光合细菌培养基组成对类胡萝卜素产量的影响电子版本.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。光合细菌培养基组成对类胡萝卜素产量的影响-光合细菌培养基组成对类胡萝卜素产量的影响*摘要:采用响应面法对光合细菌培养基主要成分进行了优化,研究了培养基组成对类胡萝卜素产量的影响。经过逐步回归分析建立了类胡萝卜素产量对培养基主要成分的二次回归模型,其回归方程的决定系数达到了0.958。得到的最适培养基主要组成为:0,81%柠檬酸、0.35%NH4CI和0.18%玉米浆,类胡萝卜素产量最大预测值达到13.34m岁L,是优化前的2.04倍。关键词:光合细菌,培养基,类胡萝卜素,响应面法类胡萝卜素是自然界存在的

2、一类重要色素,目前已知结构的类胡萝卜素近以X)种,其中约有40多种可为人类食用1。FAo和WHo等国际组织认定类胡萝卜素为A类营养色素,并在50多个国家和地区获准作为营养、着色双重功能的添加剂,因而被广泛用于保健食品及化妆品工业。光合细菌(Photo一syniheticbacteria)是生产类胡萝卜素的主要微生物之一,迄今发现可由其合成的类胡萝卜素已超过80种L。利用光合细菌发酵生产天然类胡萝卜素因生产周期短、不受季节限制而备受重视E。色素提取后的菌体中富含蛋白质、氨基酸和维生素等,可作为单细胞蛋白加以利用。光合细菌培养基组成对类胡萝卜素产量的影响目前主要采用单因素研究,而对影响其产量的诸因

3、素交互作用缺乏研究。本文采用响应面法对光合细菌培养基主要成分进行了优化,研究培养基组成对类胡萝卜素产量的影响,以期为深人研究和规模化生产类胡萝卜素提供依据。1材料与方法1.1菌种来源光合细菌:由南京工业大学生物技术中心提供。1.2基础培养基组成苹果酸2.59,酵母膏19,(NH4)25041.259,Mgso40.29,CaC12o.079,Feso40.019,KHZPO40.159,用蒸馏水溶解并定容至IL,pH7.0。1.3培养方法按10%接种量将活化后的液体种子接种于新鲜的液体培养基中,在培养温度为28、光照强度1,sooh(化S一1330照度计测得)和厌氧条件下培养5d。1.4试验设

4、计1.4.1单因素试验:对基础培养基分别进行碳源、氮源和生长因子替代物筛选和水平优化。待筛选的8种碳源分别为乙酸钠、苹果酸、柠檬酸、葡萄糖、乳糖、蔗糖、酒石酸和可溶性淀粉,浓度范围为0.05%一1.50%;待筛选的6种氮源分别为NH4CI,(NH4)2504,NaNoZ,NaNo3,谷氨酸钠和玉米浆,浓度范围为0.05%一2.00%;待筛选的5种生长因子替代物分别为酵母膏、牛肉膏、蛋白豚、胰蛋白陈和玉米浆,浓度范围为0.02%一0.20%。1.4.2响应面试验:根据单因素试验结果,以柠檬酸、NH4CI和玉米浆浓度为3因素,进行中心组合响应面设计,以类胡萝卜素产量为响应指标。通过Designex

5、pert软件对实验数据进行回归分析,预测光合细菌用于生产类胡萝卜素的最佳培养基。试验设计见表7。1.5测定方法1.5.1菌体产量:在Maria等4的基础上加以改进。菌液在10,以刃r/min条件下离心20min,弃去上清夜,菌体用蒸馏水洗涤两次后再次离心。所得菌体在65下烘干至恒重。1.5.2类胡萝卜素产量:在王岁楼等的基础上加以改进。菌体加人浓度为3moFL的盐酸,28下振荡1.sh后沸水浴4min,迅速冷却,10,(兀旧r/min离心20min弃上清液,沉淀用双蒸水洗涤2遍。在所得菌体中加人丙酮,28水浴振荡浸提30min,10,以洲r/min冷冻离心20min,取上清液。适当稀释类胡萝卜

