基因工程重点说课材料.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。基因工程重点-第一章基因工程的定义：狭义：指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行剪切重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达新的性状。广义：DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。第二章载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件一个理想载体应具备四个条件：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点具有多种单一的核酸内切酶识别切割

2、位点具有合适的筛选标记质粒：是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，也称cccDNA。重要的大肠杆菌质粒载体A、 质粒pBR322质粒pBR322结构：（1）氨苄青霉素抗性基因。3种限制酶单一识别位点。（2）四环素抗性基因（3）DNA复制起点优点：（1）具有较小的分子量。（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。（3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积10003000个拷贝。（4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。B、pUC质粒载体优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数（2）适用于组织化学法检

3、测重组体（3）具有多克隆位点区段质粒DNA的分离纯化碱溶法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁，加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无DNase的RNase去除残余的RNA质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间沸水浴法：用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体;加溶菌酶裂解细菌细胞壁;沸水浴40秒钟;离心，用无菌牙签挑去沉淀物;乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA。质粒DNA纯度底、快速、操作简便各种载体的承

4、载能力：l-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb限制性核酸内切酶的类型及其主要特性特性I型II型III型限制修饰活性双功能的酶限制酶和修饰酶分开双功能酶内切酶的蛋白质结构3种不同亚基单一成分2种亚基限制辅助因子ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点5端至少1000bp位于识别位点上特异性位点3端24-26bp处特异性切割不是（随机）是是基因克隆中无用非常有用用处不大II型限制性核酸内切酶的基本特点1、识别位点的特异性每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由48个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。2、

5、识别序列的对称性靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。同位酶：一部分酶识别相同的序列，但切点不同。同裂酶：识别位点与切割位点均相同来源不同的酶。同尾酶：识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列。影响限制性核酸内切酶活性的因素1底物DNA2内切酶的用量3反应缓冲液(浓度（10）mmol/L)4反应温度，大多数内切酶的最适温度为37DNA连接酶连接的作用机制E(酶)ATPEAMPppiE(酶)NADEAMPNMNEAMPDNADNAAMPEDNA上的3OH对被活化的磷原子进行亲核攻击，形成

6、磷酸二酯键，同时释放出AMP。T4DNA连接酶连接具互补碱基黏性末端和平末端，需ATP辅助因子，活性高，常用。其他工具酶1.Klenow片段酶实际上是大肠杆菌DNA聚合酶IC端的大片段。Klenow片段的主要用途（利用53的聚合酶活性）修补限制性酶消化DNA形成的3隐蔽末端标记DNA片段的末端底物用32PdNTPscDNA克隆中第二链cDNA的合成DNA序列的测定2. 末端转移酶末端转移酶是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。来源小牛胸腺。在人工黏性末端的构建中极有用处。3、 S1核酸酶常用来切平突出的单链末端以及制作S1谱图。T4-DNA聚合酶有5-3聚合活性、5-3外切活性及3-5外切活

7、性。用于修平非平头的cDNA分子以及由某些限制性核酸内切酶水解产生的3突出末端。1个标准单位(U)的任何限制性核酸内切酶的定义为在最佳缓冲体系中，37反应1h完全水解1gpBR322DNA所需的酶量。一个标准的酶切反应设计为：0.1-1.01gDNA5L、10倍的缓冲液2L、酶1L，无菌重蒸水12L，反应总体积为20L。1国标单位(U)的T4-DNA连接酶定义为：在最佳缓冲体系中15、1h内，完全连接1g-DNA的Hind片段所需的酶量。连接反应温度与时间常采用下列几种几组组合：15-2h,12-8h,7过夜。重组率是指在连接反应后，含有外源DNA片段的重组分子数与所投入的载体分子数之比。提高

8、重组率的方法1).提高外源DNA片段与载体的分子比2).载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团3).加装同聚尾末端细菌转化的五个步骤：1、 感受态的形成2、 转化因子的结合3、 转化因子的吸收4、 整合复合物前体的形成转化因子单链DNA的整合受体细胞的选择：限制缺陷型、重组缺陷型、转化亲和型、遗传互补型、感染寄生缺陷型转化的方法：1）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化2）细菌原生质体的转化3）电穿孔转化4）接合转化转化率的定义：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数基于载体遗传标记检测1) 、抗药性筛选法2) 、营养缺陷性筛

