分子生物学实验指导复习课程.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。分子生物学实验指导-分子生物学实验指导（补充讲义）南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心二OO九年十二月目录实验总RNA的提取、定量与RT-PCR1实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定7实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳13附录相关试剂盒说明书19附录相关仪器使用说明书19实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR一、总RNA的提取与定量目的：从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。

2、原理：在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5gRNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶

3、K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收

4、蛋白质。Trizol试剂可用于小量样品（50100mg组织、5106细胞）也适用于大量样品（1g组织、107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northernblot，dotblot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNase处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于westernblotting。核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为2

5、80nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50g/ml，单链DNA和RNA浓度为40g/ml，单链寡核苷酸的含量为33g/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8,RNA为2.0。若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。仪器和主要试剂：1.紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管2.Trizol试剂3.氯仿4.异丙醇5.7

6、5乙醇6.无RNase的水或0.5SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)实验方法：本次实验采用TaKaRa公司的RNAisoPlus试剂（一）RNA提取1.匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1mlTrizol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过Trizol体积10。b.单层培养细胞直接在培养板中加入Trizol裂解细胞，每10cm2面积加1ml，用移液器吸打几次。Trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。Trizol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。c.细胞悬液离心收集细胞，每5-10106动物、植物、酵母细胞或1107细菌细胞加入1

7、mlTrizol，反复吸打。加Trizol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。(注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与Trizol的比例，细胞的数量不能过多。)2.将匀浆样品在室温（15-30）放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。3.可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-810000g离心10min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。4.每使用1mlTrizol加入0.2ml氯仿，

8、剧烈振荡15s，室温放置3min。(注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。)5.2-810000g离心15min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60。6.把水相转移到新管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTrizol加入0.5ml异丙醇，室温放置10min。7.2-810000g离心10min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。8.用75乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1mlTrizol至少加1ml75乙醇。2-8不超

9、过7500g离心5min，弃上清。9.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾5-10min。加入25-200l无RNase的水，-70保存。（二）紫外吸收检测RNA的浓度和纯度21.紫外分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。2.取RNA样品2l，用水稀释50倍，转入分光光度计的石英比色杯中。3.在260nm和280nm分别读出样品OD值。根据260nm时1OD单位的单链RNA=40g/ml和稀释倍数，可以计算出样品RNA的浓度和产量。4.若OD260/OD280小于2，说明可能有DNA片段污染，可以考虑用无RNase的DNase处理样品，若小于1

10、.8，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化RNA。注意事项：1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA是可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加1mlTrizol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10gRNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。2.匀浆后加氯仿之前样品可在-60-70保存至少一个月。RNA沉淀可保存在75%酒精中2-8一个星期以上或-5-20一年以上。3.预期产量：1mg组织或1106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10g，肾3-4g，骨骼肌和脑组织1-

11、1.5g，胎盘1-4g，上皮细胞8-15g，成纤维细胞5-7g。4.蛋白聚糖和多糖污染:沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1mlTrizol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8mol/L柠檬酸钠和1.2mol/LNaCl)混合离心，按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。5.预防RNase污染措施：经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。RNA在Trizol试剂中时不会被RN

12、ase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤4小时，塑料制品可在0.5mol/LNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01v/v，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。RNA的提取常见问题分析问题解析得率低A样品裂解或匀浆处理不彻底BRNA沉淀未完全溶解A260/A2801.65A检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中二、逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-P

13、olymeraseChainReaction，RT-PCR)原理：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。(一)反转录酶的选择1Money鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37。2禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚

14、合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42。3Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。4MMLV反转录酶的RNaseH-突变体：商品名为Superscript和SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。(二)合成cDNA引物的选择1随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长m

15、RNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。2Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3端最靠近的配对引物起始。

16、用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。仪器和主要试剂：1.基因扩增仪(如PEGeneAmpPCRSystem2400或9700)、微量加样枪、凝胶成像系统、灭菌超薄PCR反应管2RNA提取试剂3第一链cDNA合成试剂盒4dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mmol/L5TaqDNA聚合酶实验方法：本次实验采用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKit1.总RNA的提取：见前述内容。2.cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以TAKARA公司提供的PrimeScrip

17、tTM1stStrandcDNASynthesisKit试剂盒为例。（1）在0.2ml微量离心管中，加入以下：总RNA1-5g、dNTP1l、Randomprimer1l、补充适量的DEPCH2O使总体积达10l。轻轻混匀、离心。（2）PCR仪上65加热5min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。（3）然后加入下列试剂的混合物：5PrimeScriptbuffer4l、RNaseinhibator0.5l、RTase1l、RNasefreeH2O4.5l，轻轻混匀，离心.（4）30孵育10min。（5）42孵育60min。（6）于70加热15min以终止反应，将管插入冰中。3PCR：本次

