细胞免疫荧光染色.docx

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1、细胞免疫荧光染色a.将待分析的细胞传代，铺在事先放置了细胞爬片的24孔板内，细胞不宜过密，否 那么会影响荧光染色观察单个细胞。5000个/200ul,可以通过加到孔里粗略观察密 度。b.培养一段时间后，待细胞贴壁即可开始细胞免疫染。c. 取上述24孔板，加入500ul含有Ca2+ Mg2+的PBS,置于4c摇床上摇晃3分钟， 洗去培养基和杂质，此步重复2次。（可常温）d.吸取多余的PBS,每孔加入400ul 4%的多聚甲醛用于固定，4c摇床上摇晃30分 钟。e.移去多聚甲醛，继续加入4003的PBS洗去剩余的液体，常温洗3次，每次3分钟。f.用PBS配制成0.1M/L氯化铉溶液，向每孔加入30

2、03,室温培育10分钟,用PBS 洗两次，每次三分钟。g. 0.5% Triton X-100 4孵育30min,在细胞膜上穿孔，便于染色，之后用PBS洗2 次，每次3分钟。h. TBST配制1%BSA 4c封闭1小时。TBST 10X的话，用超纯水稀释。i. 一抗4封闭过夜，移去一抗，TBST洗5次，每次3分钟。j. 二抗4c避光孵育1小时，移去二抗，TBST洗4次，每次3分钟，PBS洗3分钟。k. DAPI核染，4染色4分30秒，TBST洗3次，每次3分钟。储存液配成2003每管，于避光管中，-20保存。工作液为10ug/ml,用超纯水稀释，先配现 用。I.扣片，用蒸储水洗去残留的盐分，并晾干，之后将细胞爬片缓缓从一侧放置在滴有 4ul mounting media的载玻片上（有细胞的一面向下），放在暗处晾干，用指甲油封 住圆形细胞爬片的边缘，风干即可用荧光显微镜拍片。