余甘子提取物对大鼠佐剂性关节炎的干预作用_宋琳琳.docx

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1、时珍国医国 药 2014 年 第 25 卷 第 11 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATE IA MEDICA ESEA CH 2014 VOL 25 NO 11 2580 余甘子提取物对大鼠佐剂性关节炎的干预作用 宋琳琳 ， 沙靖全 * ， 赵 宏 ， 刘凤华 ( 佳木斯大学药学院 ， 黑龙江 佳木斯 154007) 摘 要 : 目 的 探讨余甘子提取物的醇溶超声提取的最佳条 件 ， 及其对大鼠佐剂性关节炎的干预作 用 。 方 法 以余甘子为 原 料 选择最佳提取条件通过醇溶超声方法提取余甘子总黄 酮 ， 并测定其 含 量 ; 建立大鼠佐剂性关节炎模型并于给 药 21d

2、 后 以大鼠血清 中 TNF 、 IL 6 含量 和 PGE2 含 量 、 血液常规检测及 血液沉降 率 、 类风湿因子等生理生化指标的变 化 ， 对 余 甘子总黄酮干预关节炎疾病的药效 学进行研 究 。 结 果 经提取后得余甘子总黄 酮 5 56g， 通过计算得总黄酮 含量 为 59 07% ， 与模型组相 比 ， 余甘子黄酮高剂量组 中 TNF 的含量显著降 低 ， 余甘子黄酮 高 、 低剂量组血清 中 IL 6 和 PGE2 含 量显著降 低 。 结 论 余甘子总黄酮对大鼠佐剂性关节炎有一定的干预作 用 。 关键词 : 余甘子 ; 黄酮 ; 佐剂性关节炎 弗氏完全佐剂 DOI 标 识 :

3、 doi: 10 3969 / j issn 1008-0805 2014 11 006 中图分类 号 : 285 5 文献标识 码 : A 文章编 号 : 1008-0805( 2014) 11-2580-02 Intervention effects of Phyllanthi Fructus extract on adjuvant arthritis rats SONG Lin-lin， SHA Jing-quan* ， ZHAO Hong， LIU Feng-hua ( School of Pharmacological Sciences， Jiamusi University， He

4、ilongjiang 154007， China) Abstract: Objective To explore the best condition of gliadin of ultrasonic extraction of the Phyllanthi Fructus extract and its in- tervention effect of adjuvant arthritis of rats Methods With the Phyllanthi Fructus as raw material to choose the best extraction conditions b

5、y gliadin ultrasound method and determination of its content After treated the model rats for 21 days collected the blood of all rats to measure the level of TNF ， IL 6 and the blood sedimentation rate， rheumatoid factor， The Phyllanthi Fruc- tus flavone of flavone intervention rheumatoid arthritis

6、disease were studied esults After ultrasonic extraction of the Phyllanthi Fructus was more than the basic flavonoids 5 56g， through the regression equation to flavonoids content is 59 07% Compared with the model group， the Phyllanthi Fructus flavone content of TNF in high dose group decreased signif

7、icantly， the residual and the Phyllanthi Fructus flavone high and low dose group of serum IL 6 and PGE2 levels in the inflammatory tissue decreased signifi- cantly Conclusion Phyllanthi Fructus flavone has a certain intervention effect of adjuvant arthritis of rats Key words: Phyllanthi Fructus; Fla

8、vone; Adjuvant arthritis; Freunds complete adjuvant 余甘子又名山油 柑 、 油 甘 子 、 余甘果 等 ， 为大戟科叶下珠 属 植 物余甘 子 Phyllanthus emblica L 的干燥 成熟果 实 1 。 在民 间 ， 余 甘 子常用于治疗胆道疾 病 、 支气管 炎 、 糖尿 病 2 等 。 余甘子是 一 种具有较高食用和药用 价值的野生植物资 源 ， 风味独 特 ， 营养 丰 富 ， 保 健功能 强 ， 含有多种对人体有益的活性物 质 ， 具有补 益 、 抗 肿 瘤 、 抗衰老等保健作 用 ， 为联合国卫生组织指定在全世界推广 种

