分子诊断电子版本.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。分子诊断-顺式调控元件：对基因表达有调控活性的DNA序列（只影响处于同一DNA分子上的基因）。包含启动子、增强子、负调控元件、应答元件和加尾信号等。增强子(enhancer)：启动子上游或下游的一段DNA序列（核心序列常为8-12bp），可以增强启动子发动转录，提高转录效率。内含子：非编码序列称为内含子(Intron)。外显子：结构基因中，编码序列称为外显子(Exon)，表达多肽链部分。终止子Terminator：使RNA聚合酶转录终止的DNA序列。包含一段回文序列、5-AATAAA-3(PolyA)序

2、列及富含GT/T序列。GCCCGC、GCGGGC（倒过来）反式作用因子：一组识别与结合顺式调控元件核心序列，进而调控靶基因转录效率的蛋白质。它由反式作用因子基因编码，通常具有锌指结构、碱性亮氨酸拉链、螺旋-环-螺旋基元等特征，具有DNA结合结构域和转录活化结构域两个重要的结构域。冈崎片段：基因复制时，其DNA双链是逐步解开的，因而导致合成随从链呈非连续的片段，这些一段一段的子代DNA短链被称为冈崎片段。引发体(Primosome)：由解旋酶、引物酶等多种蛋白质组成的蛋白质复合体，结合并能在链模板上移动，可生成RNA短片段引物，引导DNA聚合酶合成冈崎片段。基因组（genome）：是指一个细胞或

3、生物体的一套完整的单倍体遗传物质。基因组学（Genomics）：指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱，核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。操纵子：是指数个功能上相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区以及下游的转录中止信号所构成的基因表达单位，所转录的RNA多为顺反子。重叠基因：共有同一段DNA序列的两个或多个基因。侧翼序列：结构基因的第一个和最后一个外显子的外侧，不被转录的非编码区。基因的调控序列，对基因的有效表达起调控作用，包括：启动子、增强子、终止子等。多基因家族：指由某一祖先基因经过重复复制和变异所产生的一组基因，其核苷酸序列或编码

4、产物的结构具有一定程度的同源性。（每个基因都有自己的启动子，与操纵子不同；功能相近，利于功能发挥。）假基因：pseudogene多基因家族中，具有功能基因相似的基因序列，但不能产生功能性产物的基因。分为两大类：一类保留了相应功能基因的间隔序列，另一类缺少间隔序列，称为加工过的假基因或返座假基因。Alu家族：灵长类动物细胞的主要散在的重复DNA序列。长约300bp，在基因组中重复百万次以上，含有限制性内切酶Alu的识别位点，可被Alu内切酶切割ALU是中度重复序列的一种，具有种特异性，可用于区分不同的哺乳细胞。基因多态性（polymorphism）是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不

5、连续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性（geneticpolymorphism）或基因多态性。翻译(Translation)：以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA，酶和辅助因子的作用，合成多肽的过程全酶holoenzyme(1)由蛋白质组分(即酶蛋白)和非蛋白质组分(一般为辅酶或激活物)组成的一种结合酶。(2)含有表达全部酶活性和调节活性所需的所有亚基的一种全寡聚酶。SNP-单核苷酸多态性：是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入转座子：基因组中存在的不依赖同源性而能移动的独

6、立的DNA序列，称为转座子(transposon)，又可称为转座元件。分为以DNA-DNA方式转座的转座子和反转录转座子。单顺反子（monocistron）：真核基因转录产物为单顺反子，即一个基因编码一条多肽链或RNA链，每个基因转录有各自的调节元件。STR：短串联重复序列（shorttandemrepeat，STR）又称微卫星DNA（microsatelliteDNA），是一类广泛存在于人类基因组中的DNA多态性基因座。它由26碱基对构成核心序列，呈串联重复排列。STR基因位点长度一般在100300bp之间因个体间DNA片断长度或DNA序列差异而成高度多态性，在基因传递过程中遵循孟德尔共显性

