实验方法总结教学文案.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。实验方法总结-1.叶片叶绿素含量的测定叶片的叶绿素含量参照Arnon（1949）的方法进行测定。称取去脉的水稻叶片0.1g，置于研钵中，加入预冷的80%丙酮、少许石英砂和CaCO3，研磨成浆，6000rpm冷冻离心10min，取上清。沉淀再用80%丙酮洗1次，再次6000rpm冷冻离心10min，将两次离心得到的上清液合并。在上清液中加入80%丙酮定容至10ml，用紫外-可见分光光度计GENESYS10UV（Thermo）测定其在645nm和663nm处的光吸收值，根据下列公式计算叶片的叶绿素含量。叶绿

2、素a含量（mg/L）=12.7A663-2.69A645叶绿素b含量（mg/L）=22.9A645-4.68A663总叶绿素含量（mg/L）=8.02A663+20.21A6452.土壤和叶片相对含水量的测定土壤含水量采用称重法测定，每组测定20盆。叶片组织的水分状况用叶片相对含水量(RWC)表示:RWC=(FW-DW)/(SW-DW)其中FW、DW和SW分别表示叶片鲜重、干重和饱和质量方法：每次取叶片5片，从叶基部剪下，称量鲜重，后迅速将叶片放入清水中浸泡3小时后取出（即叶片重量不再发生变化，完全饱和），擦掉表面水分，称取饱和质量，经10530分钟杀青后，在75下烘到恒重，记录干重，并计算相

3、对含水量。3.酶活性测定：提取酶液，参照钱琼秋等（Qianetal,2006）的方法以缓冲液（0.05mol/LPBS，pH7.8）悬浮叶绿体，用于测定超氧化物歧化酶（SOD）、和过氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）含量、蛋白质含量的测定、抗坏血酸（AsA）。分别取0.5g材料于预冷的研钵中，加入8ml预冷的50mmol-1的磷酸缓冲液（PBS，ph7.8）(先加2ml，在冰浴下研磨成匀浆后，将匀浆倒入10ml的离心管，再用6ml冲洗),10000r/分离心20分钟，取上清液。3.1SOD酶活性的测定SOD酶活性的测定按照Giannopolitis和Ries（1977）的方法进行。3.1.1

4、溶液的配制（1）130mmol/L甲硫氨酸（Met）：称取1.9399gMet用0.05mol/LPBS（pH7.8）溶解，定容至100ml。（2）750mol/LNBT：称取0.06133gNBT用0.05mol/LPBS（pH7.8）溶解，定容至100ml，避光保存。（3）100mol/LEDTA-Na2：称取0.03721gEDTA-Na2用0.05mol/LPBS（pH7.8）溶解，定容至100ml。（4）20mol/L核黄素：称取0.0753g核黄素用蒸馏水溶解，定容至1000ml，避光保存。3.1.2活性的测定取测定管若干，2支设为对照管，按表1加入上述各溶液。摇匀后将1支对照管置

5、于暗处，其他各管于50molm-2s-1光照下反应20min，各管受光情况需一致。反应结束后，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管在560nm的吸光度。SOD活性以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位。表1测定SOD酶活性所需各溶液的用量Table1ThevolumeofdifferentsolutionsduringthemeasurementofSODactivity试剂(Reagents)用量（Volume,ml）终浓度(Finalconcentration)0.05mol/LPBS1.5130mmol/LMet0.313mmol/L750mol/LNBT0.375mol/L1

6、00mol/LEDTA-Na20.310mol/L20mol/L核黄素(lactoflavin)0.32mol/L叶绿体悬浮液(chloroplastsuspension)0.052支对照管以PBS代替悬浮液(PBSinsteadofchloroplastsuspensionin2controltubes)蒸馏水(Distilledwater)0.25总体积(Totalvolume)3.03.1.3活性的计算SOD总活性u/g(FW)=式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。ACK照光对照管的吸光度。AE样品管的吸光度。VT样品液总体积，mL。V1测定时样品用