6、素提取液,于480nm处测定吸光值。按以下公式计算类胡萝卜素产量。类胡萝卜素产量(m岁L)=ADvl/0.16vZ式中:A一一一480nm处吸光值;D稀释倍数;0.16类胡萝卜素消光系数;Vl加人的提取剂体积;VZ用于提取色素的发酵液体积。2结果与分析2.1碳源筛选及水平优化2.1.1碳源筛选:当培养基分别以苹果酸或柠檬酸为碳源时,菌体产量和类胡萝卜素产量最大,两者之间无显著差异(表l)。这是因为光合细菌对有机酸及其盐类的利用程度要高于糖类物质。由于苹果酸价格是柠檬酸的4一5倍,生产上宜用柠檬酸作为碳源。2以拓年33(3)微生物学通报表1碳源对菌体产t和类胡萝卜素产t的影响指标源(%)乙酸钠柠

7、檬酸碳酒石酸乳糖蔗糖菌体产量(岁L)类胡萝卜素产量(m岁L)1.171士0.160曲4.05士0.25e苹果酸1.250士01!X)a6.52士0.35a1.042士0.061ab0.791士0.Zlled6.31土0.19a4.28士0.Zle葡萄糖0.312土0.052f0.62士0.ole0.671士0.121de0.421士0,121ef可溶性淀粉0.921士0.(涎iZbC1.75士0.17d0.63土0.02e4.75士0.23b注:碳源浓度均为0.25%;不同字母表示处理间在0.05水平上差异显著2.1.2柠檬酸水平优化:培养基中柠檬酸在0.05%一1.50%浓度范围内时,光合细

8、菌菌体产量和类胡萝卜素产量最高时的柠檬酸浓度为0.6%一0.8%(表2)。柠檬酸浓度过低时造成碳源供应不足,浓度过高时则表现出明显的抑制作用。表2柠檬酸浓度对菌体产t和类胡萝卜素产最的影响柠檬酸(%)指标0.050.150.250.400.以)0.801.X)1.50菌体产量0.540.631.211.882.502.712.421.25(岁L)土0.07d士0.(X)d土0.07e土0.(X)b土0.12a士0.07a土0.51a士0.25e类胡萝卜素产量1.172.133.857.108.989.105.751.80(m盯L)士0.43f士0.58e土0.32d士0,37b士0.62a土0

9、.29a士0.50e士0.23ef2.2氮源筛选及水平优化2.2.1氮源筛选:由表3可知,光合细菌既能利用氨盐和硝酸盐等无机氮源,也能利用氨基酸以及玉米浆等有机氮源,NH4CI为氮源时菌体产量和类胡萝卜素产量均达最大值,分别比(NH4):504为氮源时高出40.00%和57.43%。表3氮源对菌体产t和类胡萝卜素产t的影响氮源(%)指标氯化氨硫酸铁亚硝酸钠硝酸钠谷氨酸钠玉米浆菌体产量2.6251.8750.9171.7501.8751.792(酬L)士0.102a士0.270b士0.Z12e士0.102b士0.102b土0.118b类胡萝卜素产量7.794.952.074.915.785.91

10、(mL)土020a士0.04c土0.15d土0.63e士0.39b土0.43b注:氮源浓度均为0.125%。2.2.2NH4CI水平优化:菌体产量和类胡萝卜素产量均随NH4CI浓度增加呈先上升后下降的趋势,两者达最大时的NH4CI浓度为0.3%(表4)。表4Nlll4CI浓度对菌体产t和类胡萝卜素产t的影响NH4CI(%)指标0.050.100.300.500.701.的1.502.的又功菌体产量(岁L)类胡萝卜素产量(m岁L)1.875土0.153bC2.0以)土0.144ab250153a1.750土0.088ed1.625士0.088ed1.459土0.059de1.375士0.088d