7、方式遗传。因其基因片段短、扩增效率高、判型准确等特点。已广泛应用于法医学个体识别和亲子鉴定等领域。断裂基因（splitegene）：指基因编码区域的不连续性，是真核基因的结构特点，即基因的外显子被内含子间隔成不连续、按顺序镶嵌排列在基因的ORF区域（外显子和内含子交替出现，每个内含子具有5-GT-AG-3边界序列）。基因表达的特点、方式、调控(GeneRegulation)基本原理：时间特异性、空间特异性；组成性表达、诱导和阻遏表达阻遏（Repression：基因受环境刺激而表达受到抑制和减弱）、协调表达；调控序列和调控蛋白/因子（转录与翻译水平调控）、多水平调控（真核生物）基因表达相关蛋白：

8、组蛋白、顺式调控元件结合蛋白、聚合酶/蛋白及特异性因子DNA复制的特点：半保留复制；从复制起始点开始；半不连续，双向复制；酶催化的高效生物合成反应；引物引导；忠实复制。复制酶：参与DNA复制的主要是polII和polI，polII一般在polII和polI缺乏的情况下发挥作用。DNApolI:III=400:40:20，但是polIII的比活性超过polI的10倍。RNA引物分子特点：具有3-OH（自由羟基）；由引物酶基于单链DNA为模版合成（由引发体合成）；原核生物中约为1016个核苷酸，真核生物中约为10个核苷酸；与模板DNA碱基配对；能被DNA聚合酶切除（DNA复制开始处的几个核苷酸易出

9、现差错.提高复制准确性）。原核生物和真核生物DNA复制区别：区别原核生物真核生物DNA合成的时期整个细胞生长过程细胞周期的S期复制起点数单个多个RNA引物长度1016核苷酸10个核苷酸冈崎片段长度10002000核苷酸100150核苷酸前导链与后随链的合成聚合酶同时控制聚合酶控制前导链聚合酶控制后随链复制与转录的区别：复制转录模板两股全长DNA链模板链:DNA单链的部分(不对称转录)原料dNTPNTP酶DNA聚合酶(DDDP)RNA聚合酶(DDRP)产物子代DNARNA（mRNA,tRNA,rRNA）配对A-T；G-CA-U；T-A；G-C引物有无原核生物RNA聚合酶全酶：全酶=核心酶(2,)

10、+【：转录因子，识别起始序列；核心酶:(2,),转录延长】。此全酶受利福平抑制（专一结合亚基）。转录过程：1、起始识别(Recognition)：全酶的形成（原核）；酶与模板的结合，寻找起始序列位点。2、转录起始和延伸(Initiation&Extension)（1）起始(initiation)RNA聚合酶结合在转录模板的起始区域DNA双链解开，以一条链为模板，合成第一个磷酸二酯键（2）延长(elongation)转录泡（transcriptionbubble）：在转录延长过程中，由局部打开的DNA双链、RNA聚合酶核心酶及新生成的RNA三者结合在一起的复合体，为空泡状结构，又称转录复合物。电

11、镜下原核生物:转录现象：转录未完成，翻译已开始进行。3、终止(termination)(一)原核生物的转录终止1.依赖因子的转录终止用T4噬菌体DNA在试管内进行转录实验，转录产物比在细胞内转录出的要长。说明：转录终止信号是可以跨越的；细胞内某些因素有执行转录终止的功能。翻译过程：1)氨基酸活化（氨酰tRNA生成，即tRNA和氨基酸的复合物）。2)肽链合成起始：核糖体亚基与mRNA、Met/fMet-tRNA、起始因子形成复合物，识别起始密码子的过程。3)肽链延伸：根据mRNA密码序列的指导，从N端向C端依次添加氨基酸延伸肽链，直到合成终止的过程，又核蛋白体(核糖体)循环(RibosomalC

12、ycle)，循环一次增加一个氨基酸。4)肽链合成终止：核糖体位出现mRNA终止密码，多肽链合成停止，肽链从肽酰tRNA中(P位)释出，mRNA、核蛋白体大、小亚基等分离，肽链合成终止。病毒、原核、真核基因组特点。病毒：（1）病毒基因组小，结构简单。（2）不同病毒基因组可以是不同结构的核酸。（3）基因组相关基因常从即排列呈现转录单元。（4）病毒基因组的编码序列大于90%。（5）基因有连续和间断的。（6）有基因重叠现象。原核：（1）基因组通常由一条环状DNA分子组成。（2）基因组中只有1个复制起始点。（3）基因操纵子结构。（4）编码序列一般不重叠。（5）基因是连续的，无内含子，转录后不需要剪切。（