18、实验采用PremixTaqVersion2.0(Loadingdyemix)试剂（1）取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA2l、上游引物（10pmol/L）2l、下游引物（10pmol/L）2l、dNTP(2mmol/L)4l、10PCRbuffer5l、Taq酶（2U/l）1l。（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50l。轻轻混匀，离心。（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G-3-PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。（4）电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观

19、察结果。（5）结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。注意事项：1在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。2为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。3内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G-3-PD（3-磷酸甘油醛脱氢酶）、-Actin（-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。4PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过

20、单独实验来确定。5防止DNA的污染：（1）采用DNA酶处理RNA样品。（2）在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，消除基因和mRNA的共线性。附注：（1）-actin引物序列：sense5-ACCATGGATGATGATATCGCC-3、antisense5-GTGCCAGATTTTCTCCATGTC-3，片段长度264（71-334）；（2）目的基因GAPDH引物序列：sense5ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG3、antisense5CAGGGGTGCTAAGCAGTTGG3，片段长度：480（103-582）。（3）实验材料：HEK293（人胚肾细胞）实验质粒DNA的

21、提取、定量与酶切鉴定目的：采用碱变性法，学习小规模制备质粒DNA的技术；了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理，掌握测定方法；学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒DNA的构型、分子量的大小；学习体外构建或鉴定重组DNA分子时，根据目的基因及载体选择合适的限制性内切酶；学习PCR的基本原理与实验技术，了解引物设计的一般要求。原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲

22、液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50g/ml，单链DNA和RNA浓度为40g/ml，单链寡核苷酸的含量为33g/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8,RNA为2.0。若比值高于1.8说明DNA样品中的RNA

23、尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液，在测定的浓度为590g/ml范围内，该方法较为可靠，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，可作为电泳支持物，适用于分离大小范围在0.2-50kb的DNA片段。DNA分子的迁移率与分子量的对数值成反比关系。观察其迁移距离，与标准DNA片段进行对照，就可获知该样品分子量大小。在质粒抽提过程中，由于各种因素的影响，使质粒DNA呈现超螺旋的共价闭合环状、开环状分子、线状分子三种不同的构型，这三种分子有不同的迁移率。

24、在一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状分子。用荧光染料溴化乙锭（ethidiumbromide,EB）进行检测，溴化乙锭嵌入碱基对之间形成荧光络合物，在紫外线激发下发出红色荧光。限制性内切酶及其它DNA修饰酶是分子生物学在DNA操作时常用的工具，限制性核酸内切酶是应用最多的一类酶，它分为，型，型最常用，通常所用的限制性内切酶多指此型。型限制性内切酶是一类位点特异性酶，识别双链DNA分子上特异的核苷酸序列，一般识别46个核苷酸：EcoR:5-GAATTC-3；BamH：GGAATC；Hind：AAGCTT；Msp:CCGG。不同的限制性内切酶切割双链DNA的方式不同。

25、根据这些特性可以很容易地在体外进行DNA的重组操作。一般典型的限制性内切酶反应是底物DNA在含有Mg2+，Na+的缓冲液（如pH=7.5）中，加入限制性内切酶，在37保温。在适当条件下（包括温度，pH，离子强度），1小时内完全酶解，1gDNA所需限制性内切酶的量，定义为一个活性单位。影响酶切反应的因素有：底物DNA的纯度，反应系统，反应体积，时间和温度。主要仪器：离心机，紫外分光光度计，恒温水浴锅，水平电泳槽，电泳仪，紫外检测仪，凝胶成像系统，基因扩增仪（PCR仪）（一）质粒DNA的提取主要试剂：溶液I：50mmol/L葡萄糖、10mmol/LEDTA、25mmol/LTris-HCl(pH8

26、.0)、2毫克/毫升溶菌酶溶液II：200mmol/LNaOH、1%SDS、溶液III：3mol/LNaAc(pH4.8)溶液、TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl,pH7.5、1mmol/LEDTA实验方法：本次实验采用百泰克公司的质粒小量制备试剂盒(离心柱型)1、将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB液体培养基的10毫升试管里，37振培过夜，1618小时2、转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒3、小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀4、加入溶液I100l，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟5、加入溶液II200l