9、 植的三种 保健植物之 一 。 目前研究证 明 ， 余甘子主要含有酚 类 、 黄酮类成 分 ， 具 有 抗 HBV、 抗 癌 、 抗病 毒 、 降 脂 、 抗氧 化 、 保 肝 等多种功 效 3 ， 目 前 ， 国内外对 余甘子主要成分和生物活性研究 越来越受到人们的关 注 ， 但其抗类风湿性关节炎的相关研究屡见 报 道 4 。 近些年来 ， 人们对关节炎的发病基质以及治疗策略和方法已 有很深入的研究 ， 对于不同非甾体抗炎药 5 、 生物制剂以及激素 等已有了更全面的了解 6 。 植物药在国内关节炎治疗中的应用 比较广泛 ， 无论内服或外治均收到很好的疗效 ， 特别在缓解患者 收稿日期 :

10、2013-12-03; 修订日期 : 2014-05-06 基金项 目 : 国家自然科学基 金 ( No 21271089) ; 黑龙江省卫生厅科研项目 ( 2013 223) 作者简 介 : 宋琳 琳 ( 1982-) ， 女 ( 汉 族 ) ， 黑龙江佳木斯 人 ， 佳木斯大学药学 院讲 师 ， 硕士研究 生 ， 主要从事天然药物研究与开发工 作 * 通讯作者简 介 : 沙 靖 全 ( 1975-) ， 男 ( 汉 族 ) ， 山东威 海 人 ， 佳木斯大学 药 学 院副教 授 ， 博士研究 生 ， 主要从事无机药物化学与 配位药物化学研究工 作 疼痛 、 提高其生存质量方面有其独特的作用

11、 。 但是由于尚缺乏大 样本的随机对照研究 ， 有些植物药是否有抗炎药样作用难以科学 地评价 。 因此 ， 用疗效佳 、 副反应低的中药单成分以及中成药治 疗该病具有重要意义 。 1 材料与仪器 1 1 药 材 余甘子药 材 ， 购自佳木斯金天药 店 ， 经佳木斯 大学 药 学院鉴定为正 品 。 1 2 仪 器 FA2004 电子分析天 平 ( 上海 恒平科学仪器有限 公 司 ) ; 756MC 紫外可见光分光光度计 ( 上海第三分析仪器厂 ) ; E 52A 旋转蒸发仪 ( 上海亚荣生化仪器厂 ) ; DZF 150 型数显小 型恒温真空干燥箱 ( 郑州长城科工贸有限公司 ) ; SHZ 循

12、环水 真空泵 ( 郑州长城科教仪器有限公司 ) ; KQ 520 DE 医用数控超 声波清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公司 ) ; 全自动血沉仪 ( 北京迈 维康公司 ) 。 1 3 试 剂 化学试剂均为分 析 纯 ; 乙醇 ( 哈尔滨新达化工厂 ) ; 水 为蒸馏 水 ; 芦丁 标 准 品 ( 中国药品生物制品检定 所 ) ; 无水乙 醇 ( 天津市凯通化学试剂有限公 司 ) ; 亚 硝酸 钠 ( 天津市瑞金特化学 品有限公 司 ) ; 硝酸 铝 ( 天津市科密欧化学试剂有限公司 ) ; 醋 酸 钾 ( 天津 市 化学试剂二 厂 ) ; 乙 醚 ( 天津市化学试剂二 厂 ) ; 甲 醇 (

13、哈尔滨新达化工 厂 ) ; Freunds 完全佐 剂 ( sigma 公司 ) ; 大鼠细 胞 因 子 TNF 、 IL 6 定量酶联检测试剂 盒 ( 上海酶联生物科技有 限公 司 ) 。 1 4 动 物 SD 大 鼠 40 只 ( 佳木斯大学动物实验中心提 供 ) ， 体 质 LISHIZHEN MEDICINE AND MATE IA MEDICA ESEA CH 2014 VOL 25 NO 11 时珍国医国 药 2014 年 第 25 卷 第 11 期 量 ( 150 20) g， 雌雄各半 。 2 方法 2 1 余甘子总黄酮的制备 2 1 1 样品的制 备 准确称 取 200 00