13、6）编码区在基因组中所占的比例远远大于真核基因组，但小于病毒基因组。非编码区主要是一些调控序列。（7）基因组中很少有重复序列。（8）细菌基因组中存在有可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子。（9）具有编码同工酶的基因。（10）在DNA分子中具有多种功能的识别区域。、真核:(1)每一种真核生物都有一定的染色体数目。（2）基因组远远大于原核生物基因组，具有许多复制起始点。（3）真核基因都由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子。（4）真核生物含有大量重复序列。（5）真核生物基因组内非编码序列占90%以上。（6）真核基因是断裂基因。（7）功能相关的基因构成各种基因家族。（8）真核生物基

14、因组中叶存在有一些可移动的遗传因素。人类基因组特点。（1）、人类细胞核基因组中编码序列不到2，约含3万左右不同的基因，且有近1/3为多拷贝；（2）、结构基因大多含有插入序列。即大部分基因为断裂基因（interruptedgene）；（3）、外显子(exon)一般不长于800bp，内含子(intron)则在30bp数十kb不等；（4）、mRNA剪接位点（Splicesites）的识别信号：每个外显子和内含子接头区都有一段高度保守序列（consensussequence），即内含子5端大多数是GT（称为donorsite）开始，3端大多数是AG（称为acceptorsite）结束，称为GTAG法则

15、；（5）、尽管拥有相同的一套基因组，不同的分化细胞中所表达的基因也不同，每个细胞只表达一部分基因（6）、转录在细胞核内进行，翻译在细胞质核糖体中进行，二者在时间空间上是分开的。乙肝病毒（HBV）的基因组DNA：是一环状的部分双螺旋结构,其中的2/3为双螺旋结构，1/3为单链，DNA中的两条链不等长。长链的5端与3端无共价连接，而是与一种蛋白质共价相连。长链的5端以250-300对碱基互补结合。长链为负链，短链为正链。短链的长度视病毒而异，一般长约1.6-2.8kb,约为长链的2/3。短链之间的空隙可由病毒颗粒中的DNA聚合酶充填。乙肝病毒是目前已知的感染人类最小的双链DNA病毒。为了能在细胞内

16、独立复制，病毒在很小的基因组中尽量容纳大量的遗传信息。因而HBV的基因组结构显得特别精密浓缩，充分利用其遗传物质。(1)基因芯片(genechip)：又称DNA芯片(DNAchip)或DNA微阵列(DNAmicroarray)，是将cDNA或寡核苷酸按微阵列方式固定在微型载体上制成。(2)蛋白质芯片(proteinchip或proteinmicroarray)：是将蛋白质按微阵列方式固定在微型载体上获得基因芯片技术：将大量核酸探针分子固定于支持物上，标记的样品分子按碱基互补原则与探针进行杂交，通过检测杂交信号分布和强度、进而获取关于样品分子的序列和数量的信息，是高通量研究基因表达、突变等的革命

17、性技术。基因芯片技术原理：将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的待测样品进行杂交，通过检测杂交信号的分布和强度，实现对样品中基因信息的定性和定量分析。步骤：1芯片制备:包括固相基片的表面活化和制备探针微阵列2靶核酸制备（样品提取纯化、扩增和标记）3靶核酸与探针（芯片）杂交4杂交结果的扫描图像分析和数据处理。Pcr定义：聚合酶链式反应，又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。简称PCR。聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法.原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火(复性）-延伸三个基本反

18、应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至4060左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，2