27、，温和翻转EP管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰上放置5分钟6、加入溶液III150l，将EP管盖紧后来回翻转23次，混匀后冰上放置20分钟7、12000rpm离心15分钟8、将上清转移到另一个EP管中(吸取时不可吸入底部的沉淀)。加入等体积的酚和氯仿：异戊醇各抽提一次9、加入1毫升预冷的无水乙醇和1/10体积NaAc(3mol/L,pH5.2)，盖紧，并翻转EP管数次混匀10置于-20冰箱12小时1115000rpm离心15分钟，去除上清，收集管底白色沉淀1270%乙醇洗涤一次，空气干燥或真空抽干13将沉淀溶于50lTE缓冲液或去离子水，完全溶解后，-20保存14取样5l，在1%的

28、琼脂糖凝胶上电泳，观察DNA条带。（二）紫外吸收检测DNA的浓度和纯度主要试剂：提取的质粒DNA实验方法：1、 分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。2、 取质粒DNA样品2l，用水稀释50倍，转入分光光度计的石英比色杯中。3、 在260nm和280nm分别读出样品OD值。根据260nm时1OD单位的双链DNA=50g/ml和稀释倍数，可以计算出样品DNA的浓度。若OD260/OD280大于1.8，说明仍有RNA，可以考虑用RNA酶处理样品，若小于1.8，说明样品中含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。（三）质粒DNA的双酶切鉴定主要试剂：纯化的质粒DNA

29、(100ng/L)、限制性内切酶(TaKaRa)：HindIII(15U/L),EcoRI(12U/L)、酶的贮存缓冲液：HindIII：EcoRI、10mMTris-HCl10mMTris-HCl、400mMKCl、100mMKCl、0.1mMEDTA0.1mMEDTA、1mMDTT1mMDTT、0.01%BSA0.15%TritonX-100、50%甘油(pH7.5)0.01%BSA、50%甘油(pH7.5)、10Buffer：100mMTris-HCl(pH7.5)、100mMMgCl2、10mMDTT、500mMNaCl、无菌去离子水实验方法：1、在1.5mlEppendorf管中按顺

30、序依次加入下述试剂，混匀后即成酶切反应体系：无菌去离子水:11L、10buffer2L、质粒DNA5L(共500ng)、HindIII(15U/L)1L、EcoRI(12U/L)1L，共20L2、将反应管置37水浴13h3、反应结束后取10L反应产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测并观察结果，酶切产物应为不同大小的两个片段。（四）琼脂糖凝胶电泳主要试剂：提取的质粒DNA，酶切产物5TBE：54gTris;27.5g硼酸;EDTA(0.5mol/L,pH8.0)20ml,加水至1L，用前稀释10倍溴化乙锭（EB）：10mg/ml溶液或其他核酸染料物质溴酚蓝或加样缓冲液（loadingbuffer）实

31、验方法：1、称取1g琼脂糖于100ml0.5TBE中，加热溶解，冷却至65左右再加入终浓度为0.5%-1.0%的EB（或其他核酸染料物质）。2、将电泳胶模置于制胶架中，梳子置于适当位置，将冷却至65左右的琼脂糖溶液慢慢倒在胶模上，厚度约3。静置，待胶凝固后将胶模从制胶架中取出，放入电泳槽内，倒入适量电泳缓冲液（一般液面高出凝胶1），小心拔出梳子。3、将5g提取的质粒DNA样品和酶切产物，分别与溴酚蓝指示剂（或loadingbuffer）混匀，加入凝胶点样孔内，防止产生气泡和样品溢出。4、将电泳槽通电，80V恒压电泳30分钟。5、电泳完毕，关掉电泳仪，小心取出凝胶置于紫外灯下观察结果。6结果分析

32、：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带拍照分析，保存。注意事项：1、防止紫外线对人皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。2、EB是强诱变剂，有致癌性，操作时要带手套，防止污染。所有含有EB的溶液在弃置前应当进行净化处理。附注一：实验所用的相关材料信息备选一1质粒DNA提取所用菌液样品（1）宿主菌：DH5；（2）载体：pET-28a(+)；（3）插入片段基因：泛素化基因FBOX（1.6Kb）。2质粒DNA酶切鉴定（1）所用的限制性内切酶：EcoRI和HindIII；（2）酶切产物：插入片段（1500bp）及载体（3800bp）。备选二1质粒DNA提取所用菌液样品（1）宿主菌：DH5；（2）载体：