7、量，mL。W样品鲜重，g。蛋白质含量单位为mg/g。3.2POD酶活性的测定参照Chance&Maehly(1955)的方法，愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性3.2.1溶液的配制（1）0.05mol/LPH5.5的磷酸缓冲液：（2）2%双氧水溶液：（3）0.05mol/L愈创木酚溶液：应该用愈创木酚的分子量乘以摩尔数得到所需愈创木酚的质量，然后溶于95%酒精中。如配制1L0.05mol/L的愈创木酚应称取愈创木酚：124.130.05=6.2065g，然后溶于1L95%酒精中。（4）20%TCA3.2.2活性的测定1.取两支试管，洗涤后甩干水分。试剂管号（对照）测定管0.05mol/LP

8、H5.5的磷酸缓冲液2.9ml2.9ml2%双氧水溶液1.0ml1.0ml0.05mol/L愈创木酚溶液1.0ml1.0ml蒸馏水2.0ml2.0ml总体积7.0ml7.0ml向对照管中加入0.1ml加热煮沸5分钟的酶液，混匀，再向测定管中加入0.1ml酶液，将上述各管立即放入预先调好37的水浴锅中保温5min以上（酶促反应），然后迅速转入冰浴，并加入2ml20%TCA（三氯乙酸）终止反应。对照管在470nm处调零，测定管混匀后进行比色测定，并且立即计时，3分钟时立即读取吸光度。（也可以每分钟读取一次，3分钟内吸光度变化值A）3.2.3活性的计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以A470

9、/ming（鲜重）表示之。也可以用每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（u）表示。按下式计算酶的相对活性A470酶提取液总量（ml）酶活性（A470g1Fwmin1）=样品鲜重（g）测定时酶液用量（ml）3.3丙二醛（MDA）的测定（1）原理丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸(TBA)在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5三甲基恶唑2、4二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织

10、中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100300gg1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3的终浓度为0.5nmolL1

11、。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。（2）材料、仪器设备及试剂1.材料：植物叶片。2.仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管；移液管（1ml、5ml）、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。3.试剂：10三氯乙酸（TCA）；0.6硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。10三氯乙酸（TCA）：TCA10g溶于100ML水里0.6硫代巴比妥酸（TBA）溶液：称取0.6gTBA，先用少量1mol/LNaOH溶解，再用10%TCA定容至100毫升。（3）实验步骤1.丙二醛的提取称取受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片1g，加入少量石英砂和

12、10三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛提取液。2.显色反应及测定取2支干净试管，编号，1支为样品管，各加入提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml0.6硫代巴比妥酸溶液。摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度（A）值。（4）丙二醛含量计算：由于蔗糖TBA反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.4103，MDATBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别是7.4103和155103。532nm非特异性吸光

13、值可以600nm波长处的吸光值代表。按双组分分光光度法原理，建立方程组，解此方程组即可求出MDA及可溶性糖浓度。方程组：A450=（85.4103）C糖（A532A600）=（155103）CMDA+（7.4103）C糖解得：A450C糖=11.71A450（mmolL1）85.4103CMDA=6.45（A532A600）0.56A450-（molL1）公式中：A450在450nm波长下测得的吸光度值A532在532nm波长下测得的吸光度值A600在600nm波长下测得的吸光度值1.55105为摩尔比吸收系数C糖、CMDA分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。按下式计算样品中MDA含量提

14、取液中MDA浓度（molml1）提取液总量（ml）MDA含量（molg1Fw）=植物组织鲜重（g）3.4蛋白质含量的测定(考马斯亮兰G-250染色法)（1）操作1标准曲线的制作及样品蛋白质含量测定按下表加样，每管重复数为2管号0l23456BSA(m1)(标准)样品(ml)DW(m1)考-G250(m1)浓度(g/ml)0-1500.2-0.85200.4-0.65400.6-0.45600.8-0.25801-051000.20.85加入试剂后，使试管中溶液充分混合放置2分钟后，以0号管为空白对照用l0mm厚的比色杯在A595nm下比色。（2）试剂1考马斯亮兰-G250试剂称取100mg考马