19、3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。用途：(1)扩增各种蛋白的基因：可用于基因重组、蛋白表达、构建cDNA文库，目前所用的基因工程生物产品，绝大多数为通过PCR方法而获得的目的基因。(2)PCR后的测序：可以很快地测出常规的PCR产物或单链的DNA序列。(3)用于分子进化和种系发育的研究，因为在一些巨大分子的序列中含有足够的进化信息，通过PCR对其编码基因的扩增，并与较近或较远的种系比较，研究其分子进化及种系发育是很有用的。(4)分析和诊断遗传性疾病，根据其基因的缺失或突变对其做出诊断。如甲型血友病、苯丙酮酸尿症、地中海贫血等有特定的遗传性基因，可以做出明确的诊断。(5)对人类HLA基因

20、的多肽性分析，用于器官移植的配型。比原有的免疫学方法要好得多，无论在准确性及特异性，检测的速度等方面都提高了许多。对于某些基因突变，如肿瘤发生的研究等均很有用。sanger双脱氧链终止法测序原理核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5端，以双脱氧碱基为3端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成

21、片段的碱基排列顺序。Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。1.分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记的ddNTP，例如?32PddNTP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5端向3端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3位置没有羟基，故不

22、与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP)，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA3末端都为同一种双脱氧碱基。5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。感染性疾病基因诊断策略（1）一般性检出策略：只检测病原微生物的DNA/RNA，以判断有无以及是何种病原体的入侵（2）完整性检出策略：不仅要判断出是何种病原感染，并且还

23、要区分出携带者与病人，以及对病原体进行分类、分型（亚型）和耐药性鉴定是对感染性疾病的全面诊断和分析优点：（1)可弥补血清学检测的缺陷，实现早期诊断（2)尤其适用于不能培养或者生长缓慢的病原微生物（3)通过病原微生物的定量分析监测疾病的动态、疗效及提供可靠的预后信息（4)微生物耐药性的检测（5)细菌分型及流行病学调查（6）尽管如此，它不能取代其它的诊断方法；同时，应该与其它的诊断技术、临床表现等结合应用，才能实现感染性疾病的快速、准确的诊断。常用核酸杂交技术及其检测对象、步骤、优势和缺点。一、SouthernBlot杂交1、对象：DNA。2、步骤：提取组织、细胞的基因组DNA限制性内切酶消化DN

24、A片段电泳分离DNA片段混合物将分开的片段转至固相支持物上预杂交与液相中标记的核酸探针杂交洗膜及杂交信号检测（如放射自显影）。3、优势：简单、快速、灵敏度高、特异性高；缺点：耗时、耗物、操作繁琐、仅用于实验室研究，有一定放射性。二、斑点杂交、狭缝杂交1、对象：DNA和RNA。2、步骤：提取组织、细胞DNA（RNA)变性、点样至膜干燥、固定探针与DNA杂交洗膜、放射自显影结果分析。3、优势：简单、快速，可同时检测多个样品，待测可是RNA或DNA，标本直接点膜、不需电泳和转膜，烘烤固定；缺点：特异性不高，不能鉴别核酸分子量。三、Northernblot-RNA检测技术1、对象：RNA。2、提取组织

25、、细胞RNA电泳转移到NC膜或尼龙膜杂交放射自显影或化学显色结果分析。3、优势：特异性高，可检测目的片段的大小、是否具有可变剪切出现、可允许探针的部分不配对性，杂交过后的膜经过一定的处理除去探针后还可保存很长时间再次杂交使用；缺点：灵敏度较低。四、菌落原位杂交技术1、对象：用于重组DNA时阳性菌落的筛选。2、步骤：菌落平板培养滤膜灭菌后放到细菌平板上菌落粘到滤膜上、裂解细菌、变性DNA预杂交置滤膜入含探针的杂交液中杂交洗膜检测。3、优势：灵敏性高，背底较为清晰；缺点：有一定放射性。五、组织细胞原位杂交1、对象：细胞或组织中的核酸。2、步骤：载片的清洁与处理组织与细胞的固定适当处理样本使细胞通透

26、性增加加入探针（探针进入细胞内与待检测的核酸进行特异性结合，形成杂交体）组织化学或免疫组织化学方法产生可检测的杂交信号相应显微镜下观察分析结果。3、优势：特异性高、灵敏度高，能保持组织和细胞的形态，可确定与探针互补的核酸序列在细胞内的空间位置；缺点：有一定放射性。核酸探针种类及其优势、缺点。一、基因组DNA探针1、优势：一旦构建其重组分子，便随时可通过扩增得到大量探针。制备方便：常克隆于质粒载体中，取之不尽稳定：DNA探针较RNA探针稳定，后者易被RNA酶降解标记方法成熟和多样（同位素/非同位素*缺口平移法/随机引物法等）。2、缺点：真核基因组含有内含子序列；因此，当其用于检测基因表达时，杂交