9、选法3) 、显色筛选法、噬菌斑筛选法基于克隆片段序列的筛选与鉴定1、 PCR鉴定法2、 菌落原位杂交法（探针的制备、探针的标记）3、 限制性酶切图谱法4、 亚克隆法DNA序列测定法（双脱氧末端终止测序法）目的基因的克隆与基因文库构建A鸟枪法BcDNA法CPCR法D化学合成法第四章大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁

10、多的内毒素启动子的筛选，衡量启动子转录效率的检测系统的报告基因大多选择催化定量反应的酶编码基因或抗生素抗性基因。启动子的可控性利用可控性的启动子调整外源基因的表达时序，即通过启动子活性的定时诱导，将外源基因的转录启动限制在受体细胞生长循环的某一阶段，是克服重组菌不稳定的有效方法。乳糖启动子Plac、色氨酸启动子Ptrp、l噬菌体启动子PlL终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选。位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5UAAGGAGG3，即SD序列1、 提高异源蛋白的稳定性包涵体型异源蛋白的表达在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，

11、它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体。包涵体表达形式的优点：能简化外源基因表达产物的分离操作、能在一定程度上保持表达产物的结构稳定。包涵体的分离主要包括菌体破碎、离心收集、清洗等三大步骤。2、 分泌型异源蛋白的表达优点：目的蛋白稳定性高、目的蛋白易于分离、目的蛋白末端完整缺点：大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多。3、融合型异源蛋白的表达第五章转基因：指在DNA操作过程中整合到动植物受体细胞染色体上的外源基因。转基因动物是指通过基因工程对DNA

12、进行体外操作，添加或删除一个特殊的DNA序列，然后导入早期的胚胎干细胞中，产生遗传结构得以修饰的动物，其改变的同源动物转基因的表达特性1转基因的时空特异性表达2转基因的可控性表达3转基因的共抑制效应当受体细胞染色体上含有转基因的同源伙伴时，转基因与内源性同源基因的表达将同时受到抑制。造成共抑制效应的原因：转基因与同源的内源性基因相互作用，形成某种后成状态而影响两者的表达；转基因与内源基因竞争性结合核基质和核包膜上转录及翻译必需的非扩散元件，导致相互抑制；两者转录出互为反义的RNA结构，使之失活并迅速降解；由于转基因的存在，受体细胞内mRNA大量积累，后者激活某些未知酶系，导致mRNA降解。转基

13、因的动物受体细胞系统：肿瘤细胞系，在培养基中能无限生长的与正常细胞生理特性尽可能接近转基因导入动物体内的方法1、动物细胞物理转化法：(1)磷酸钙共沉淀法(2)电击法(3)脂质体包埋法(4)DNA显微注射法2、动物病毒转染法腺病毒腺病毒载体的特点是：基因组重排率低，外源基因与病毒DNA重组后，能稳定复制几个周期；基因组较易操作；安全性能好，不整合人染色体，不导致恶性肿瘤发生；宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂期要求不严格；外源基因表达水平较高。缺陷是：重组的外源基因不能持久表达，病毒蛋白对体液和T淋巴细胞具有免疫原性。猴肿瘤病毒牛痘病毒逆转录病毒工程胚胎干细胞法多效性胚胎干细胞（ES）：鼠胚胎发

14、育卵泡阶段的细胞能在培养基中体外增殖，当把它们重新输回胚胎胚泡后，仍保留着分化成其他细胞（包括生殖细胞）的能力。ES在体外培养时可承受转基因操作而不影响其分化多效性，外源基因通过同源重组方式特异性整合在ES基因组内的一个非必需位点上，构成工程化胚胎干细胞。基因治疗：用正常基因取代病人细胞中的缺陷基因，达到战胜分子病的目的基因治疗的对象：基因病或分子病患者基因治疗的内容：基因诊断、基因分离、载体构建、基因转移第六章高等植物的遗传学特征1.植物的基本特征2.遗传操作的简易性3.整株植物的再生性1、 4.染色体的多倍体性高等植物的基因转移系统Ti质粒介导的整合转化法Ti质粒的改造(1)、除去T-DN

15、A上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；(2)、除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长(3)、除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；(4)、安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；(5)、安装植物细胞的筛选标记2、 (6)、安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。植物病毒介导的转染法植物细胞的直接转化法物理导入：电穿孔、激光微束、碳化硅纤维化学导入：聚乙二醇、脂质体法、圆球体法生物导入：花粉管通道法4、植物原生质体的再生程序-