11、el500士0,153de6oo士0.06b6,13士0.05b7.35土0.3la2.19士0.05e2.28士0.05e0.99048士0.13d士0.02e0,47士0.03e2。32。3。1天然复合物筛选及水平优化天然复合物筛选:5种天然复合物均可为光合细菌提供生长因子,其中以酵母l4微生物学通报2(兀巧年33(3)膏和玉米浆的效果最佳(表5),由于玉米浆是玉米深加工过程中的副产物,来源广,价格低,生产上可考虑用它取代酵母膏。表5天然复合物对菌体产t和类胡萝卜素产t的影响天然复合物(%)指标酵母膏牛肉膏蛋白脉胰蛋白膝玉米浆菌体产量(L)2.4(X)土0173a2.417士0.144a1

12、.8(X)土0.087b2.083士0.144b2.5(X)土0.250a类胡萝卜素产量(mL)10.肠土0.15a8.97士0.08b7.52士0.03e6.56土o.10d9.94士0.05a注:天然复合物浓度均为0.1%2.3.2玉米浆水平优化:培养基玉米浆浓度为0.02%一0.20%时,光合细菌以在含0.10%玉米浆培养基中培养时所得的菌体产量和类胡萝卜素产量最大(表6)。表玉米桨浓度对菌体产t和类胡萝卜素产t的影响玉米浆浓度(%)指标0.020.(HO(巧0.100.20菌体产量(留L)2.307士0.080b2.333土0.103b2.350士0.108b2.750土0.2以a2.

13、5仪)士0.204ab类胡萝卜素产量(m岁L)10.33士009e10.19士0.04e10.30土0.24e11.86士olxa11.11士o.llb2.4类胡萝卜素产t响应面优化固定培养基中的无机盐组成,对柠檬酸(A)、NH4CI(B)和玉米浆(C)浓度进行3因素5水平响应面分析试验,结果见表7。表7响应面分析方案与实验结果试验号柠檬酸(%)抓化按(%)玉米浆(%)类胡萝卜素产量(m群L)实际值预测值063l一l(0.2)1(l)一1(0,I)一l(0.02)一1(05)l2.582.272.853.952.63门.8)l3.5611.564.639.753.003.2910.295.18

14、一l,5(0)1.68(1.27)0(0.6)0O00000000(0.3)0一1.5(0)68(0.64)000000000(l)1oo2.695.259.7568(0).23)7.8112.6311.2511.7511.2510.640.442.997.278.007.4412.6911.5011.5011.8811.5011.5011.5011.5011.5011.50n曰000,户0000002423567981011121314巧16171918202仪拓年33(3)微生物学通报类胡萝卜素产量方差分析表明(表8),对类胡萝卜素产量所建立的回归模型极显著(尸0,01),柠檬酸和玉米浆浓

15、度对菌体产量均有显著影响,且两者之间交互作用显著,而柠檬酸和NH4CI浓度之间,以及NH4CI和玉米浆浓度之间的交互作用不显著。以类胡萝卜素产量为响应指标,利用DesignExPert软件对表7进行二次多元回归拟合,得到类胡萝卜素产量对编码自变量A、B和C的二次多项回归方程。Y=11.50+l,51.A+0.51.B+2.17.C一91今AZ一1.54.B2刁.87中CZ刁.38.A.B+1.60.A,C+0.051.B.C回归诊断表明,决定系数(矿)=0.958,信噪比(Adequatep,ision)二14.81。这表明方程的拟合度和可信度均很高,可用于预测类胡萝卜素产量。表8类胡萝卜素产

16、,回归模型方差分析变异来源平方和315.9829.533.3555.26自由度F值/25.6721.592.4540.41138.0121.45P值模型A均方35.1129.533.350.砚兀旧0.仪洲拍BCA2B2以ABACBC残差总变异0.1488188.7429.34llllll101955.26188.7429347.721.1820570.021.370.侧洲)0.砚洲洲)0.1刀的0.03890.373920.5715.040.020.0030.903413.68329.66尺2=0.955,Adju习ted尺2二0.921,Adequateprecision二14.81由图1可