33、pMD18-T；（3）插入片段基因：抑癌基因CHD5启动子区的一段区域（400bp）。2质粒DNA酶切鉴定（1）所用的限制性内切酶：EcoRI和HindIII；（2）酶切产物：插入片段（400bp）及载体（2.7kb）。附注二：质粒图谱1.pET-28a(+)载体2.pMD18-T载体附注三：质粒提取试剂盒说明书见附录实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳目的：掌握SDS-PAGE的基本原理，学会使用该方法来分析所表达的蛋白质，蛋白质大小、形状和所带电荷不同，在SDS-PAGE中的迁移率就不同，因此可采用该方法来推算所表达的蛋白质的分子量。原理：聚丙烯酰胺，即丙烯酰胺和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺，在催化剂

34、过硫酸铵作用下聚合形成凝胶。反应液中还加有四甲基乙二胺用来引发和控制聚合反应。反应液顶覆盖一层水层，保证凝胶表面平坦，同时起到隔离大气中氧气的作用，因为氧气可抑制聚合反应。在蛋白质溶液中加入SDS，这种阴离子去污剂能够与蛋白质相结合，破坏蛋白质内部、分子之间以及其他物质的非共价键，使蛋白质变性而破坏原有的空间构象。按照1.4gSDS/1g蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。由于SDS带负电，使各种蛋白质的SDS-多肽复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类的蛋白质原有的电荷差别；同时，不同蛋白质的SDS复合物形状也相似，都呈长椭圆形。因此，在自

35、由电泳时，它们的泳动率基本相同，而在某一适宜浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳介质中电泳时，由于凝胶的分子筛作用，电泳迁移率就取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋白质分子量的大小。SDSPAGE可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH和凝胶孔径等所组成。1样品的浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(TrisGly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(TrisHCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(TrisHCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的HCl几乎全部

36、解离成Cl-，两槽中的Gly(pI6.0，pKa=9.7)只有很少部分解离成Gly的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1-速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，Gly负离子最慢(尾随离子)。由于C1-很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。2分子筛效应蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其pH升高(电泳进行时常超过9.0)，使Gly解离成负离子的效应增加

37、；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。此两项变化，使Gly的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中，按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。根据经验得知，当蛋白质分子量在11.7-165KD之间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数成线性关系，符合直线方程式；lgMW=-bX+K（MW为蛋白质的分子量，X为蛋白质-SDS复合物电泳的相对迁移率，K和b均为常数），将已知分

38、子量的标准蛋白质在SDS-PAGE中电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。仪器与主要试剂：1.主要器材：电泳仪、垂直电泳仪、进样器、镊子、注射器、烧杯、旋涡器、离心机2.主要试剂：（1）低分子量标准蛋白质液10l；（2）菌体培养液一支1.5ml；宿主菌：BL21；经IPTG诱导表达的蛋白：F-box蛋白（泛素相关蛋白），分子量略小于50KD。（3）2蛋白质样品缓冲液，组成如下：Tris0.15g、-巯基乙醇1.0ml、溴酚蓝0.02g、甘油2.0ml、SDS0.4g、蒸馏水7.0ml。3.试剂配制：

39、30%丙烯酰胺称29g丙烯酰胺，1g甲叉丙烯酰胺，溶于蒸馏水并定容至100ml，滤纸过滤后置棕色玻璃瓶内室温保存10%过硫酸铵1g过硫酸铵溶于蒸馏水定容至10mlTEMEDN，N，N，N-四甲基乙二胺，棕色瓶保存上胶缓冲液Tris12.1g，SDS0.4g溶于60ml蒸馏水，用盐酸调pH6.8，定容至100ml下胶缓冲液Tris12.1g，SDS0.4g溶于60ml蒸馏水，用盐酸调pH8.8，定容至100ml1甘氨酸电泳缓冲液25mmol/LTris（3.02g），250mmol/L甘氨酸（18.8g），0.1%SDS（1g），加蒸馏水至1000ml染色液0.5g考马斯亮蓝R250，90ml甲

40、醇，20ml冰乙酸，加水至200ml脱色液与染色液成分相似，无考马斯亮蓝R250实验方法：1.安装电泳槽凝胶装置先将二块玻璃板洗干净，干燥，嵌入胶带的凹槽中，装在电极槽上，拧紧外螺丝，使其夹紧（不能过紧以防玻璃破裂），放入制胶架固定，留待灌胶。2.凝胶的制备由冰箱中取出储液平衡到室温后开始配胶，在50ml烧杯内按下列配方(一块胶)配制SDS-PAGE分离胶（下胶）：(此配方建议更改为现行的，与仪器装置配套的数据)SDS-PAGE配方30%丙烯酰胺ml缓冲液mlH2Oml10%过硫酸铵lTEMEDl总体积ml下胶10%3.32.64100410上胶5%0.830.683.450553.灌胶迅速将