14、g 余甘子粉 末 ， 用 70% 乙 醇 3 000 ml 在室温下超声提取 30 min， 抽滤后在旋转蒸发仪上浓 缩 ， 水浴干燥至浸膏状 ， 即得余甘子提取液 。 2 1 2 标准曲线的制 备 精密称取干燥至恒重的芦丁标准试剂 10mg， 用无水乙醇在超声波清洗器中使其完全溶解 ， 并完全转入 50 ml 容量瓶 中 ， 用无水乙醇 定 容 ， 摇 匀 ， 得浓度 为 0 2mg / L 芦 丁 标准溶 液 。 分别吸取芦丁标准溶 液 0， 1， 2， 3， 4， 5 ml 于 6 只 25ml 容量瓶 中 ， 加 入 5% ( W / V) 亚硝酸 钠 1 ml， 摇 匀 ， 放 置

15、6 min 后 加 入 10% ( W / V) 硝酸 铝 1 0 ml， 摇 匀 ， 6min 后再加 入 10% ( W / V) 氢 氧 化 钠 10ml， 混 匀 ， 用蒸馏水 定容至 刻 度 ， 静 置 15 min 后 于 500nm 处测定其吸光度 值 ， 得回归方 程 : Y = 2 8734X + 0 0219， 2 = 0 9998。 2 2 大鼠 佐 剂性关节炎模型的建 立 取体质 量 ( 150 20 ) g 的 SD 大 鼠 40 只 ， 正常饲 养 1 周 后 ， 随机分 成 4 组即阴性对照 组 、 模 型组和余甘 子总黄酮 高 、 低剂量 组 ， 每组 各 10

16、 只 。 正常组作 对 3 2 大鼠的一般观 察 大鼠造模后 第 1 天出现右后足原发性肿 胀 ， 造模后 第 7 天左右非致炎足出现继发性肿 胀 ， 第 17 天后继 发 性肿胀趋于稳 定 。 造模后大鼠受累关节明显畸 形 ， 双后足不 能 负 重 ， 并且在后期出现尾根部结 节 ， 为典型多发性关节炎表 现 ， 确 定 造模成 功 。 造模过程中大鼠出现不同程度的体质量减轻 ， 食欲下降 ， 皮 毛无光泽 ， 活动量减少 。 在灌胃给药后大鼠全身症状有明显改 善 ， 体质量增加 ， 食欲增强 ， 皮毛平滑光泽 ， 尾根部结节明显减少 ， 继发性关节肿胀明显减轻 。 3 3 大鼠血清中细胞因

17、 子 TNF 、 IL 6 含量和 局部炎症组 织 PGE2 含量的检 测 结果如 表 1 所 示 ， 与模型组相 比 ， 余甘 子黄 酮 高剂量 组 中 TNF 的含量显著降 低 ， 有 统 计 学 意 义 ( P 0 05) ; 与模型组相 比 ， 余 甘子黄酮 高 、 低剂量组血 清 中 IL 6 含量 显著降 低 ， 有统 计学意 义 ( P 0 05) ; 与模型组相 比 ， 余甘子黄酮 高 、 低 剂 量 组 中 大鼠炎症组织中 的 PGE2 含量均显著降低 ( P 0 01) 。 表 1 余甘子黄酮对大鼠血清中 TNF 、 IL 6 含量和 局部炎症组织 PGE2 含量的影响 (

18、 x珋 s) 照 ， 余甘子总黄酮组按计量灌胃给药 ， 正常组与模型组灌胃生理 盐 水 ， 末次给 药 1h 后余甘子 总黄酮组与模型组大鼠右后足 趾 sc 组 别 注 射弗氏完全佐 剂 0 1ml 致 炎 ， 正常组大鼠右后足 趾 sc 注射 生 理盐 水 。 在致 炎 21d 后进行血清学评 价 。 2 3 余甘子总黄 酮 治疗大鼠佐剂性关节 炎 在致 炎 21d 后对 大 鼠心脏采 血进行继发病的检 测 ， 其 中包 括炎症组织 中 PGE2 含 TNF / pg ml 1 IL 6 / pg ml 1 PGE2 吸光度 量 、 血清中细胞因子含量以及血液常规 、 血液沉降率和类风湿因