15、斯亮兰G-250，溶于50ml95乙醇中，加100ml85的正磷酸，最后加蒸馏水至l升。2蛋白质标准溶液(1)母液，称0.1gBSA(牛血清白蛋白)溶于100mlDW(蒸馏水)中，配成1000g/ml。(2)标准液，取母液10ml，溶于100mlDW中，配成浓度为l00g/ml的标准液。（3）器材与仪器1.10ml试管112.吸管1ml25m113.试管架4.旋涡混合器5.分光光度计6.离心机五、作业1.以A595nm吸光率为纵座标，以标准蛋白质浓度为横座标，绘制标准曲线。2.计算样品蛋白质含量，对照标准曲线求出样液蛋白浓度，换算为mg蛋白/克鲜重。3.5抗坏血酸（AsA）一、原理还原型抗坏血

16、酸（AsA）可以把铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与红菲咯啉（4,7-二苯基-1,10-菲咯啉，BP）反应形成红色螯合物。在534nm波长的吸收值与AsA含量正相关，故可用比色法测定。脱氧抗坏血酸（DAsA）可由二硫苏糖醇（DTT）还原成AsA。测定AsA总量，从中减去还原型AsA，即为DAsA含量。4APX酶活性的测定APX酶活性的测定按照Nakano和Asada（1981）的方法进行。3.2.1反应液的配制：12.5ml0.2mol/LPBS（pH7.0），0.05ml100mmol/LEDTA-Na2，0.25ml100mmol/LASA，10l30%H2O2，摇匀，加入蒸馏水定容至50m

17、l即是测定APX酶活性的反应液。按Nakano和Asada（1981）的方法。0.3g叶片，加入提取液研磨，提取液含50mmolL-1磷酸缓冲液（pH7.0），1mmolL-1抗坏血酸（AsA），1mmolL-1乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA），48000r/min离心20min，上清液定容至3ml。3ml反应混合液中含：50mmolL-1磷酸缓冲液（pH7.0），0.5mmolL-1AsA，0.1mmolL-1H2O2，0.1ml酶液，记录1min内290nm下的光吸收值变化，根据AsA的摩尔消光系数为2.8mM-1cm-1计算酶活性。3

18、.2.2活性的测定：在3ml反应液中加适量的叶绿体悬浮液启动反应，连续记录测定室温下290nm吸收值的变化(30-40s反应，每5s读1次)，因为10-40s内反应初速度呈线性关系，以不加H2O2作为对照。室温下每分钟氧化1molASA的酶量作为一个酶活性单位（吸光系数为2.8mmol/Lcm）。5.H2O2测定6.超氧阴离子测定7.相对电渗漏（REL）和膜脂过氧化（TBARS）测定8.脯氨酸测定在逆境条件下（旱、盐碱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可

19、以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低凝固点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。一、原理用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。（二）仪器设备1.722型分光光度计；2

20、.研钵；3.100ml小烧杯；4.容量瓶；5.大试管；6.普通试管；7.移液管；8.注射器；9.水浴锅；10.漏斗；11.漏斗架；12.滤纸；13剪刀。（三）试剂1. 酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/L磷酸中，搅拌加热（70）溶解，贮于冰箱中。2. 2.3磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。3. 3.冰醋酸。4. 4.甲苯。三、实验步骤1.标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100g。（2）系列脯氨酸浓度的配制

21、取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6g/ml。（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30S，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2m

22、l测定液中脯氨酸的含量（g/2ml）。2.样品的测定（1）脯氨酸的提取准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000rpm下离心5min。（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。四、结果计算根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（Xg/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：单位鲜质量样品的脯氨酸含量（%）式中:X为从标准曲线查处的2mL测定液中脯氨酸的含量（ug/2mL);为提取液体积（mL);为测定是取用的样品体积（mL)；W为样品质量（g)。-