)或显色法鉴定。氨基酸纸上层析图谱常用的显色剂

5、有茚三酮、吲哚醌。本实验采用茚三酮为显色剂。茚三酮显色反应受温度、pH，时间影响较大。如果要使结果重复，必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不显出颜色。样品中含大量盐时显色点上会出现白斑，空气中其它的杂质如氨，硫化氢或酚等皆会影响显色结果。铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定，用硫酸铜乙醇溶液洗脱层析后的显色斑点，可以通过比色法定量测定氨基酸含量。第8页，本讲稿共11页转氨基反应的定性鉴定原理37保温1.5小时氨+还原茚三酮氨+还原茚三酮水和茚三酮紫色物质第9页，本讲稿共11页预期的实验结果第10页，本讲稿共11页思 考影响转氨基作用的因子有哪些？实验过程中应注意些什么？网上查询有关转氨酶的研究动态。第11页，本讲稿共11页