19、子的检测等生理生化变化 。 与 模 型 组 比 较 ， * P 0 05， P 0 01; 与正常对照组 比 较 ， # P 0 01 2 4 大鼠局部炎症组 织 PGE2 含量 和血清中细胞因 子 TNF 、 3 4 大鼠红细胞沉降率和类风湿因子的检 测 结果 如 表 2 所 示 ， IL 6 含量的检测 2 4 1 局部炎症组 织 PGE2 含 量的检 测 末次给 药 1h 脱臼处 死 大鼠 后 ， 将致炎 足 自踝关 节以 上 1cm 处剪 下 ， 称 重 ， 用手术剪 刀 剪碎皮肤浸泡 于 2ml 生理盐水浸 泡 48h， 以 1500 r min 1 离 心 10 min 后 ， 吸

20、取上清 液 0 3ml 加 入 0 5mol / L 的 KOH 甲醇溶 液 ， 于 50 水浴箱中水浴异构 化 20min， 加甲醇稀释 至 20 ml 后 ， 置于 波 长 278 nm 处进行测定吸光 度 。 以每克炎症组织相当的吸光 度 值 表 示 PGE2 的含 量 。 2 4 2 血清 中 TNF 、 IL 6 含量的检 测 大鼠血 清中细胞 因 与模型组做比较 ， 余甘子黄酮高剂量组的血沉速率明显降低 ， 有 显著差异 性 ( P 0 05 ) 。 大鼠佐剂性关节炎会使血液沉降速率 升 高 ， 相对于正常的 大 鼠有极显著差异 性 ( P 0 01 ) ， 实验结 果 表 明 ，

21、 余甘子能有效缓 解大鼠的局部炎症反 应 ， 对大鼠血液沉降 速率有抑制升高的作 用 ， 通过淋巴循环进入血液 中 ， 可以对类 风 湿关节炎疾病有效的治 疗 。 余甘子黄酮对大鼠血清中类风湿因子的影响结果如表 2 所 示 ， 对于类风湿因子的检测可以定性检查出动物是否患有类风湿 关节炎疾病 。 正常组 10 只大鼠均没有检测出细胞因子 ， 而模型 子 TNF 、 IL 6 含量的检测方法 ， 采用 ELISA 双抗体夹心法 ， 组的各大鼠均有类风湿因子检测出 ， 余甘子黄酮低 、 高剂量组有 操作步骤按试剂盒说明书进行测定 。 2 4 3 大 鼠红细胞沉降率和类风湿因子的检 测 末次给 药

22、1h 后 ， 在手术台上将大鼠用乙醚麻 醉 ， 然后对大鼠进行心脏采 血 ， 使 用枸橼酸钠作抗凝血 剂 ， 采血 约 2ml 左 右 。 在全自动血沉 仪上 对 大 鼠血液进行红细胞沉降率的检 测 。 同样心脏采血方 式 ， 收 集 大 鼠血液置于 含 有 分 离胶 和 促 凝剂 的 真 空 采 血 器 中 ， 以 1500 r min 1 离 心 10 min 后 ， 收集血 清 ， 采用酶联免 疫吸附法对类风湿 因子进行检 测 。 2 5 统计学 处 理 数据 以 x珋 s 表 示 ， 数据结果采 用 SPSS 11 5 统计软件进行分析 ， 组间比较采用 t 检验 。 3 结果 3 1

23、 供试药总黄酮 的 含 量 余甘子经过超声提取得到咖啡色晶 体状余甘子总黄 酮 5 56g， 通过 芦 丁标准品 回归方程计算得总黄 酮含量 为 59 07% ， 将总黄酮定容 于 200ml 容量瓶 中 ， 配制成每 生 药浓 度 g / ml 供试 药 ， 其黄酮 含量 为 12 88mg / ml， 余甘子 高 、 低 剂 量组分 别 1ml 和 2ml 的供试 品 ， 供灌胃给 药 。 8 和 5 只大鼠检测出含有类风湿因子 。 实验结果表明 ， 大鼠足趾 皮下注射弗式完全佐剂 21d 后 ， 会检测出大鼠血清中含有类风湿 因子 ， 说明该大鼠已经患有类风湿性疾病 ， 余甘子黄酮溶液可