27、效率低。二、cDNA探针1、优势：无内含子序列，尤其适用于基因表达的检测，目前应用最广。同一。三、RNA探针1、优势：杂交效率高、特异性高。2、缺点：探针不稳定，易被RNase降解。四、寡核苷酸探针1、优势：短:杂交的速度快（较长的探针）制备方便:可以在短时间内大量制备可合成单链探针:避免了自我复性，提高杂交效率合成与标记同时进行适合于放射性和非放射性标记物的标记。2、缺点：灵敏度稍差。探针标记方法的原理及特点。1、缺口平移法：利用大肠杆菌DNA聚合酶同时具有的53核酸外切酶活性和53聚合酶活性，将预先用标记（同位素和非同位素均可）的dNTP掺入到新合成的DNA探针中去；生成的两条链都被均匀标

28、记。特点：双链分子的均匀标记（全段标记），不能够于单链DNA或RNA的标记。2、随机引物法：人工合成的、含有各种可能排列顺序的六核苷酸片段的混合物（46），可以与任何核酸片段杂交，作为聚合酶的引物。特点：能标记双链DNA、单链DNA和RNA探针*所得探针的比活高，适用于多数杂交*与缺口平移法相比，更为简单，产生的探针长度更为均一。3、聚合酶链反应（PCR）标记DNA探针：利用TaqDNA聚合酶和标记的dNTP,以少量的起始模板合成大量、高比活的双链或单链DNA探针。特点：可在12h之内大量合成探针DNA片段，并且探针DNA在合成过程中可得到很好的标记。4、RNA探针的标记：RNA聚合酶体外转录

29、法制备，同时标记。特点：在1h内可合成近10g的RNA，只要在底物中加入适量的放射性或生物素标记的NTP，所合成的RNA便可得到高效标记。5、寡核苷酸链探针的标记：可以通过在寡核苷酸合成时加入特定标记的核苷酸来实现（一边合成一边标记）；也可以通过DNA探针的末端标记法对其3或5末端进行标记。6、DNA探针的末端标记：将标记物导入线性DNA或RNA的5或3端的一类标记法，即只标记DNA探针的一端。特点：可得到全长DNA片段做探针；但比活低，标记不均匀（“点标”），多用于DNA测序，少用于核酸杂交探针的标记。镰刀型贫血分子基因诊断技术：等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（ASO）法检测一对探针（20b

30、p左右），标记后用于杂交检测。1、对象：基因突变部位和性质完全明确的疾病。2、意义：明确有无突变及纯合或杂合突变。3、原理：1）针对突变分别合成2个ASO探针*约20nt*一探针对应突变碱基，突变的部位置于探针中央*另一探针对应正常序列。2）严格控制杂交和洗脱条件：只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号。4、结果判断：1）如果正常和突变探针都可以杂交，说明突变基因是杂合子2）如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子3）如不能与突变序列的探针杂交，但是能够与正常序列探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因4）如与正常探针和已知的突变基因的探针均不能杂交，提示可能为一种新的突变类型

31、。核酸的分离与纯化：目的：保证核酸序列结构完整性，防止降解和结构破坏；剔除其他物质，保证纯度。沉淀方法：加入物与DNA结合，致使DNA结构发生凝缩而沉淀。1、无水乙醇沉淀：优点：对盐类沉淀少，易挥发除去，不影响后实验；缺点：需要量大，低温操作。2、异丙醇沉淀：优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。不需低温长时静置；缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀，但难挥发，最后一般用70乙醇漂洗数次。3、 聚乙二醇（PEG）沉淀：优点：可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段；分子量为6000的PEG，使用浓度与DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需要加入0.5