17、知,在玉米浆浓度为1%时,柠檬酸和NH4CI浓度之间交互作用不显著;随着柠檬酸和NH4CI浓度的增大,类胡萝卜素产量均呈现先上升后下降的趋势。这表明,适当增加培养基的柠檬酸和NH4CI含量有利于提高类胡萝卜素产量。微生物学通报2(X拓年33(3)柠檬酸和玉米浆浓度之间的交互作用极显著,当玉米浆浓度较低时,适当提高柠檬酸浓度可大幅提高类胡萝卜素产量,而当柠檬酸浓度达最佳水平后,玉米浆浓度的增加仍有利于增加类胡萝卜素产量(图2)。图2柠檬酸和玉米浆浓度对类胡萝卜素产量的影响当玉米浆浓度较低时,NH4CI浓度对类胡萝卜素产量影响不大;当玉米浆浓度大于0.巧%时,类胡萝卜素产量随NH4CI浓度增加呈先

18、上升后下降的趋势。当NH。Cl浓度不变时,类胡萝卜素产量随玉米浆浓度增加而增加(图3)。图3NH4cl和玉米浆浓度对类胡萝卜素产量的影响通对类胡萝卜素产量的二次多项数学模型解逆矩阵,得出柠檬酸0.81%、NH4CI0.35%和玉米浆0.18%时,类胡萝卜素产量达到最大值13.34m岁L,比优化前的6.52m岁L(表l)提高了103,66%。2.5验证性试验验证性试验结果表明,在响应面优化的水平范围内,类胡萝卜素产量实际值和预测值拟合程度较好(表9),因此运用响应面试验设计所得到的类胡萝卜素产量方程具有很强的预测性,对实践生产具有指导意义。2该洲j6年33(3)微生物学通报表9验证试验结果处理类

19、胡萝卜素产量(m岁L)柠檬酸(%)氯化钱(%)玉米浆(%)0.60.60.10.3实际值10.7512.38预测值12.773讨论苹果酸和柠檬酸等有机酸可直接参与光合细菌体内的三梭酸循环,因而苹果酸和柠檬酸等碳源比较适于光合细菌生长,这有利于类胡萝卜素产量的快速增加,但有机酸浓度过高时,发酵液形成的高渗透压对光合细菌细胞产生胁迫作用,抑制某些酶的活性J。光合细菌能利用的氮源种类很多,本研究结果表明以NH4CI为氮源,并且浓度为0.35%时,光合细菌的类胡萝卜素产量最高。NHCl可阻抑光合细菌的产氢过程,有利于获得较多菌体,从而提高类胡萝卜素产量,这与Mari。等风“的研究结果相符。但NHCl浓

20、度过高会使培养液形成高渗透压,影响光合细菌正常生理代谢。培养基中玉米浆含量适当时,可增加类胡萝卜素产量,这与王永生等报道的玉米浆可促进三抱布拉氏霉菌合成类胡萝卜素的结论一致。玉米浆除了能为光合细菌提供足够的生长因子和微量元素外,还能提供丰富的有机碳源和氮源。此外,玉米浆中的玉米黄素自身就是类胡萝卜素之一,培养过程中玉米黄素可转化成类胡萝卜素的前体物质,从而促进胞内类胡萝卜素的合成。随着科学技术的发展,食用合成色素因其对人体健康的危害而将逐渐被淘汰。FDA已开始阻止使用并宣布最终将完全禁止使用合成红色色素,其他国家也纷纷禁用相应的合成色素。利用光合细菌发酵得到的类胡萝卜素既是天然色素,又具有一定

21、营养价值。因此,采用光合细菌发酵法生产类胡萝卜素能有效解决人类对色素的大量需求与其安全性之间的矛盾。参考文献【1仓一华,陆玲,王伟,等,食品科学,2002,23(6):3438,2范永仙,许尧兴.食品与发酵工业,2003,29(7):6974.仁3王岁楼.中国粮油学报,2001,16(5):4347.4B的osaM,J哩e凡JoumalofBioteehnolo罗,2(X)1,85:25一335俞俊棠.生物工艺学,2003,6:101一108.6HarunK,IneiE.IntemationalJournalOfHyd。罗nEnergy,2(X)2,27:1315一1329-【7王永生,王见冬,袁其朋,等.微生物学通报,2003,30(6):4751.8陶俊,张上隆.生物工程学报,2002,15(3):276一281.-