24、以 减低类风湿因子的含量 ， 达到治疗类风湿关节炎疾病的功能 。 表 2 余甘子黄酮对大鼠血液沉降率 和血清中类风湿因子的影响 ( x珋 s) 组别 血沉 ES / mm h 1 类风湿因子 F 正常对照组 4 37 1 90 0 /10 模型组 6 85 2 09 # 10 /10 低剂量组 6 48 2 17 8 /10 高剂量组 5 21 3 15 * 5 /10 与 模 型 组 比 较 ， * P 0 05， P 0 01; 与正常对照组 比 较 ， # P 0 01 4 讨论 类风湿性关节炎的发病机制虽未完全明确 ， 但近年来许多学 者认为细胞因子在关节破坏中起主要作用 ， 其可能通

25、过介导细胞 2581 正常对照 组 模型 组 18 49 4 62 25 65 7 49 # 37 10 4 95 51 15 6 62 # 0 25 0 04 0 38 0 046 # 低剂量 组 高剂量 组 24 15 6 64 18 40 2 47 * 44 35 2 35 39 85 1 05 0 30 0 03 0 30 0 09 时珍国医国 药 2014 年 第 25 卷 第 11 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATE IA MEDICA ESEA CH 2014 VOL 25 NO 11 与细胞之间的相互作用引起组织酶的释放而导致关节损伤 。 本 实验应用弗

26、式完全佐剂制造佐剂性关节炎大鼠模型 ， 细胞因子在 类风湿性关节炎发病的免疫调节中起到中主要的作用 ， 从而抑制 了细胞因子的促炎效应 ， 这可能是该药治疗类风湿性关节炎的机 本实验结果表明 ， 余甘子总黄酮干预类风湿关节炎大鼠的机 制可能是由免疫耐受的主动抑制机制降低大鼠抗原产生的特异 性免疫反应 ， 并通过细胞因子调控网路调节降低 TNF 、 IL 6 水平以及 PGE2 水平 ， 抑制细胞因子的促炎效应加剧来实现的 ， 制之一 。 TNF 、 IL 6 均是类风湿性关节炎的致炎细胞因子 。 该结果将为今后开发和研究余甘子在临床上治疗类风湿性关节 PGE2 能够引起血管扩 张 ， 血管壁通

27、透性升 高 ， 引起 发 热 、 致 痛 ， 以 及 趋化作 用 。 本实验结果显 示 ， 与正常对照组比 较 ， 模型组大 鼠 血清中的细胞因 子 TNF 、 IL 6 含量显著升 高 ( P 0 01 ) ， 说 明类风湿性关节炎 发 病过程中确实存 在 TNF 、 IL 6 过度 分 泌的现 象 ; 与 正 常对照组比 较 ， 模型组大 鼠血清中 的 PGE2 含 量 显著升 高 ( P 0 01) ; 与模型组比 较 ， 余甘子黄酮高剂量组能使 模型组大鼠血清 中 TNF 水平下 降 ， 而余甘子黄酮 高 、 低剂 量 炎提供理论依据 。 参考文献 : 1 国家药典委员会 中 国药典

28、， 一 部 S 北京 : 中国医药科技出版社 ， 2010: 124 2 侯开卫 余甘子化学成分 及 其在民族民间传统医药中的应 用 J 中国民族民间医药杂志 ， 2002， 11( 6) : 345 组 能使模型组大鼠血清 中 IL 6 分泌水平发 生不同程度的下 降 ， 3 Joe B， Wilder L Animal modals of rheumatoid arthritis J Mol Med 同时也使得模型 组 大鼠血清中 的 PGE2 的水平下 调 ( P 0 01 ) ， 这一结果 表 明余甘子总黄酮能 下 调 TNF 、 IL 6 及 PGE2 水 平 。 与模型组 做 比

29、较 ， 余甘子黄酮高剂量组的血沉速率明显降 低 ， 有显著差异 性 ( P 0 05) 。 大鼠佐剂性关节炎会使血液沉降 速率升 高 ， 相对于正常 的大鼠有极显著差异 性 ( P 0 01 ) ， 实 验 结果表 明 ， 余甘子对大 鼠 血液沉降速率有抑制升高的作 用 ， 可 以 对类风湿关节炎疾病有效的治 疗 。 Today， 1999， 5( 8) : 367 4 刘 德鼎 ， 林博川 ， 邢 福 ， 等 非甾体抗炎药治 疗类风湿关节炎及 对 心血管的不良反 应 J 药学实践杂志 ， 2007， 25( 5) : 283 5 栗 占国 ， 张奉春 ， 鲍春德 类风湿关节 炎 ， 第 1