32、mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2；要除去DNA沉淀中PEG。4、精胺：优点：非有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA；原理：可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。洗涤：70%酒精洗涤。紫外分光光度计法，浓度计算：A260nm=50ug/ml（双链DNA)；A260nm=40ug/ml(/RNA）；A260nm=37ug/ml(单链DNA）；A260nm=33ug/ml（单链寡核苷酸）。质量判断：高质量DNA:OD260/OD280=1.8,OD260/OD2302.0；OD260/OD2801.9RNA污染；OD260/OD2302.0；OD260/OD280

33、2.0被异硫氰酸胍等污染；OD260/OD2302.0小分子及盐存在。质粒的分离方法。1）碱裂解法：高拷贝质粒（如pUC）利用高浓度的NaOH（PH=12.012.6）的条件下，采用强阴离子去污剂SDS使细胞裂解，宿主的DNA染色体缠绕在细胞碎片上形成大的复合物，在高钾盐下沉淀，而质粒DNA悬于上清液中，通过无水乙醇沉淀，70%酒精洗涤。2）煮沸裂解法15Kb：细菌悬浮于预冷的溶液中（10%蔗糖、50mMTris-HCl），经溶菌酶和EDTA作用破坏细胞壁和细胞膜，从而将质粒DNA释放出来。最后采用酚/氯仿萃取分离。启动子：位于结构基因5端转录起始点上游的大约100-200bp范围内，并有若干

34、具有独立功能的DNA序列元件，每个元件约长730bp，序列本身不被转录，是RNA聚合酶特异性识别和结合的一段DNA序列，能控制基因表达（转录）的起始时间和转录程度。TATA框（TATABox）：一段高度保守序列(7bp)，TATAA/TAA/T，位于转录起始点上游2530bp（-3050）。TATA框与转录因子TFII结合，再与RNA聚合酶II形成复合物，从而准确地识别转录起始位置，对转录水平有定量效应。UTR：UntranslatedRegion：5-UTR:翻译起始密码子上游,mRNA翻译起点的鸟嘌呤核苷酸G（甲基化帽CAP）延伸至ATG起始密码子,能被核糖体识别结合，充当滑道的序列（SD

35、序列原核）；3-UTR:编码区末端终止密码子到多聚A末端。基因家族簇集方式A.簇集在同一条染色体上，可同时发挥作用，合成某些蛋白质。如组蛋白基因家族：第7号染色体长臂3区2带到3区6带区域内。B.簇集在不同染色体上，编码功能紧密相关的一组蛋白。真核、原核生物的基因结构、功能。增强子、启动子、内含子/外显子、终止子、UTR、侧翼序列、基因家族、假基因、断裂基因；操纵子、转坐子、重叠基因。基因的概念和特征、分类概念：基因（GeneMendelianFactor），也称为遗传因子，是控制性状的基本遗传单位（突变单位、重组单位和功能单位），是指线性排列在染色体上的，携带有一定遗传信息，具有一定结构，并

36、能进行自我信息复制与传递，控制生物个体性状表现的一段DNA或RNA序列常常称为“染色体基因”。特点：自我复制（半保留复制）、基因决定性状、能够突变（致死和非致死突变）；不同物种，其基因大小不同；原核生物：基因数目少，结构简单、紧凑，常具有操纵子结构，序列利用效率高，易突变，大多为多顺反子；真核生物：基因数目很多，结构复杂，常含重复序列和非编码序列，机制复杂，相对稳定，大多为单顺反子。分类：1、按功能：结构基因、调控基因、转录而不翻译的基因（RNA基因）。2、按重要程度：看家基因、必需基因。3、按拷贝数：单拷贝基因、多拷贝基因。4、按物种：原核基因、病毒基因、真核基因。基因组测序成果、延伸计划1998.10：完成1.8X108bp，占计划的6%（8年多）。2000.6：完成并公布人类基因组工作框架图或草图(90%，2000.6.26克林顿宣布的）；不到2年的时间完成84%，why?；DNA测序新技术的问世和应用，大大加速其步伐。2001.2.16,人类基因组“精细图”完成(99%)。2003.4.14，人类基因组序列图亦称“完成图”（99.99%）；提前绘制成功。延伸计划：读出序列、读懂序列。-