41、配好的丙烯酰胺溶液（分离胶）灌入两片玻璃板的间隙中，留出灌注浓缩胶所需的空间（梳子齿长再加1厘米），用细管小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖上一层蒸馏水，防止因氧气扩散进入凝胶而抑制聚合反应。待分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层。再按上表配置5%浓缩胶（上胶）立即混合，在已聚合的分离胶上直接灌注后，立即在上胶溶液中插入干净的梳子，两边平直，小心避免气泡混入，将凝胶垂直放置于室温下10-15min，待浓缩胶凝固后，将梳子小心拔出，然后用水冲洗加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺，用针头把加样槽之间的胶齿弄直，将凝胶装置从制胶架中取出，放入电泳槽盒中，并在电泳槽内加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。4.样

42、品处理（1）待测蛋白质样品处理经37培养过夜的大肠杆菌菌液1.5ml，6000rpm离心10min，弃上清加入TE缓冲液（0.1molTris，10mmol/LEDTA）50l，将菌体再旋涡器悬浮，再加入2样品缓冲液50l混匀，在100水浴中煮沸5min。（2）标准蛋白质样品（蛋白质Marker）的处理将已分装好的10l标准蛋白质样品中加入10l样品缓冲液，混匀，在100水浴中煮沸5min。5.加样待样品冷却后，用微量进样器（或加样枪接上小吸管），吸取1030l样品，按号依次加入样品槽，因样品液内有甘油，可使样品沉降在凝胶面上。6.电泳加样完毕，将上槽（黑色电极）接负极，下槽（红色电极）接正极

43、，打开直流电源，先把电压调至8v/cm（80v），待染料前沿进入分离胶成狭窄带时，将电压提高到12v/cm（120v），电泳1.5-3h后，直到溴酚蓝指示剂迁移到接近凝胶底部时立即停止电泳。7.剥胶从电泳槽上卸下凝胶板，放置在纸巾上，用刮勺（或取胶器）撬开玻璃板。8.染色以及脱色将电泳后的凝胶板轻轻取下，放入染色液中染色，20min1h后，把染色液倒回瓶中，加入脱色液，脱色4-8h，其间更换脱色液3-4次。可将凝胶浸于水中或固定在20%甘油中或抽干，干燥后成胶片保存或拍照。蛋白质分子量计算电泳迁移率的计算：按下列公式计算蛋白质样品的相对迁移率（MR）相对迁移率（MR）=（蛋白质样品移动距离/脱

44、色后胶长）（染色前胶长/指示剂移动距离）根据蛋白质迁移率按上述直线方程式即可计算出蛋白质分子量。注意事项：1.丙烯酰胺时有毒试剂，操作时务必小心，切勿接触皮肤或溅入眼内，操作后注意洗手。2.制胶过程封槽制备分离胶（下胶）快速倒入玻璃夹层，至短玻璃上端约3cm停止用滴管小心快速加入蒸馏水约2ml封胶分离胶凝聚后（约30min），甩干水配制浓缩胶（上胶）快速倒入插梳子浓缩胶凝聚后拔梳子（约20min）电泳槽内灌入1甘氨酸缓冲液800ml把胶柱弄直。3.样品处理及电泳过程0.5ml菌液6000rpm离心10min收集菌体弃上清加50lTE缓冲液菌体悬浮加50l2蛋白样品缓冲液，混匀100水浴煮沸15

45、min冷却后取10-30l上样电泳4-6h（浓缩胶90V约30min1h，分离胶120V约1-2h）倒出电泳缓冲液，用水冲洗电泳槽小心撬开玻璃，剥胶用考马斯亮蓝R250染色20min1h加约200ml脱色液脱色过夜弃去脱色液，用水冲洗凝胶观察结果。附一：低分子量标准蛋白质液的组成蛋白质分子量（Da）兔磷酸化酶B97,200牛血清白蛋白66,409鸡卵清蛋白44,287牛碳酸苷酶29,000胰蛋白酶抑制剂鸡蛋清溶菌酶20,10014,300附二：分离胶（Resolvinggels）和浓缩胶（stackinggels）的常用配方附三：SDS-PAGE电泳常见问题及解答Q：“微笑”（两边翘起中间凹下

46、）形带原因？A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。Q：“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。Q：为什么带出现拖尾现象？A：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。Q：为什么溴酚蓝不能起到指示作用？A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。Q：为什么电泳的条带很粗？A：电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；Q：为什么电泳电压很高而电流却很低呢？A：这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是