30、版 M 北 京 : 人民 卫 生出版社 ， 2009: 29 6 高鹰等 余甘子的抗炎作用 与毒性实验研 究 J 云南中医中药杂 志 ，1999， 17( 2) : 47 补肾复方对去势大鼠体重及瘦素的影响研究 尹巧芝 1 ， 陆 华 1* ， 李利民 2 ( 1 成都中医药大 学 ， 四 川 成 都 610072; 2 四川省中医药科学 院 ， 四 川 成 都 610041) 摘 要 : 目 的 补肾复方对去势大鼠体 重 及瘦 素 ( LP) 的影 响 。 方 法 将雌性育龄期大鼠随机分为正常 组 、 假手术 组 、 去 势 组 。 去势组将去势成功大鼠随机分为模型 组 、 倍美力 组 、

31、补肾复方 组 。 正 常 组 、 假手术 组 、 模型 组 : 每日生理盐水灌 胃 ; 倍 美 力 组 : 以 62 5 g /100g 倍美力灌 胃 ; 补肾复方 组 : 按成人用量 的 15 倍灌 胃 。 连续给 药 12 周 。 观察一般情 况 ， 特别是 体 重 ; 计 算 Lees 指 数 ; 酶免法检测血 清 LP 水 平 。 结 果 去势手 术 前 ， 假手术 组 、 正 常组及去势组大鼠体重无明显差 异 ( P 0 05) ， 去势手 术 4 周 后 ， 与假手术组和正常组比 较 ， 去势组大鼠体重显著增 加 ( P 0 05) ; 给药 前 ， 与假 手术 组 、 正常组 比

32、 较 ， 模型组大鼠体重明显增 加 ( P 0 05) ， 与模型组比 较 ， 补肾复方组大鼠体重无明显差 异 ( P 0 05) 。 给 药 1 12 周 ， 与 假 手术 组 、 正常组比 较 ， 模型组大鼠体重均明显增 加 ( P 0 05) ; 与模型组比 较 ， 给 药 5 周 前 ， 补肾复 方组大鼠体重无明显 差 异 ( P 0 05) ; 给药 第 5 周 后 ， 补肾复方组大鼠体重 明 显减 少 ( P 0 05) 。 与假手术 组 、 正常组比 较 ， 模型组大 鼠 Lee s 指数及血 清 LP 水平明显增 高 ( P 0 05) ; 与模型组比 较 ， 补肾复方组大 鼠

33、 Lee s 指数及血 清 LP 水平明显降 低 ( P 0 05) 。 结 论 补肾复方可延缓去势大鼠体重增 长 、 降低血 清 LP 水 平 。 关键词 : 补肾复方 ; 去势大鼠 ; 体重 ; 血清 LP DOI 标 识 : doi: 10 3969 / j issn 1008-0805 2014 11 007 中图分类 号 : 285 5 文献标识 码 : A 文章编 号 : 1008-0805( 2014) 11-2582-03 Study of Influence of Bushen Compound on Body Weight and Leptin of Ovariectomi

34、zed ats YIN Qiao-zhi1 ， LU Hua1* ， LI Li-min2 ( 1 Chengdu University of TCM， Chengdu 610072， China; 2 Sichuan Academy of Pharmaceutical Sciences， Chengdu 610041， China) 收稿日期 : 2013-08-17; 修订日期 : 2014-05-20 基金项 目 : 国家自然科学基 金 ( No 30873279) ; 国家重点基础研究发展计 划 ( “973” 计划 ) ( No 2010CB530403) 作 者简 介 : 尹巧 芝 ( 1977-) ， 女 ( 汉 族 ) ， 山西运城 人 ， 成都中医药大学副教授 ， 博士学位 ， 主要从事中医药对女性生殖轴调控的研究工作 * 通 讯作者简 介 : 陆 华 ( 1964-) ， 女 ( 汉 族 ) ， 湖南新化 人 ， 成都中医药大学第二临床医 学 院 / 第二附属医院研究 员 ， 博士学 位 ， 主要从事中医药对女 性 生殖轴调控的研究工 作 2582